特異性檢測干酪乳桿菌的引物探針設計

陳延寧 侯亞茹 杜麗霞 艾慶蕊 張大虎 侯少陽

摘 要：目的：基于腸桿菌科基因間重復共有序列聚合酶鏈反應（Enterobacterialrepetitive Intergenic Consensus PCR，ERIC-PCR）技術，設計特異性引物探針，實現干酪乳桿菌的靶向檢測。方法：以干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）HP-B1142為研究對象，通過不同實驗，優化干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）的ERIC-PCR反應體系。通過凝膠電泳獲得特定的條帶，對其進行測序和分析，設計出特異性的引物探針，達到對干酪乳桿菌靶向鑒別的目的。結果：通過不同實驗，得到干酪乳桿菌的最佳ERIC-PCR反應體系；基于干酪乳桿菌ERIC基因片段，獲得兩對特異性引物，可在多種DNA的混合溶液中快速靶向鑒別出干酪乳桿菌。結論：基于ERIC-PCR技術獲得的特異性引物探針，可高效、靈敏地實現復雜生境中干酪乳桿菌檢出。

關鍵詞：聚合酶鏈反應；干酪乳桿菌；靶向檢測；引物探針

Abstract： Objective： To design specific primer probes based on ERIC-PCR technology to achieve targeted detection of Lactobacillus casei. Method： Using Lactobacillus casei HP-B1142 as the research object， the ERIC-PCR reaction system of Lactobacillus casei was optimized through different experiments. Specific bands were obtained by gel electrophoresis， sequenced and analyzed， and specific primer probes were designed to achieve the purpose of targeted identification of Lactobacillus casei. Result： Through different experiments， the optimal ERIC-PCR reaction system for Lactobacillus casei was obtained. Based on the ERIC gene fragment of Lactobacillus casei， two pairs of specific primers were obtained， which can quickly target and identify Lactobacillus casei in a mixture of multiple DNA solutions. Conclusion： The specific primer probe obtained based on ERIC-PCR technology can efficiently and sensitively detect Lactobacillus casei in complex habitats.

Keywords： polymerase chain reaction; Lactobacillus casei; targeted detection; primer probes

益生菌（Probiotics）于1907年由梅切尼科夫首次提出。益生菌廣泛存在于人體內，種類多樣，具有促進營養物質吸收、提高機體免疫力等功能。此外，研究發現益生菌用于發酵乳制品能夠有效緩解乳糖不耐受癥狀[1]。此外，益生菌對維持宿主腸道菌群平衡有非常重要的作用[2-3]，同時，益生菌還可用于治療兒童急性腹瀉[4]。干酪乳桿菌屬于乳桿菌屬，為革蘭氏陽性菌，作為益生菌的一種，具有降血壓、降膽固醇、抑制腫瘤生長的功能，同時可以促進細胞分裂，具有增強人體免疫以及預防癌癥等作用[5]。目前針對腸道細菌的鑒定技術主要有生化反應實驗、16S rRNA測序比對和細菌特異性基因檢測、全基因組測序[6]等分子生物學方法[7]。近些年來發展的基質輔助激光解析飛行質譜技術，可以通過檢測菌體蛋白質指紋圖譜達到對不同細菌屬、種的鑒定[8]，同時基于MALDI-TOF的分型方法也在快速發展當中[9]。但是上述方法均存在操作復雜等問題，急需一種簡便、高效的干酪乳桿菌鑒別方法，實現干酪乳桿菌的痕量檢出。

ERIC序列，即腸桿菌基因間重復序列，首先由Sharples等[10]于1990年發現于大腸桿菌，并將其命名為基因間重復單位[11]。腸桿菌科基因間重復共有序列聚合酶鏈反應（Enterobacterialrepetitive Intergenic Consensus PCR，ERIC-PCR）是根據ERIC的核心序列設計引物，PCR擴增兩個ERIC之間序列，不同細菌的ERIC序列在染色體的位置不一樣，因此可以根據擴增條帶位置和數量來判斷是否為同一基因型多位點序列分型[12]，ERIC序列具有高度保守性，因此通過普通PCR方法擴增片段可以獲得DNA指紋圖譜[13]。ERIC-PCR技術在DNA指紋圖譜技術中的廣泛應用使得細菌在亞種層次上的鑒別分類有了更好的依據[14-15]。由于此方法較傳統鑒別方法更為便利，目前被廣泛應用于微生物學中的菌株鑒別分類方面。由于細菌基因組的復雜性，不同的細菌會有不同的反應條件，通過不斷優化反應體系，利用ERIC-PCR技術設計出特異性引物，可在不同的細菌DNA中靶向鑒別出特定的菌株。

本實驗通過利用ERIC-PCR技術設計出特異性引物，首先將目的菌株進行分離純化，再運用改良的SDS堿裂解法提取目的菌株的DNA，通過對比不同反應條件下的結果，對ERIC-PCR反應體系進行優化，再將產物進行凝膠電泳，并將目的片段進行回收測序，得到測序結果后，運用DNAMAN V6軟件進行特異性引物的設計，最終得到特異性引物并進行驗證。本實驗所設計的特異性引物可以在菌株混合基因組DNA中通過PCR技術檢測出干酪乳桿菌，提高了菌種的特異性鑒別效率。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

S1010掌上離心機，美國賽洛捷克；DYY-6C型電泳儀，北京六一生物科技有限公司；YXQ-75G全自動數顯立式高壓蒸汽滅菌器，上海博迅實業有限公司；DHP-9052型電熱恒溫培養箱，上海皓莊儀器有限公司；T100 Thermal PCR儀，美國BIO-RAD公司。

1.2 材料與試劑

瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，康為世紀生物科技有限公司；2K plus Ⅱ DNA marker，北京全式金生物科技有限公司；純凈水，杭州娃哈哈集團有限公司；Tris堿、十二烷基硫酸鈉（Sodium Dodecyl Sulfate，SDS），德國Sigma公司；溴化乙錠（Ethidium Bromide，EB），美國Amresco公司；Taq DNA聚合酶、T5單克隆載體，北京全式金生物技術有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 目的基因DNA的提取純化

將干酪乳桿菌HP-B1142接種至MRS固體培養基，37 ℃培養48 h，獲得純化的目的菌株。目前有許多提取DNA的方法，為了提高實驗效率，本實驗使用改良的SDS堿裂解法，用50 μL含有RNase A酶（10 mg·L-1）的1×TE溶液重懸，于-20 ℃中保存備用。

1.3.2 設計特異性引物探針

使用ERIC-PCR技術對HP-B1142基因組DNA進行PCR，對長度約為2 700 bp和500 bp的兩條DNA片段進行回收，連接至T5載體，送至金唯智生物科技有限公司進行測序。

將得到的兩組測序結果利用BLAST在線比對工具進行比對分析，同時將序列上傳至GenBank數據庫，接收序列號分別為OP700792、OP700793。利用DNAMAN V6軟件設計出對應片段的特異性引物，最后進行引物的特異性檢驗。

1.3.3 引物探針的含量限度檢驗

從實驗室自建微生物資源菌庫中選取5株常用益生菌菌株，分別為植物乳桿菌HP-B1098、鼠李糖乳桿菌HP-B1083、副干酪乳桿菌HP-B1145、嗜酸乳桿菌HP-B1079、瑞士乳桿菌HP-B1126，將其作為陰性對照。取以上5種細菌等濃度的混合DNA溶液，等量混合，使混合基因組DNA濃度與干酪乳桿菌基因組DNA濃度相等。將干酪乳桿菌基因組DNA與5種細菌的混合DNA溶液相混合，配制成干酪乳桿菌基因組DNA相對質量分數為100%（絕對含量900 ng·mL-1）、30%（絕對含量270 ng·mL-1）、3%（絕對含量27 ng·mL-1）、0%（絕對含量0 ng·mL-1）的混合溶液作為模板，使用設計的兩對特異性引物進行PCR反應。

1.3.4 引物的特異性檢驗

為了檢測本實驗中的兩組特異性引物是否可以特異性鑒別干酪乳桿菌，特從實驗室中選取了其他不同的5種細菌進行檢驗。5種細菌分別為植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、副干酪乳桿菌、瑞士乳桿菌。以本實驗所設計的1142-a-F/1142-a-R為一對引物，1142-2-F/1142-2-R為一對引物進行PCR反應。

1.3.5 引物的普適性檢驗

為了確定該引物探針是否可以通用地檢測出干酪乳桿菌這一菌種，現選取干酪乳桿菌的近緣菌株進行普適性檢驗，驗證其通用性。將Lactobacillus casei DSM 20011、Lactobacillus case JCM 8129、Lactobacillus case IDCC 3451、Lactobacillus case JX 20225、Lactobacillus case ATCC 11443共5株近緣干酪乳桿菌作為引物探針普適性檢驗的對照，分別對上述菌株及本實驗所研究的干酪乳桿菌HP-B1142進行PCR，以所設計的1142-a-F/1142-a-R為一對引物，1142-2-F/1142-2-R為一對引物，進行PCR檢測。

1.3.6 運用兩對特異性引物檢驗市售公示配方中含有干酪乳桿菌的產品

通過選取3種市售產品來進行檢驗，可以用來確定本實驗設計的兩對特異性引物是否可以精準檢驗出產品中的干酪乳桿菌，檢測其實用效果。選取3種市售公示配方中含有干酪乳桿菌的產品，提取產品基因組DNA為模板，以所設計的1142-a-F/1142-a-R為一對引物，1142-2-F/1142-2-R為一對引物，進行PCR反應。

2 結果與分析

2.1 DNA測序及特異性引物的設計

以干酪乳桿菌DNA作為模板進行ERIC-PCR操作，獲得長度約為2 000 bp和500 bp的兩條DNA條帶，通過測序獲得其DNA序列，長度分別為1 815 bp和428 bp。使用DNAMAN V6軟件分別設計出針對兩條DNA片段的特異性引物探針。引物探針命名及序列分別為1142-a-F：5'-CTAAGGTAGCTGATCGGTGGCACGATC-3'，1142-a-R：5'-CACTCTTGCCAATGGTCATCGCTG-3'；1142-2-F：5'-CAATCCATCAGTCAGAATGTGGAAGC-3'，1142-2-R：5'-CGAATGCACATGAGGATATCATTTCAGC-3'。同時使用兩對特異性引物以干酪乳桿菌HP-B1142基因組DNA為模板進行PCR，可以得到條帶清晰長度約為400 bp和1 800 bp的目標片段，實驗結果如圖1。

M：2K plus Ⅱ DNA marker；A圖中1以1142-2-F/1142-2-R為引物、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）HP-B1142基因組DNA為模板進行驗證。B圖中1以1142-a-F/1142-a-R為引物、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）HP-B1142基因組DNA為模板進行驗證。

2.2 引物的特異性檢驗

為了確定本特異性引物是否具有特異性，是否能達到特異性鑒別干酪乳桿菌的目的，采用PCR的方式驗證兩對引物探針的特異性。對所得PCR產物進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳驗證，由圖2可知，以干酪乳桿菌基因組DNA為模板的1、2泳道可成功獲得目標條帶，而以其他菌株基因組DNA為模板的泳道均無法得到目標條帶。由此，該特異性引物探針可特異性檢出干酪乳桿菌。

M：2K plus Ⅱ DNA marker；圖中1、3、5、7、9、11皆選用1142-a-F/1142-a-R為引物，所選用模板分別為干酪乳桿菌HP-B1142、植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、副干酪乳桿菌、瑞士乳桿菌基因組DNA。圖中2、4、6、8、10、12皆選用1142-2-F/1142-2-R為引物，所選用模板分別為干酪乳桿菌HP-B1142、植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、副干酪乳桿菌、瑞士乳桿菌基因組DNA。

2.3 引物探針可檢測基因組DNA的含量限度檢驗

為確定本研究所設計的兩對特異性引物探針可檢測的基因組DNA含量限度，以混合DNA溶液為模板進行PCR反應。對所得PCR產物進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳驗證。由圖3中可知，在干酪乳桿菌基因組DNA濃度為27 ng·mL-1時，本實驗的兩對引物探針依然可完成干酪乳桿菌的特異性檢出。

M：2K Plus Ⅱ DNA marker；1～2泳道為干酪乳桿菌含量100%（絕對含量900 ng·mL-1）、3～4泳道為干酪乳桿菌含量30%（絕對含量270 ng·mL-1）、5～6泳道為干酪乳桿菌含量3%（絕對含量27 ng·mL-1）、7～8泳道為干酪乳桿菌含量0%（絕對含量0 ng·mL-1）的溶液。1、3、5、7泳道使用的引物探針是1142-a-F/1142-a-R，2、4、6、8泳道使用的引物探針是1142-2-F/1142-2-R。

2.4 引物探針普適性檢驗

由于干酪乳桿菌作為益生菌被廣泛應用于生產應用和研究中，因此，準確鑒別干酪乳桿菌種及其近緣種也同樣重要。采用本實驗中的兩對引物探針，對與HP-B1142近緣的5株干酪乳桿菌進行PCR驗證，圖4實驗結果表明兩對引物探針均可擴增出目標條帶從而實現近緣干酪乳桿菌檢出。

M：2K Plus Ⅱ DNA marker；1～2、3～4、5～6、7～8、9～10、1～12泳道分別以干酪乳桿菌HP-B1142、DSM 20011、JCM 8129、IDCC 3451、JX 20225、ATCC 11443基因組DNA為模板。1、3、5、7、9、11泳道使用的引物探針是1142-a-F/1142-a-R，2、4、6、8、10、12泳道使用的引物探針是1142-2-F/1142-2-R。

2.5 運用兩對特異性引物檢驗市售公示配方中含有干酪乳桿菌的產品

選取3種市售產品來進行檢驗，可以用來確定本實驗設計的兩對特異性引物是否可以達到精準檢驗產品中的干酪乳桿菌，檢測其實用效果。對所得PCR產物進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳驗證。圖5中泳道均可得到目標條帶，進而判斷市售產品中含有干酪乳桿菌。由此可知，本實驗涉及的兩對特異性引物探針可以用于市售產品中干酪乳桿菌的檢驗，具有廣闊的市場應用前景。

M：2K Plus Ⅱ DNA marker；1～2、3～4、5～6分別以市售混合益生菌產品一、市售混合益生菌產品二及市售益生菌產品三的基因組DNA為模板；1、3、5泳道使用的引物探針是1142-a-F/1142-a-R，2、4、6泳道使用的引物探針是1142-2-F/1142-2-R。

3 結論

ERIC-PCR技術在DNA指紋圖譜技術中的廣泛應用，使得細菌在亞種層次上的鑒別分類有了更好的依據，本實驗通過使用ERIC-PCR技術設計得到的兩對特異性引物，已將引物序列上傳至GenBank數據庫，接收序列號為OP700792、OP700793。獲得兩對引物探針1142-a-F/1142-a-R，1142-2-F/1142-2-R，并驗證其特異性、普適性、含量限度及是否可鑒別市售產品中的干酪乳桿菌，大大增強了該引物探針的實用性及可靠性。上述兩對引物探針可以在微量DNA溶液（絕對含量27 ng·mL-1）中高效實現干酪乳桿菌的痕量檢出，并可在復雜生境中實現市售產品中干酪乳桿菌的特異性檢出。

本實驗設計的兩對特異性引物探針較現有干酪乳桿菌的鑒別方法有了較大優化，克服了現有方法中操作復雜、易被污染的缺點，可簡單、快速檢出復雜生境樣本中干酪乳桿菌；在醫療保健、科研活動等方面有著良好的實用性和廣闊的市場前景。

參考文獻

[1]鐘燕.益生菌與乳糖不耐受研究進展[J].國外醫學（衛生學分冊），2003，30（2）：101-105.

[2]AFRC R F.Probiotics in man and animals[J].Journal of Applied Microbiology，1989，66（5）：365-378.

[3]SALMINEN S，OUWEHAND A，BENNO Y，et al.Probiotics： how should they be defined？[J].Trends in Food Science & Technology，1999，10（3）：107-110.

[4]LAI H H，CHIU C H，KONG M S，et al.Probiotic Lactobacillus casei： effective for managing childhood diarrhea by altering gut microbiota and attenuating fecal inflammatory markers[J].Nutrients，2019，11（5）：1150.

[5]曹瑞博，汪建明.干酪乳桿菌的功能性研究及其應用[J].中國食品添加劑，2009（增刊1）：169-172.

[6]高蕓，軒慧勇，姚曉慧，等.MALDI-TOF質譜技術對豬腸道菌群中攜帶mcr-1細菌的鑒定與聚類分型[J/OL].中國動物傳染病學報：1-10[2023-03-30].http：//kns.cnki.net/kcms/detail/31.2031.S.20210430.1402.024.html.

[7]羅力文，鄢明輝，游春蘋，等.細菌分型方法研究進展[J].中國微生態學雜志，2020，32（7）：836-841.

[8]FENSELAU C， DEMIREV P A.Characterization of intact microorganisms by MALDI mass spectrometry[J].Mass Spectrometry Reviews，2001，20（4）：157-171.

[9]SAUGET M，VALOT B，BERTRAND X，et al.Can MALDI-TOF mass spectrometry reasonably type bacteria？[J].Trends in Microbiology，2017，25（6）：447-455.

[10]SHARPLES G J，LLOYD R G.A novel repeated DNA sequence located in the intergenic regions of bacterial chromosomes[J].Nucleic Acids Research，1990，18（22）：6503.

[11]高衛科，王川慶，吳高鋒，等.ERIC-PCR及在腸道菌群分析中的應用[C]//河南省畜牧獸醫學會第七屆暨2008年學術研討會理事會第二次會議論文集.鄭州：河南省畜牧獸醫學會，2008：580-582.

[12]王方，吳新明，王彥，等.ERIC-PCR技術與MLST技術對30株耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌的基因分型結果觀察[J].山東醫藥，2020，60（30）：35-39.

[13]INTARAPANICH A，KAEWKAMNERD S，SHAW P J，et al.Automatic DNA diagnosis for 1D gel electrophoresis images using bio-image processing technique[J].BMC genomics，2015，16（增12）：15.

[14]HULTON C S J，HIGGINS C F，SHARP P M.ERIC sequences： a novel family of repetitive elements in the genomes of Escherichia coli，Salmonella typhimurium and other enterobacteria[J].Molecular Microbiology，1991，5（4）：825-834.

[15]JUDD A K，SCHNEIDER M，SADOWSKY M J，et al.Use of repetitive sequences and the polymerase chain reaction technique to classify genetically related Bradyrhizobium japonicaum serocluster 123 strains[J].Applied and Environment Microbiology，1993，59（6）：1702-1708.