ATP生物發光技術用于食品接觸表面清潔效果評價的驗證研究

趙嵩

摘 要：ATP生物發光技術是基于螢火蟲發光原理，利用“熒光素酶-熒光素體系”快速檢測三磷酸腺苷（Adenosine Triphosphate，ATP）來判斷衛生狀況，其具有操作簡單、快速、方便的特點，ATP生物發光技術已經被廣泛應用于食品接觸表面清潔效果的評價。本文以某企業選擇ATP衛生監測系統開展的驗證實驗為例，構建ATP驗證方案，包括靈敏度、衰減率、重復性以及實際樣本檢測，可幫助企業科學有效地選擇適合的ATP衛生監測系統。

關鍵詞：生物發光技術；腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）；清潔效果；驗證評價

Abstract： ATP bioluminescence technology is based on the glow principle of firefly luminescence， and uses the “Luciferase luciferin system” to rapidly detect ATP， which is used to judge the health status. It has the characteristics of simple operation， fast and convenient. ATP bioluminescence technology has been widely used to evaluate the cleaning effect of food contact surfaces. This study takes the validation of a certain brand of ATP health monitoring system as an example to build an ATP validation scheme， including sensitivity， decay rate， repeatability， and actual sample testing， which can help enterprises choose an appropriate ATP health monitoring systems more scientifically and effectively.

Keywords： bioluminescence technology; adenosine triphosphate（ATP）; cleaning effect; validation evaluation

腺嘌呤核苷三磷酸（Adenosine Triphosphate，ATP）又稱三磷酸腺苷。ATP是一切生命體能量的直接來源，普遍存在于動植物、細菌、真菌細胞和食物殘渣中，而無生命的碎屑物質中不存在ATP[1]。生物活性物質中的ATP含量是相對恒定的，借助“熒光素-熒光素酶”發光反應可對ATP進行定量測試，從而反映出生物細胞量的殘留。ATP與熒光素反應發出的熒光強度（Relative Light Unit，RLU）與活細胞數量基本呈正比例關系[2]。熒光值越高，表明ATP的量越多，也就意味著表面的殘留物越多，清潔狀態越差。因此，ATP檢測法就被用來快速檢驗物品表面是否潔凈。

RLU值越高代表存在微生物污染風險的可能性越大，但ATP不能替代微生物涂抹檢測，一般ATP的靈敏度可達到10-15 mol ATP標準物質（有的品牌甚至更高），以細菌為例基本也要達到103才能達到ATP的檢測靈敏度[3]。研究表明，只有純微生物培養物而沒有任何食物殘渣的情況下，熒光強度（RLU）和菌落數（Colony-Forming Units，CFU）呈很好的正相關關系[4]。

ATP生物發光技術由于具有操作簡單、快速、方便的特點，能夠簡單快速驗證清潔消毒效果而被廣泛應用于食品、制藥、醫療和養殖等行業。隨著ATP生物發光技術的普及，市場也涌現了大量的ATP衛生監測系統品牌，如3M、海凈納、龜甲萬、天隆、美正、巔峰、綠洲等品牌，其價格和性能差異較大，也造成了用戶選擇的困惑。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

兩個品牌ATP衛生監測系統（包括ATP熒光檢測儀和表面ATP采樣拭子）；Pipet-lite移液槍（美國RAININ公司）；sx500高壓滅菌鍋（日本TOMY公司）；ATP標準品（Merck，貨號：A1852-1VL）、金黃色葡萄球菌（ATCC 6538）、大腸桿菌（ATCC 25922）、啤酒酵母菌（ATCC 10231）。

1.2 使用方法

從2～8 ℃環境中取出ATP表面采樣拭子，放置10～20 min使其恢復至室溫狀態。撕開包裝袋，取出采樣拭子。拔出含有潤濕棉簽的手柄，若涂抹表面，則按Z字形涂抹待測表面10 cm×10 cm的區域；若檢測ATP液體標準品，則將20 μL待測標準品滴加至棉簽上。后將棉簽插回拭子內并按下，使其與底液接觸，將檢測管左右搖晃5～10 s，充分混勻后，插入對應品牌的ATP熒光檢測儀，點擊快速檢測即可。

1.3 標準品驗證方法

1.3.1 靈敏度

靈敏度是驗證一個系統/方法的重要性能指標。先進行陰性值檢測，來確定ATP的本底值。兩種品牌分別取6支拭子，無需取出棉簽，直接按下手柄使棉簽與反應液接觸，按照1.2進行操作。靈敏度驗證方法為取ATP標準品，稀釋多個濃度梯度，取1×10-13 mol和1×10-15 mol兩個濃度，按照1.2進行分別檢測，重復8次。對比不同ATP標準品濃度檢測值與陰性值，與陰性有顯著差異的最低檢測濃度為其靈敏度。

1.3.2 衰減率

ATP反應激發后，其熒光信號會隨時間的延長逐步衰減，考慮到檢測人員在現場檢測的過程中易受外界因素的影響，衰減過快可能會影響檢測結果。衰減率的驗證方法為測定拭子在5 min內的熒光檢測值衰減率，吸取20 μL不同濃度梯度ATP標準品稀釋液，測定兩個品牌的ATP在反應開始后5 min內的熒光衰減率，分別在反應1 min、2 min、3 min、4 min和5 min時進行讀值。

1.3.3 重復性

精密度是保證獲得良好準確度的先決條件，一般情況下，測量精密度不好，就不可能有良好的準確度，而重復性是精密度的一個重要度量方式。取一份高濃度（1×10-13 mol）ATP標準品稀釋液，分別檢測兩個品牌ATP在同一濃度下的重復性，檢測方法參考1.2。同一濃度ATP標準品重復測試10次，計算10次結果的相對標準偏差（Relative Standard Deviation，RSD），重復性用RSD表示。

1.4 實際檢測效果驗證方法

1.4.1 標準菌株檢測

選取較為常見的革蘭氏陽性細菌（大腸埃希氏菌，ATCC 25922）、革蘭氏陰性細菌（金黃色葡萄球菌，ATCC 6538）和真菌（酵母菌，ATCC 10231），分別檢測兩個品牌ATP對不同菌體的檢測靈敏度。

取新鮮菌液，稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4和10-5梯度，從兩個品牌的ATP表面采樣拭子中取出棉簽，用移液槍準確移取20 μL菌液滴于棉簽頭上，等待30 s，然后將棉簽插回檢測管內并按下，使其與底液接觸，將檢測管左右搖晃5～10 s，插入對應的ATP熒光檢測儀，等待30 s，開始檢測。將得到的熒光值與菌落數一一對應。把不同濃度菌液的檢測熒光值與ATP拭子自身陰性值進行對比，有顯著差異的最低濃度即為菌液的檢測靈敏度。

1.4.2 實際表面檢測

對桌面進行清潔消毒后，將桌面劃分為相鄰的20塊10 cm×10 cm的面積，分別用2個品牌的ATP進行檢測，操作方法參照1.2。

2 結果與分析

2.1 靈敏度驗證結果

由表1可知，在標準品濃度為1×10-15 mol的 ATP水平上，兩個品牌ATP仍能檢出RLU值，且結果與陰性有顯著差異；10-15 mol ATP濃度下，品牌一檢測值約是品牌二的1.8倍，陰性值約為1.5倍，倍數關系基本一致，由于在10-15 mol ATP濃度的熒光值與陰性熒光值有較大差異，故二者的檢測靈敏度一致，均為10-16 mol ATP。

2.2 衰減率驗證結果

采用兩個品牌的ATP衛生監測系統檢測不同濃度ATP標準溶液，由表2可知，品牌一在濃度1×10-13 mol反應第5 min時熒光值是最高熒光值的95%；在濃度1×10-15 mol反應第5 min時，熒光值是最高熒光值的97%。品牌二在濃度1×10-13 mol反應第5 min時熒光值是最高熒光值的94%；在濃度1×10-15 mol反應第5 min時，熒光值是最高熒光值的89%。從數據上看，兩個品牌的衰退率都滿足實驗要求（25%以內）[5]，但品牌一的衰減率表現更佳。

2.3 重復性驗證結果

在同濃度ATP水平下，兩個品牌ATP衛生監測系統10次檢測結果的RSD均為9%，偏差值小于15%，均能滿足實驗要求，詳見表3。

2.4 標準菌株驗證結果

采用金黃色葡萄球菌（ATCC6538）、大腸桿菌（ATCC25922）、白色念珠菌（ATCC10231）3種常見菌株，在不同菌株濃度下進行ATP的驗證。結果顯示，兩個品牌的ATP衛生監測系統的檢測值顯示出穩定的倍數關系，具體驗證結果見表4、表5、表6，且隨著菌株濃度的降低，檢測值均呈現較好的梯度關系。菌株在高濃度下，檢測值或存在偏低情況，與低濃度不完全呈線性關系，但影響較小。

2.5 實際表面檢測結果

選取同一桌面的相鄰區域，分別用兩個品牌的ATP表面采樣拭子進行涂抹取樣和檢測，并計算其RSD。從表7結果可以看出，兩個品牌的檢測值及其趨勢表現基本一致。

3 結論

通過上述驗證，兩個品牌的ATP衛生監測系統靈敏度一致，均為1×10-16 mol，在衰減率、重復性測試上表現基本一致，兩個品牌在菌株檢測和實際表面樣品檢測中，檢測結果與線性趨勢基本一致，說明兩個品牌的ATP衛生監測系在菌株裂解效力和檢測靈敏度上有很好的一致性。在實際驗證中，用戶可根據以上驗證方案，選擇重復性和衰減率更佳的品牌，至于靈敏度，可根據用戶對潔凈度要求情況來選擇，此外還需要結合性能和價格綜合考慮，最終篩選出最合適的ATP衛生監測系統。

參考文獻

[1]侯英，吳雪瓊，王興華.ATP生物發光原理及應用研究[J].中國醫藥導報，2010，7（12）：12-13.

[2]張鳳蘭，徐瀟，王海燕，等.ATP生物發光法評價餐飲具的微生物污染研究[J].食品安全質量檢測學報，2016，7（3）：911-916.

[3]丘勒紅，梁俊健，林淑儀，等.ATP生物熒光法在乳品企業清洗效果評價方面的應用[J].中國乳業，2022（10）：72-76.

[4]許慧瓊，王一梅，朱軍生，等.ATP生物熒光法在洗手效果評價中的應用[J].中國消毒學雜志，2018，35（5）：370-372.

[5]董曼曼，衛星華，孫曉，等.手持式ATP熒光檢測儀性能評價[J].食品安全質量檢測學報，2018，9（11）：2627-2630.