大麻二酚高產因素研究進展

張元野，張利國，張明，房郁妍，鄭楠，閆博巍，隋月

(黑龍江省農業科學院經濟作物研究所，黑龍江哈爾濱 150086)

工業大麻是一種古老的作物，在我國種植歷史悠久，據考證在南北朝時期已有種植，主要用于紡織、造紙、榨油等[1]。隨著現代科技發展，工業大麻產業規模越發興茂，上等的纖維麻制品可遠銷國外，優質的麻籽食品、食用油備受廣大消費者青睞，雌花提取出的多種大麻素應用更加廣泛，掀起新一輪的生物材料革命。

大麻素是工業大麻植株中特有的一類萜烯酚類化合物，可分為酚類物質和非酚類物質，其中酚類物質以大麻二酚(cannabidiol，CBD)、四氫大麻酚(Δ9-Tetrahydrocannabinol，THC)為主，大麻萜酚(cannabigerol，CBG)、大麻環萜酚(cannahichromene，CBC)的含量稍遜色，余下的100 多種萜烯酚類物質含量較少[2]，藥用價值有待進一步開發。

在國際上，大麻通常分為毒品大麻和工業大麻，在我國根據THC 和CBD 含量，可進一步將其分為毒品大麻(THC 含量高于0.3%)、工業大麻(THC 含量低于0.3%，CBD 含量低)、藥用大麻(THC 含量低于0.3%，CBD 含量高)[3]。目前，藥用大麻主要培育方向仍是高CBD 含量大麻[4]。CBD 的作用廣泛，已證明其具有消炎鎮痛、抗抑郁焦慮、治療癌癥等作用，近期研究[5-8]顯示，CBD在皮膚病變治療、創傷應激障礙治療、抗COVID-19 及其他呼吸系統疾病等方面也具有一定療效，是一種多功能、療效強、潛力深的醫學原料。

國外對藥用大麻的研究處于領先地位，受限于法規政策，國內藥用大麻的發展起步較晚，但在一些領域的研究已趕超國外[9-11]。針對國際市場CBD 供不應求的現狀，諸多科研團隊為緩解供需壓力，在植株生長處理、田間管理改良、次生代謝通路及相關基因等方面均探究出CBD 增產方法或主要影響因素的成果。本文針對影響CBD 產量的遺傳因素、外界環境因素進行系統性闡述，旨在為藥用大麻產業的發展提供新思路。

1 環境因素

在作物生長發育的進程中，除了受到內源遺傳調控外，還易受到外界環境因素的影響，使得同一地塊產出的生物量出現波動[12]。在工業大麻中，大麻素的產生與積累極易受到外界因素的影響。

1.1 光照模式

工業大麻屬于喜光、短日照植物，收獲大麻素的主要工藝器官是雌花，雌花頂葉中大麻素含量最高，光照對于花期的影響較大，也是能夠影響大麻素積累的主要環境因素之一。

在Eichhorn 等[13]的研究中指出，美國將室內培育工業大麻列為能源密集型產業之一，室內PPFD(光合光子通量密度)達到1500 μmol/m2/s 時，可獲得穩定、高產、高質量的大麻素。研究[14]表明，為植株提供特定波譜的光照，能夠改變植株的形態，如:葉面積、葉片數量、花芽大小等。Mahlberg 等[15]研究發現，使用約450 μmol/m2/s 的綠光照射工業大麻植株情況下，THC 的含量呈現下降趨勢；Magagnini 等[16]證明在約450 μmol/m2/s 的藍光(12 h 光照、12 h 黑暗)下種植的工業大麻，大麻素含量得到有效提升，類似地UV-A 能夠與藍光協同促進大麻酚類物質的積累。在光照時間的研究中，張靜等[17]發現光照強度為460 μmol/m2/s 情況下，12 h 光照的工業大麻植株CBD 含量與8、10 h 光照處理的呈顯著性差異。上述研究表明，在室內或田間種植工業大麻時，合理選擇光周期時間、光譜波長可提高CBD 的最終產出。

1.2 土肥管理

工業大麻是一種具有抗旱能力的作物，適宜種植在透水性好、富砂土的坡崗地，黑龍江省種植藥用大麻有一定歷史，對田間土肥管理摸索出部分技術要點。

藥用大麻溫室種植的肥料管理尤為重要，為了保證秧苗的快速營養生長，至少需要施加能夠提供90 kg/hm2氮、60 kg/hm2鉀、40 kg/hm2磷酸鹽的肥料，同時增添其他特殊肥料有效提升CBD產量[18]。如可每周噴施稀釋800 倍的鮮牛奶以增加植株含鈣量、乳酸菌含量和蛋白酶活性；澆水時可按照75 kg/hm2添加魚蛋白營養液，豐富植株有機質；在開花后葉面噴施600～1000 倍甲殼素營養液，在花葉表面形成角質保護層降低CBD 揮發損耗；收獲花葉前15 d，追加高質量鉀肥，進一步促進CBD 積累，同時避免次級代謝底物合成為THC。適宜的田間管理技術，是保障CBD 增產、穩產的有效手段。

1.3 生物脅迫

大麻素具有一定的抗蟲性，使得工業大麻具有較好的抗蟲能力。在McPartland[21]的統計中，約300 種害蟲能夠對工業大麻植株造成損害，其中只有少數幾種對植株的破壞力較強，可能造成經濟效益的流失，如歐洲玉米螟蟲(Ostrinia nubilalis)、大麻螟蟲(Grapholita delineana)。Park 等[22]的研究中，意外地發現煙草角蟲(Manduca sexta)使得工業大麻植株中CBGA、CBG、CBD 的含量明顯降低，與預期的結果不同，推斷煙草角蟲的反流物抑制了植物的防御系統。在其他研究中[23]，昆蟲造成生物脅迫，是非常有效的大麻素含量提升刺激劑。不同的昆蟲對CBD 產量影響模式不同，適宜昆蟲刺激產生的生物脅迫能否應用為增產技術，有待進一步挖掘。

1.4 物理刺激

在生產中，除了通過土肥調整措施提高產量外，還可采用一些物理刺激提升大麻素的含量[19]。物理刺激的方法通常包括遮光處理、收獲前降溫或冷水澆灌、人工機械損傷等，通過刺激觸發工業大麻植株的應激系統，促進次生代謝產物的產生，最終達到使CBD 增產的目的。在程超華[20]的研究中，對工業大麻花期雌性植株材料的莖稈施加機械穿刺，在損傷后的2 d 內CBD 和THC 含量顯著提升，JA、SA、ABA 等激素水平也隨之改變。鑒于成本偏高、操作復雜等方面原因，通過物理刺激提升CBD 產量的研究相對較少。

1.5 外源激素

自發現植物激素以來，通過噴施外源激素來增產的方式已廣泛應用于多種作物中[24]，外源激素對大麻素的產生與積累的影響少有研究[25]。Apicella 等[26]的研究證實，噴施茉莉酸甲酯(Me-JA)能夠提升大麻素含量，在之前研究中JA 被認為可能參與調控腺毛發育和次生代謝合成。吳姍[27]對于激素影響大麻素含量的研究比較深入，使用多種外源激素處理工業大麻材料，并測定大麻素含量以探尋合適的增產激素，其證實:200 mg/L 的ETH 噴施工業大麻花葉能顯著提升CBD 產量，同時THC 的含量也有所提升；噴施赤霉素(GA3)后，短期內能夠提升CBD 含量，隨時間延長大麻素含量顯著降低；20 mg/L 的激動素(KT)噴施花葉后，CBD 可提高69.08%，增產一半以上，但THC 的含量有所提升。外源激素雖能達到增產目的，但THC 與CBD 含量通常同步增加，多種外源激素聯合噴施可能會產生抑制THC 產量、提高CBD 產出的效果，在工業大麻中該項研究尚為匱乏，在其他作物中有所試驗[28]。

2 遺傳因素

自1995年鑒定得到四氫大麻酸合成酶(THCA)以來[29]，大麻素合成途徑備受關注，THC、CBD、CBG 等主要大麻素的代謝途徑目前已基本明了，關鍵的合成酶OAC、PT、AAE 等已有所研究。隨著科技進步，更多的合成酶基因、轉錄因子、激素信號分子、結構基因等為學者們發現和解析[30]，進一步了解THC、CBD 等大麻素的調控機理指日可待。

2.1 腺毛發育

腺毛是植物外部防御的重要屏障之一，可分為分泌型和非分泌型，分泌型腺毛是工業大麻花葉中產生和存儲大麻素的主要器官[31]，分泌型腺毛根據形態特征可進一步分為頭狀有柄腺毛、頭狀無柄腺毛、球狀腺毛[32]，其中有柄腺毛能夠產生的大麻素種類最多，且分泌能力最強[33]。目前工業大麻中腺毛發育的調控機制尚不清楚，但在其他植物中已有研究證實，R2R3-MYB和HD-ZIP IV(plant-specific homeodomain zipper family IV)轉錄因子家族參與到無柄腺毛發育為有柄腺毛的進程[34]。在Haiden 等[35]的研究中，發現在本氏煙中過表達R2R3-MYB轉錄因子家族的CsMIXTA，能夠增大腺毛的體型和密度，并促進分支的產生，工業大麻中過表達CsMIXTA可能會提升大麻素的產量。在Ma 等[36]對工業大麻HD-ZIP IV轉錄因子的全基因組鑒定和表達分析中，鑒定到9個HD-ZIP IV轉錄因子，與擬南芥、水稻的HD-ZIP IV基因家族有共同的祖先，該基因家族中有4個主要在花中表達，可能參與到腺毛形態發育與次生代謝產物的調控。

在工業大麻的其他組織器官內大麻素的含量很低，因大麻素具有細胞毒性，會對正常的植物細胞產生一定的毒害，而腺毛細胞的抵御機制能夠削弱毒性，使得大麻素主要存在于雌花中，同時細胞毒性也是工程菌生產大麻素難的主要原因之一。Wang 等[37]對工業大麻轉運蛋白MATE(Multidrug and toxic compound extrusion proteins)家族進行了鑒定與分析，發現MATEs 蛋白除了能夠轉運植物激素、各種離子外，還可以轉運大麻素到細胞內，避免其遭受不必要的修飾(如糖基化)和對細胞產生毒性；RT-PCR 結果顯示，CsMATEs家族的CsMATE23、CsMATE28 和CsMATE34 主要在花中表達，推測其可能參與到大麻素的轉運，UV-B 可以提升大麻素的產量，在UV-B 處理下CsMATE23、CsMATE34 的表達量有所提升，二者呈正相關，CsMATEs可能在大麻素的生物合成與分泌中發揮重要作用。多種轉錄因子與基因的研究，填補了腺毛發育分子機制的部分空白，為今后闡明腺毛發育和大麻素增產提供了新方向。

2.2 花發育

花的發育情況也是影響大麻素產生與積累的主要因素，其他植物中調控花發育的基因在工業大麻中被認為具有相似的作用。如Lu 等[38]的研究中:通過全基因組表達分析從工業大麻中共鑒定出51 個bZIP基因家族成員，CsbZIP2、CsbZIP8、CsbZIP15 和CsbZIP325 等在花、苞片、莖和種子中均有表達，尤其是CsbZIP2、CsbZIP8 在花和苞片中呈高表達；已證實水稻中bZIP56、bZIP64、bZIP79 參與酚類和萜類化合物的合成[39]，CsbZIP25、CsbZIP32 的結構與之十分相似，親緣關系較近，推斷其可能參與大麻素的合成。

陳晗等[40]對工業大麻PEBP基因家族分析中，共鑒定出12 個PEBPs基因，主要參與到光形態建成、花的發育和調控等，該基因家族的啟動子中多包含光反應順式調節元件、脫落酸反應順式作用元件以及茉莉酸響應元件等，其他參與花期的基因CsCOL、CsHd3a也有類似的元件[41]。上述提到的CsMATE23 等的啟動子中同樣包含豐富的光響應順式作用元件，而在外源激素噴施的研究中，茉莉酸能夠提升大麻素的含量，推測PEBP基因家族等FT 家族成員與大麻素的產生與積累存在一定聯系。

2.3 合成途徑及相關基因

大麻素及相關酶類主要在腺毛中合成和分泌，基本的代謝合成途徑已闡述明了[42]。整個合成途徑以CBGA 為中心前體，CBGA 主要由兩個前體物質OLA 和GPP 經過異戊烯基轉移酶(PT)合成而來，其中OLA 是2-甲基赤蘚糖醇磷酸(MEP)途徑合成的乙酰輔酶A 在聚酮合酶(OLS)催化下產生，而GPP 來自焦磷酸香葉酯(GPP)合成途徑；隨后CBGA 作為前體物質，經由不同的合成酶氧化環化成不同的大麻素，如大麻二酚酸合酶(CBDAS)催化產生CBDA，四氫大麻酸合酶(THCAS)催化產生THCA，這些大麻素還可進一步變化為同系物或其他大麻素。

大麻素的代謝途徑較長，提升底物濃度能夠提高大麻素的最終產量，對DXR、DXS、HDR、HDS、MCT、MDS、OAC、PT等參與前體物質合成的基因如何受到調控尚不明朗，目前多數研究主要針對大麻素合成酶展開。常麗等[43]對CBDA1 進行生物學分析，發現該基因編碼544 個氨基酸，其二級結構豐富，包含較多蛋白質修飾及活化位點，表明CBDA1 在體內受多種因子調控。潘根等[44]對CBDAS基因家族進行全基因組鑒定，共分析出5 個成員，部分成員在雌蕊中表達量很高，該家族基因的啟動子中普遍存在較多光響應元件，且激素響應元件含量豐富，證實光照、激素是影響CBD 產量的重要因素；在針對高CBD 品種與低CBD 品種的表達量鑒定中，高CBD 品種CBDAS1 的表達量顯著增加。姜穎等[45]對CsTHCA進行克隆，結果發現:該基因共編碼545 個氨基酸，證實基因的多態性是不同品種THC 含量差異的主要原因，且CsTHCA的表達量與THC 含量呈現正相關；簡單的提高底物濃度或豐富CsCBDAS表達量僅能在一定限度內提升CBD 產量，中間或旁支代謝通路可能會截取前體物質，通過分子育種手段抑制CsTHCA的表達實現CBD 產量提升是可行的。

3 結語與展望

藥用成分CBD 的增產一直是藥用大麻領域的研究熱點，眾多學者在藥用大麻生長發育進程中選取不同的切入點，從腺毛的發育到花的建成，從植株的營養生長時期到工藝成熟期，從土肥管理到物理刺激，針對CBD 含量提升進行深入的研究，為指導藥用大麻產業發展提供了豐富的數據基礎。

在許多研究[46-47]中，影響CBD 含量的因素間接或直接指向了光照和植物激素，對不同基因(如bZIP、PEBP、CBDAS等)進行生物信息學分析，均在啟動子區域發現了光反應元件或植物激素響應元件，其他轉錄因子如C2H2、GRAS等也被證實參與到大麻素的合成，二者在響應逆境脅迫中具有重要作用，與本文所述的物理刺激或脅迫能夠提升大麻素含量的研究不謀而合。因而，探究外界環境因素的影響，要與內源遺傳因素相結合才能進一步了解大麻素合成與積累的奧秘。

除本文敘述的產量提升方法外，一些學者對新方向進行了嘗試，如CBD 原材料提取方法的改良，Tiago 等[48]使用DESs 取代常規的提取液，能夠有效保留CBD 的生物活性，減少葉綠素和蠟質等雜質留存并大幅提高萃取率。生物工程菌生產大麻素因大麻素的生物毒性很難實現，但在Luo等[49]的努力下，酵母生產大麻素成為現實，通過給工程菌株喂食不同的脂肪酸輔以簡單的化學合成進行補充，得到了大麻素類似物。自Mechoulam 等[50]確定CBD 結構以來，已有諸多學者通過化工手段實現了CBD 的合成[51]，基因改造酵母合成大麻素是工業大麻合成生物學領域的創舉，有望構建完整的大麻素體外合成產業鏈。

在其他作物中有“理想株型”的理念，在藥用大麻領域，也可以存在類似的期望，即通過多種生物學手段培育出高前體底物、高表達CBDAS、基因敲除或沉默THAS且能夠正常生長發育的藥用大麻品種，輔以合適的田間水肥、光照管理，并在收獲前進行合適的物理刺激，最終獲得高產CBD。室內培育藥用大麻技術還需要進一步探索，可嘗試提高正常光照的光強和補充UV-A 和藍光等光質來促進CBD 的產生和積累。本文就影響CBD 產生與積累的主要因素進行總結，進一步拓寬CBD 的研究方向，為藥用大麻產業提供合理導向。