植物組織培養中污染的產生與防控

顏盟 劉美香

摘? ?要? ?隨著育苗技術的發展，組培工廠化育苗已是目前最便捷高效的方式之一，但隨之而來的問題也日益突出，其中生產中出現的各類污染無疑成為影響育苗效率的大問題。就組培育苗中污染產生的原因進行分析歸納，對癥下藥，提出有效防治意見。

關鍵詞? ?組織培養;育苗;污染

組培污染是指在組織培養過程中，由于皮膚、衣服和周圍環境中微生物的侵入，在培養容器中大量繁殖，導致培養材料無法正常生長的現象。污染存在于組培生產中的每一個環節，一旦污染發生，將會對組培生產產生嚴重影響，甚至成為組培工廠化育苗成敗的關鍵。污染主要分為真菌和細菌污染，細菌污染是瓶苗或者培養基上出現黏液狀物或不透明水跡，真菌污染常見的是黑、白、黃、紅、青等各色霉菌。大多產生在高溫高濕的環境中，控制不當或處理不及時，則會導致污染大面積擴散，對生產造成嚴重影響。

1? ?污染的產生與危害

1.1? ?污染的產生? ?污染由多種因素引起，制劑、接種、洗滌等生產過程均會發生，消殺不徹底的生產環境也會滋生細菌霉菌等。

1）接種操作不規范。接種是培養前最后一個環節，接種時不嚴格無菌操作，接種環境不清潔，工人防護不到位，接種切苗裝瓶時技術不規范，接種臺堆放過多材料等物品擋住氣流，降低工作臺的清潔效率，都會使瓶苗在培養初期出現污染。

2）制劑洗滌。制劑與洗滌為組培生產的準備工作，屬于滅菌前流程，若清洗不到位，培養瓶和蓋有殘存的孢子，或制劑灌裝時污染瓶或蓋，滅菌不到位，都會產生污染。一般這種污染細菌偏多，會在培養基滅菌后3～5天內產生，出現白色或乳白色團狀污染，應及時將其撿出并處理;個別會出現霉菌污染，多是因為灌裝時培養基瓶蓋未擰好，或滅菌后培養瓶或蓋、透氣膜等破損，在培養基冷卻過程中，環境中的霉菌孢子隨著空氣的流動進入培養基而產生。

3）外植體的選取與消毒。建立新材料時外植體選取不合適，本身帶菌則會在后續擴繁中一直出現內生菌污染;或者外植體選取適宜但消毒不到位也會導致后續接種過程中出現霉菌污染，甚至出現黃色或者白色細菌污染，從而導致新材料建立失敗。

4）培養環境不潔凈。潮濕溫暖的環境容易滋生細菌、霉菌。一般在多雨或者高溫季節，如北方的4月、7—8月，培養室因環境濕度、溫度的升高易產生大范圍霉菌污染，若不能及時治理，會對當年的生產造成嚴重的損失。

1.2? ?污染的危害? ?工廠化育苗時，組培瓶苗出現污染后一般是直接舍棄，不能再繼續培養，一旦引起大規模污染將會產生不可挽回的損失，輕則繼代大量減產導致后續生產計劃推進困難，重則損失掉整個種源，直接停產。

對于保留種源或者實驗性用苗，產量少，品質要求高，污染更是殺傷力巨大，會產生不可預估的影響。

2? ?污染的防治

常態化預防，及時治理，防治同步進行。

2.1? ?規范接種? ?接種前換好無菌服、帶好口罩帽子、穿接種室專用的無菌鞋;手部用肥皂水清洗多次;用肥皂水清洗接種所用抹布，并用純凈水清洗，在使用前噴適量75%的酒精。隨后打開接種臺風機，用75%酒精噴灑臺面及接種空間，用抹布擦干凈臺面，包括臺面的滅菌器、酒精燈及泡鑷桶等，所用培養基及待轉接母瓶上接種臺前用噴了酒精的抹布擦凈瓶身，并擦凈雙手。接種時使用滅過菌的刀、鑷、接種盤或培養皿，刀、鑷及刀鑷架在酒精燈外焰進行灼燒滅菌，灼燒后取用時手不過刀鑷柄，切苗時雙手平持刀鑷在接種盤外操作，不得豎拿刀鑷使雙手凌空在接種盤上方。裝瓶時，要灼燒培養基瓶口，然后保持培養瓶在酒精燈周15 cm內，瓶蓋不得放在雙手下方，裝苗時苗不可碰觸到瓶口，鑷子不得伸入到培養基中，封口前瓶口及瓶蓋再次用酒精燈灼燒滅菌。

2.2? ?制劑、洗滌注意細節? ?在制劑洗滌的過程中，破損及霉菌侵染無法清洗干凈的培養容器，及時揀出棄用;灌裝機清洗到位，不留衛生死角;滅菌鍋定期檢修，確保其滅菌質量。在滅菌結束壓力降到零后，待鍋內稍冷卻后再出鍋，避免冷空氣被倒吸入培養瓶中引起霉菌污染。為防治接種后內生菌的產生，制劑時可加入適宜的抑菌劑。

2.3? ?嚴把外植體選擇及消毒關? ?外植體的采摘一般是在連續晴朗的晴天早上9：00前后入園采摘，選擇無病蟲害、長勢健壯的植株，采其頂尖嫩芽部位。消毒時先剪掉較大的葉片，然后在接種臺上用1%的升汞消毒6～8分鐘，用高溫消毒的無菌水清洗后放在無菌瓶中。

2.4? ?調控適宜的溫濕度? ?根據季節的變化，對生產車間環境的濕度溫度進行調控，在高溫多雨的季節，及時降溫除濕，維持適合培養基存放、瓶苗生長的環境條件。確保培養基不被污染，才能有效降低瓶苗污染率。

2.5? ?常規清潔到位? ?日常定時使用臭氧機、紫外燈對接種室、培養室等進行消殺處理，一般建議紫外燈采用時控器定時，早中晚各開燈滅菌半小時，接種臺紫外燈可在下班后打開半小時。臭氧機則可以設置為晚上進行工作，避免影響工作人員。另外，生產車間要做好日常衛生，及時揀出污染瓶苗，在指定地方處理污染，并將污染瓶先用消毒液浸泡，再常規清洗，可用84消毒液或新潔爾滅，有條件的可以在倒掉污染瓶苗前先高溫高壓消毒。及時處理廢棄瓶苗、垃圾，日常用新潔爾滅對環境進行常規消殺。

2.6? ?定期消殺預防? ?對容易滋生污染的環境針對性防治。定期對生產車間消毒，傳統的消毒方法有甲醛熏蒸，該方法滅菌效果最好，但因甲醛對人體危害較大，且熏蒸時所用甲醛純度較高，所以熏蒸后一定要徹底通風。也可選用其他消毒溶液，選擇適宜于自家車間的，科學配比，既減少對員工的健康威脅，又確保車間環境消殺到位。定期保養、清理接種臺過濾網，避免使用時間過長或者保養不到位，濾網壞掉或者積灰嚴重，影響過濾效果，產生污染。

3? ?小結

總體來說，導致植物組織培養污染的原因，可概括為兩個方面，一是生產環節操作不當，包括但不限于制劑、接種、洗滌等;二是培養環境消殺不到位，包括日常各個車間的常規、定期消殺等。污染的防治則是以日常預防為主，防治結合，根據污染產生的原因，采取針對性措施，對癥下藥，確保污染及時被控制。