氣相色譜法測(cè)定咖啡生豆中硫丹及硫丹硫酸酯殘留

蒲泓君 鄧洪燕 滿紅平

摘 要：建立氣相色譜測(cè)定咖啡中α-硫丹、β-硫丹和硫丹硫酸酯殘留的方法?？Х确勰悠方?jīng)過(guò)乙腈超聲提取，離心后上清液依次經(jīng)安捷倫增強(qiáng)型除脂分散凈化管EMR-Lipd、1.6 g硫酸鎂和0.4 g氯化鈉和弗羅里硅小柱凈化，50 ℃氮吹儀上濃縮至近干，加入1.00 mL正己烷復(fù)溶，用毛細(xì)管柱氣相色譜分離測(cè)定。3種有機(jī)氯農(nóng)藥在0.01～0.50 ?g·mL-1線性相關(guān)性良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.995，檢出限為0.002 2～0.004 4 mg·kg-1，測(cè)定下限為0.01～0.02 mg·kg-1。在0.02～0.10 mg·kg-1的加標(biāo)水平下，3種農(nóng)藥的加標(biāo)回收率為80.1%～94.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.4%～9.1%。因此，該方法前處理對(duì)咖啡油脂的凈化較佳，準(zhǔn)確度和精密度滿足實(shí)驗(yàn)室要求，可用于定性及定量檢測(cè)咖啡中硫丹及其代謝物農(nóng)藥殘留。

關(guān)鍵詞：氣相色譜法；硫丹及其代謝物；咖啡生豆

Abstract： A gas chromatography method for the determination of α-endosulfan， β-endosulfan and endosulfan sulfate residues in coffee was established. The coffee powder samples were ultrasonic extracted by acetonitrile extraction. After centrifugation， the supernatant was purified by Agilent enhanced EMR-Lipd， 1.6 g magnesium sulfate， 0.4 g sodium chloride and Flori silicon column， concentrated to nearly dry on a nitrogen blower at 50 ℃， and 1.00 mL n-hexane was added for resolution. The capillary column was separated by gas chromatography， and the retention time and peak area were qualitatively determined by electron capture detector. The three organochlorine pesticides had good linear correlation in 0.01～0.50 ?g·mL-1， and the correlation coefficients were all greater than 0.995. The limit of detection? was 0.002 2～0.004 4 mg·kg-1， and the limit of quantitation was 0.01～0.02 mg·kg-1. The recoveries ranged from 80.1% to 94.1% and the relative standard deviations ranged from 2.4% to 9.1% at 0.02～0.10 mg·kg-1. Therefore， the method can be used for qualitative and quantitative determination of endosulfan and its metabolites pesticide residues in coffee， and its accuracy and precision meet the laboratory requirements.

Keywords： gas chromatographic method; endosulfan and its metabolites; coffee beans

作為世界三大飲料之一的咖啡，因兼具消食去膩、提神醒腦、促進(jìn)消化和獨(dú)特的保健功能等作用而深受人們的青睞[1]。隨著人們生活水平的提高和咖啡受眾范圍的擴(kuò)大，咖啡的質(zhì)量安全問題也受到了日趨廣泛的關(guān)注。影響咖啡質(zhì)量安全的因素主要有空氣土壤、農(nóng)藥化肥、蟲害、流通加工等[2]，其中農(nóng)藥殘留是人們最為關(guān)注的因素之一。硫丹（Endosulfan，ES），于1956年由赫司特公司開發(fā)[3]，化學(xué)名稱為1，2，3，4，7，7-六氯雙環(huán)[2，2，1]庚烯-（2）-雙羥甲基-5，6-亞硫酸酯，包括α-硫丹和β-硫丹，其代謝物主要為硫丹硫酸酯，該物質(zhì)不易降解且容易轉(zhuǎn)移至環(huán)境中，屬于持久性有機(jī)污染物[4]。硫丹是一種高效廣譜的高毒有機(jī)氯殺蟲劑（Organo Chlorine Pesticides，OCPs）[5]，具有殺蟲速度快、持效期長(zhǎng)、對(duì)天敵和益蟲友好等特點(diǎn)[6]，目前主要在咖啡、煙草和棉花等作物上施用。常規(guī)生產(chǎn)中多采用化學(xué)防治——噴施農(nóng)藥的手段進(jìn)行病蟲害防治，從而致使咖啡中存在農(nóng)藥殘留的可能[7]。研究結(jié)果表明，殺蟲劑硫丹是一種穩(wěn)定的有機(jī)氯化合物，進(jìn)入環(huán)境后降解周期長(zhǎng)，毒性大，具有較高的持久性[8-12]，同時(shí)在水生和陸生生態(tài)系統(tǒng)中具有生物累計(jì)性[13-15]。由于高毒、生物蓄積性、環(huán)境污染的持久性和遠(yuǎn)距離環(huán)境遷移能力，其對(duì)生態(tài)環(huán)境的影響和對(duì)人類生命健康的危害日益引起世界各地區(qū)的廣泛關(guān)注，《斯德哥爾摩公約》明確規(guī)定：禁止在全球范圍制造和使用硫丹及其代謝物農(nóng)藥[16]。因此為防止硫丹及其代謝物在生物及環(huán)境中的殘留對(duì)人類帶來(lái)的危害，建立其檢測(cè)方法具有重要意義。本文主要采用氣相色譜檢測(cè)生咖啡豆中硫丹及其代謝物殘留，通過(guò)系列方法驗(yàn)證手段驗(yàn)證所建立方法對(duì)生咖啡豆基質(zhì)檢測(cè)的可行性，以期為生咖啡豆中硫丹及其代謝物測(cè)定提供準(zhǔn)確的定量方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

α-硫丹、β-硫丹和硫丹硫酸酯：天津阿爾塔科技有限公司；正己烷、丙酮（色譜純）：JT. Baker；乙腈（分析純）：西隴科學(xué)；硫酸鎂、氯化鈉：天津風(fēng)船化學(xué)試劑有限公司；EMR-Lipd除脂分散凈化管：安捷倫科技有限公司；弗羅里硅小柱：博納艾杰爾科技有限公司。

生咖啡豆，市售有機(jī)咖啡，購(gòu)于愛伲莊園，品種為卡蒂姆。

1.2 儀器與設(shè)備

色譜柱（HP-5ms，柱長(zhǎng)30 m，內(nèi)徑0.25 mm，膜厚0.25 μm）：安捷倫科技有限公司；氣相色譜儀（GC-2010Pius，配電子捕獲檢測(cè)器）：日本島津有限公司；分析天平（BT25S）：Sartorius股份公司；渦旋混合器（IKA-MS3）：德國(guó)IKA有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（R-215）：布奇實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司；離心機(jī)（3015）：德國(guó)Sigma公司；氮吹儀：美國(guó)Organomation。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制

分別準(zhǔn)確移取濃度為100 μg·mL-1 α-硫丹、β-硫丹和硫丹硫酸酯1 mL至10 mL比色管中，以正己烷溶解并定容至10 mL配制濃度為10 μg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；移取0.25 mL混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用正己烷溶解并定容至5 mL配制濃度為0.5 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)中間液。分別吸取標(biāo)準(zhǔn)使用液20 μL、40 μL、100 μL、200 μL、400 μL、1 000 μL于已凈化的咖啡生豆基質(zhì)中用正己烷定容至1 mL，渦旋混勻，基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液系列濃度為0.01 μg·mL-1、0.02 μg·mL-1、0.05 μg·mL-1、0.10 μg·mL-1、0.20 μg·mL-1和0.50 μg·mL-1。

1.3.2 儀器條件

檢測(cè)器：電子捕獲檢測(cè)器；載氣：高純氮?dú)?，恒壓模式；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；檢測(cè)器溫度：320 ℃；進(jìn)樣體積：1 μL，不分流；電流保持：1.0 nA。程序升溫：150 ℃保持2 min，以80 ℃·min-1升至210 ℃，以5 ℃·min-1升至250 ℃保持15 min，再以10 ℃·min-1升至300 ℃，保持20 min。

1.3.3 樣品制備

生咖啡豆樣品經(jīng)粉碎機(jī)粉碎，過(guò)0.25 mm篩，篩網(wǎng)上的繼續(xù)粉碎，直至所有的樣品都已過(guò)篩，制備均勻的樣品。

1.3.4 樣品處理

（1）提取。準(zhǔn)確稱取5 g試樣于50 mL離心管中，加入20 mL乙腈，渦旋混勻，放置過(guò)夜，振搖30 min，4 200 r·min-1離心5 min。準(zhǔn)確從離心管中吸取7 mL上清液于15 mL EMR-Lipd除脂分散凈化管中，加入3 mL水，渦旋混勻，4 200 r·min-1離心5 min。將上清液轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，加入1.6 g硫酸鎂和0.4 g氯化鈉，渦旋混勻，4 200 r·min-1離心5 min，吸取5 mL上清液至10 mL試管中，在水浴條件下氮吹凈干，2 mL正己烷溶解待測(cè)定。

（2）凈化。將弗羅里硅小柱放在固定架上，依次用5 mL丙酮+正己烷（10+90）、5 mL正己烷預(yù)淋洗小柱。當(dāng)溶劑液面達(dá)柱吸附層表面時(shí)，立即倒入凈化液，用試管接收洗脫液，用2 mL正己烷沖洗試管后淋洗弗羅里硅小柱，并重復(fù)一次。再加入10 mL丙酮+正己烷（10+90）淋洗弗羅里硅小柱，將淋洗液置于氮吹儀上濃縮至近干，用1.00 mL正己烷定容，裝入樣品瓶中采用氣相色譜檢測(cè)。

1.3.5 樣品測(cè)定

取經(jīng)1.3.4處理的樣品溶液，采用1.3.2儀器條件測(cè)定，通過(guò)保留時(shí)間定性，外標(biāo)法定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理方法優(yōu)化

2.1.1 凈化方法的優(yōu)化

生咖啡豆較其他基質(zhì)樣品含有較高的植物油脂，實(shí)驗(yàn)分別采用艾杰爾C18固相萃取柱、QuEChERS除脂凈化包凈化提取液，最終濃縮凈干時(shí)發(fā)現(xiàn)試管底部仍殘留大量油脂，檢測(cè)時(shí)干擾較強(qiáng)、回收率偏低，且對(duì)設(shè)備造成一定程度的污染。前處理中為有效去除油脂，本實(shí)驗(yàn)采取增強(qiáng)型除脂凈化包結(jié)合弗羅里硅小柱除去提取液中的植物性油脂，實(shí)驗(yàn)證明其除脂效果較為理想，待測(cè)液清亮透明，且目標(biāo)分析物回收率均大于80%。

2.1.2 基質(zhì)效應(yīng)及基質(zhì)標(biāo)線的選擇

標(biāo)準(zhǔn)曲線作為定量分析中的參照，其準(zhǔn)確與否直接影響定量結(jié)果的準(zhǔn)確性，標(biāo)準(zhǔn)曲線的準(zhǔn)確包括濃度的準(zhǔn)確和方法的匹配性，其中標(biāo)準(zhǔn)溶液與方法的匹配性主要由基質(zhì)及前處理造成，目前主要通過(guò)基質(zhì)因子（Matrax Factor，MF）評(píng)價(jià)，基質(zhì)因子的計(jì)算公式為基質(zhì)因子（MF）=基質(zhì)目標(biāo)物存在時(shí)的峰響應(yīng)/基質(zhì)目標(biāo)物不存在時(shí)的峰響應(yīng)。通過(guò)實(shí)驗(yàn)計(jì)算目標(biāo)分析物在0.5 mg·L-1濃度下的基質(zhì)因子，α-硫丹、β-硫丹和硫丹硫酸酯的基質(zhì)因子分別為2.4、3.4和3.6，在該方法中均表現(xiàn)為基質(zhì)增強(qiáng)，為補(bǔ)償基質(zhì)效應(yīng)確保定量的準(zhǔn)確性，實(shí)驗(yàn)采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線定量，即將空白基質(zhì)樣品凈化濃縮后作為背景配制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2 色譜圖

在1.3.2儀器條件下，3種農(nóng)藥的空白基質(zhì)氣相色譜圖和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖見圖1。由圖可見，α-硫丹、β-硫丹和硫丹硫酸酯在色譜圖上的分離較好，分離度均大于1.5，滿足色譜定量分析的要求。

2.3 線性方程與檢出限

在1.3.2儀器工作條件下對(duì)3種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行測(cè)定，以峰面積A對(duì)濃度C作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。在生咖啡空白基質(zhì)中分別加入0.1 mg·kg-1的硫丹及其代謝物，按1.3.4方法凈化處理后測(cè)定，以3倍信噪比計(jì)算為該方法的檢出限。3種農(nóng)藥的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限見表1。

由表1可知，3種農(nóng)藥在0.01～0.50 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.995，α-硫丹、β-硫丹和硫丹硫酸酯的檢出限分別為0.004 4 mg·kg-1、0.004 2 mg·kg-1、0.002 2 mg·kg-1，測(cè)定下限為0.01～0.02 mg·kg-1。

2.4 正確度與精密度

在生咖啡空白基質(zhì)中分別加入0.02 mg·kg-1、0.05 mg·kg-1、0.10 mg·kg-1 3種農(nóng)藥，靜置30 min后提取凈化并測(cè)定，每個(gè)水平加標(biāo)分別做6個(gè)平行，計(jì)算回收率和精密度，結(jié)果見表2。

通過(guò)表2可以看出，在咖啡生豆基質(zhì)中，3種農(nóng)藥加標(biāo)回收率為80.1%～94.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.4%～9.1%，滿足《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》（GB/T 27404—2008）中準(zhǔn)確度和精密度的要求，該方法可以用于測(cè)定生咖啡豆中硫丹及其代謝物。

3 結(jié)論

本文選取乙腈作為提取試劑、15 mL EMR-Lipd除脂分散凈化管作為除脂試劑建立了一種氣相色譜檢測(cè)咖啡豆中有機(jī)氯農(nóng)藥殘留的方法，數(shù)據(jù)表明該方法提取、除脂效果好，分離度高，適用于脂肪含量高的物質(zhì)。該法操作簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確度、靈敏度高，可以作為實(shí)驗(yàn)室同時(shí)檢測(cè)咖啡豆中硫丹及其代謝物的方法。

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