HPLC法測定消毒產品油劑中的三氯生成分的含量

朱小燕,肖叔平

(江西康美醫藥保健品有限公司,江西 宜春 331200)

0 引言

三氯生,化學名稱為5-氯-2-(2′,4′-二氯苯氧基)苯酚,具有廣譜抗菌功效,除了應用于油劑抑菌洗液中,還廣泛應用于化妝品、洗滌劑、醫療消毒及衛生保健產品中。作為油劑抑菌洗液處方的主藥之一,是發揮療效的關鍵成分,因此有必要對三氯生質量進行控制,而準確檢測油劑抑菌洗液中的三氯生含量對于質量控制至關重要,基于HPLC法測定不同產品中的三氯生成分含量具有廣泛的應用,理論研究成果較為豐富。范晨麗[1]等基于超高效液相色譜-串聯質譜法,對化妝品中的三氯生和三氯卡班進行測定,實驗結果表明,此方法具有速度快、精密度高、避免假陽性等優勢,能夠為化妝品質量檢測提供精準依據。毛文樂[2]等利用HPLC法測定生物膠中的三氯生含量,實驗結果表明,以甲醇-水作為萃取劑、超聲時間為20 min時,能夠達到良好的提取效果,方法便捷、準確,實驗參數能夠滿足日化產品對三氯生質量控制的要求,但是在實驗過程中需做好標準液配置及預處理。徐騰洋[3]等利用HPLC法對食品包裝紙中的三氯生和三濾卡班進行測定,實驗結果表明,此方法能夠獲得較為精準的結果,可為三濾生和三濾卡班遷移規律分析提供參考,具有較高的應用價值。張文豪[4]等利用HPLC法對復方消毒劑中的苯扎溴銨、三氯生和三濾卡班含量進行測定,實驗結果表明,適當調整流動相中乙腈或四氫呋喃比例,能夠更好地提升測定結果精度,有效提高實驗水平,實現消毒劑多組分的同步測定。本研究采用化學檢測手段,建立HPLC法進行測定。

儀器:高效液相色譜儀(島津LC-16),檢測器(UV紫外),工作站(島津LC-Solution) FA2004型電子天平,SK7200LHC型超聲波清洗器。試藥:三氯生對照品(批號:510138-201701,購于中國食品藥品檢定研究院),婦科抑菌油劑(生產企業提供,批號20220501、20220502、20220503),乙腈(色譜純),水(超純水),其余試劑(分析純)。

1 方法與結果

1.1 對照品溶液的制備

三氯生對照品適量,加體積比為80∶20的甲醇-水溶液,配成濃度分別為0.001 6 mg/mL、0.008 0 mg/mL、0.080 4 mg/mL和0.402 2 mg/mL的溶液,即得對照品溶液。

1.2 供試品溶液的制備

取三批油劑內容物,精密稱取1.0 g,置于50 mL容量瓶中,加體積比為80∶20的甲醇-水溶液適量,超聲(功率350 W、頻率40 kHz)提取20 min,取出,放冷,再加體積比為80∶20的甲醇-水溶液定容至50 mL,搖勻,經過濾膜(0.45 μm微孔)過濾。

1.3 陰性對照溶液的制備

處方中藥材(去除三氯生),按標準制法制備,陰性供試品(不含三氯生),參照1.2方法進行制備。

1.4 色譜條件

色譜柱:Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(200 mm×4.6 mm,5 μm);流動相:乙腈(A)-純化水(B),梯度洗脫(0～5 min,A:60%;5～10 min,A:60%～80%;10～20 min,A:80%);流速(1.5 mL/min),柱溫30 ℃;檢測波長280 nm;進樣量10 μL。各待測組分分離度均大于1.5,理論塔板數均大于4 000。對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液的色譜圖分別如圖1、圖2、圖3所示。

圖1 對照品溶液Fig.1 Reference solution

圖2 供試品溶液Fig.2 Solution for testing product

圖3 陰性對照溶液Fig.3 Negative control solution

1.5 線性關系考察

取濃度分別為0.001 6 mg/mL、0.008 0 mg/mL、0.080 4 mg/mL和 0.402 2 mg/mL的對照品溶液,分別進行進樣測定,以峰面積(Y)為縱坐標、對照品濃度(X)為橫坐標進行線性回歸,得線性回歸方程為:Y=0.000 000 2x+0.000 712 5(r=0.999 9),三氯生在1.6～402.2 μg/mL呈良好線性關系。

1.6 精密度試驗

供試品溶液10 μL(精密吸取),重復進樣6次,測定RSD(%)為0.73,表明儀器精密度良好。

1.7 穩定性試驗

取供試品溶液,放置0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h后分別進樣,結果RSD(%)為1.36,表明供試品24 h內穩定。

1.8 重復性試驗

取同一批號供試品6份,制備供試品溶液并測定。結果RSD(%)為1.31,說明本方法重復性良好。

1.9 樣品含量測定

3批樣品各取2份,制備供試品溶液(參考1.2),進行分析(參考1.4條件),結果見表1。

表1 3批樣品測定結果Tab.1 Test results of 3 batches of samples

2 討論

目前,僅有測定消毒劑中2,4,4-三氯-2-羥基二苯醚含量的國家標準GB/T27947-2020《酚類消毒劑衛生要求》,使用該方法檢測婦科抑菌洗液中的三氯生含量,靈敏度低,對于含有多種成分的婦科抑菌洗液來說無法檢出三氯生含量,且色譜圖無法達到基線分離,無法獲得理想的分離效果。由于產品中含有多種油性物質,不溶于水基質,需進行分離處理。另有研究[5-6]提出色譜條件為:色譜柱為迪馬鉆石 C18柱(200 mm×4.6 mm,5 μm)、進樣量5 μL、柱溫為室溫、流動相為體積比80∶20的甲醇-水體系,流速為1.0 mL/min、檢測波長為280 nm,此條件下可得到三氯生對照品的色譜圖和光譜圖,但無法得出該色譜法是否適用于婦科抑菌洗液,因為婦科抑菌洗液由10多味藥加工而成,干擾因素很多,因此有必要探索出一種可檢測婦科抑菌洗液中三氯生含量的方法。

本研究發現,流動相-有機溶劑乙腈與其甲醇相互比較,就色譜峰基線而言,乙腈效果優于甲醇(色譜峰基線,達到有效分離,重現性好)。對于檢測波長,三氯生對照品在230 nm、280 nm處都有吸收,但280 nm處溶劑干擾較小,經綜合考慮選擇280 nm為最佳波長。洗脫方式對等度洗脫與梯度洗脫相進行比較,兩者洗脫方式都能檢測含量成分,但梯度洗脫色譜峰出峰時間短,基線分離效果好,峰形優于等度洗脫。流動相采用pH值為2.5的磷酸鹽緩沖水溶液,該體系對色譜柱損害較大,對此進行了改進,采用乙腈-水溶液的體積梯度洗脫,此方法重現性好,能夠延長色譜柱的使用壽命。流速為1.0～1.5 mL/min,柱溫30℃,曾使用柱溫25℃,色譜峰保留時間延長,峰形出現拖尾,故選擇柱溫為30℃,色譜主峰保留時間在6 min左右出峰,減小了試劑用量,延長了精密色譜儀及色譜柱使用壽命。流速為1.0～1.5 mL/min,色譜峰峰形、保留時間基本無變化。使用的色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18(200 mm×4.6 mm,5 μm),峰形對稱性好,分離度好,主峰保留時間6 min左右出峰,也使用過Ecosil 120-5-C18 EPS(4.6 mm×250 mm,5 μm),峰形對稱性、分離度好,保留時間約5 min左右出峰,說明色譜條件對色譜柱品牌、規格無特殊要求,主峰保留時間約在10 min內出峰。

本方法屬于化學分析檢測,是一種消毒產品三氯生含量檢測及質量控制方法,選定的檢測成分具有抑菌、抗病毒等作用,為該油劑提供了一定的化學物質基礎。研究表明,不同批次3批樣品的檢測成分含量差異不大,說明生產的樣品穩定性良好。對高效液相色譜法的色譜條件進行優化,色譜峰基線平穩,峰形好,且無其他色譜峰干擾,測定結果與同類實驗無明顯差異。含量檢測方法具有操作簡便、靈敏度高、專屬性好等特點,且準確性、重復性、線性關系、穩定性均能達到科研和生產要求,能有效控制婦科抑菌洗液中三氯生的質量,保障藥品有效性和安全性,實現藥品質量可控。