外源24-表油菜素內(nèi)酯對花后蘋果短枝葉片糖代謝和成花基因表達的影響

楊天一 馬利萍 李凱 張滿讓

摘 要 以24-表油菜素內(nèi)酯為外源處理劑，于盛花期后35 d和39 d對‘長富2號蘋果樹進行0.2 mg/L、0.4 mg/L和1.0 mg/L不同濃度2次疊加處理。為探究外源油菜素內(nèi)酯處理對蘋果花后當年生短枝葉片可溶性糖含量影響，測定分析當年生短枝葉片可溶性糖含量變化，并對其可溶性糖和成花相關基因進行實時熒光定量 PCR 分析。結果表明：不同濃度外源24-表油菜素內(nèi)酯處理，各可溶性糖含量發(fā)生不同變化，濃度0.4 mg/L處理在所設濃度梯度效果較好。除花后50 d外，其他時間蔗糖含量均顯著高于對照；葡萄糖和果糖含量在花后50～80 d均高于對照；經(jīng)外源處理后山梨糖醇含量先增加，但在70～80 d含量降低。可溶性糖相關基因表達也發(fā)生相似變化。促花基因? MdSOC1、? MdFT 在花后50 d和70～80 d表達量均顯著高于對照。以上結果表明：適宜濃度的外源油菜素內(nèi)酯處理可增加當年生短枝葉片可溶性糖含量，累積源葉中碳水化合物，有利于營養(yǎng)物質(zhì)運輸，同時促花基因累積表達。

關鍵詞 蘋果；油菜素內(nèi)酯；可溶性糖；成花；基因表達

蘋果（Malus domestica Borkh.）是一種栽培廣泛、具有營養(yǎng)價值的重要經(jīng)濟作物。花芽分化是開花結果的基礎，是果樹由營養(yǎng)生長向生殖生長轉(zhuǎn)化的重要生命活動，如何促進花芽分化進而提高產(chǎn)量是生產(chǎn)實踐中的重要環(huán)節(jié)。

蘋果花芽分化以春梢停止生長前后為起點開始進行[1]，可分為生理分化期、形態(tài)分化期和性細胞形成期。花芽分化是成花因素積累的過程，尤其花芽生理分化期是形成花芽的關鍵時期，促花措施應在花芽孕育臨界期進行效果較好[2]。同時，有研究表明碳水化合物的代謝、累積和轉(zhuǎn)化參與花芽分化過程，且二者顯著相關[3-4]。短枝葉片營養(yǎng)水平的高低，與成花誘導關系密切。

以往研究表明：植物生長不但受內(nèi)源激素調(diào)控，而且增施合理濃度外源激素可一定程度影響植株營養(yǎng)及生殖生長。近年來新型植物激素研究不斷取得進展，油菜素內(nèi)酯（Brassinolide，BR）、茉莉酸、水楊酸、獨腳金內(nèi)酯已逐漸成為熱門研究的植物激素。油菜素內(nèi)酯是一種新型的甾醇類植物激素，被稱為第六大類植物激素[5]。其在促進細胞分裂伸長[6]、器官分化、維管組織發(fā)育[7]、種子休眠與萌發(fā)[8]、葉片伸展、開花時間[9]以及抗逆[10]等生長發(fā)育過程中起到重要調(diào)控作用。

油菜素內(nèi)酯的研究多應用于模式植物擬南芥和1 a生作物，對調(diào)控蘋果研究較少。本試驗選擇眾多油菜素內(nèi)酯中的一種，即24-表油菜素內(nèi)酯（24-Epi），以8 a生‘長富2號蘋果樹為材料，于花芽生理分化期進行不同濃度外源噴施處理，研究其對當年生短枝葉片的可溶性糖含量及相關基因、成花相關基因相對表達量的影響，為油菜素內(nèi)酯在蘋果生產(chǎn)中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與處理

試驗于2021年在陜西省西北農(nóng)林科技大學寶雞千陽蘋果試驗示范站進行。所用24-表油菜素內(nèi)酯購自上海源葉生物科技有限公司，無水乙醇溶解后，水稀釋至所需濃度。

選擇生長健壯、無病蟲害、樹勢接近的8 a生‘長富2號蘋果樹。為保證試驗處理有效性，于盛花期后35 d（2021-05-15）與39 d（2021-05-19）在同一材料進行2次疊加噴施24-表油菜素內(nèi)酯處理，濃度分別為0.2 mg/L、0.4 mg/L和1.0? mg/L。以噴施清水作為對照（CK），噴施程度為葉片和莖表面充分濕潤但無液滴凝聚下落。每個處理重復噴施4棵樹，共16棵樹。以第2次處理完成后第2天（5月20日，花后40 d）為第1次采樣時間，于花后50 d、60 d、70 d、80 d每隔10 d隨機采集當年生飽滿短枝（＜5 cm）的葉片，錫紙包裹并標記后，液氮迅速冷凍帶回，-80? ℃保存，用于后續(xù)指標測定。

1.2 可溶性糖含量的測定

可溶性糖的測定參照崔維芳[11]的研究，略有改動：稱取鮮質(zhì)量0.1 g樣品于2 mL試管，立即用液氮凍存。加入75%色譜級甲醇（-20? ℃預冷） ? 1 400? μL，渦旋10 s后加入100? μL Ribitol核糖醇（4 mg/mL）為內(nèi)標，充分渦旋。在70? ?℃金屬浴恒溫震蕩儀上950 r/min混勻30 min，13 000 g、 4 ℃離心15 min。將800? μL上清液轉(zhuǎn)移到10 mL試管中加入750? μL色譜級CHCL3（-20 ℃預冷）和1? 400? μL ddH2O（4 ℃預冷），充分振蕩后2 200 g、4 ℃離心15 min。上清中取出1 mL放在2 mL離心管中-80 ℃凍存；取10? μL上清液到1.5 mL試管中，真空濃縮機干燥1 h。干燥后加入40? μL甲氧胺鹽酸鹽的吡啶液（吡啶溶解，5?mg/mL），金屬浴恒溫震蕩儀950 r/min、37 ℃條件下振蕩2 h。加入60? μL N-甲基三甲基硅基三氟乙酰胺（MSTFA）衍生劑，金屬浴恒溫震蕩儀300?r/min、37 ℃振蕩30 min。轉(zhuǎn)入上樣瓶，使用氣相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用儀（GCMS- QP2010，島津，Japan）測定后并計算各種糖含量。

1.3 可溶性糖和成花相關基因熒光定量表達分析

參照秦玲[12]方法提取樣品中總 RNA，分光光度計檢測所提 RNA 濃度，瓊脂核糖凝膠電泳驗證所提 RNA 的完整性和純度。使用 Evo?M-MLV 反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄為 cDNA。

設計引物，如表1所示。根據(jù)上述 cDNA 為模板，參照試劑盒 SYBR[HT5”SS]○R Green Pro TaqHS預混型說明書在 QuantStudio5 定量儀上進行 qRT-PCR 反應。以蘋果? MdACTIN 基因為內(nèi)參。反應體系為10? μL（其中 SYBR[HT5”SS]○R? Premix Ex TaqTM II 2×為5? μL，上、下游引物共0.5? μL，cDNA為1? μL，dd H2O為3.5? μL）。反應程序參照秦玲[12]所描述的方法，為95 ℃預變性3 min，94? ℃變性15 s，60? ℃退火20 s，72? ℃延伸20 s，40 次循環(huán)，均設置3次重復，通過2-ΔΔCt方法[13]計算基因的相對表達水平。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用IBM SPSS Statistics 26.0，對所有數(shù)據(jù)（表示為3次重復的平均值）進行單因素方差分析（ANOVA），顯著性分析采用Duncan氏多范圍檢驗（P<0.05）。使用Excel 2010制作相關圖表。

2 結果與分析

2.1 外源24-Epi對當年生短枝葉片可溶性糖含量的影響

對外源24-Epi處理后當年生短枝葉片的可溶性糖含量研究發(fā)現(xiàn)（圖1），蔗糖含量在處理后隨即響應處理，花后40 d時發(fā)生顯著變化；花后50 d時各種濃度處理均降低了短枝頂芽毗鄰葉蔗糖含量，除此外其他4個采樣時間的0.4 mg/L處理后的葉片蔗糖含量均高于對照。花后40 d，處理0.4 mg/L和1.0? mg/L與對照相比顯著提高了蔗糖含量，分別增加70%和42%，此期0.2 mg/L濃度處理對蔗糖含量僅有少量增加。花后60 d時，各濃度處理葉片的蔗糖含量均顯著高于對照，同時處理0.4 mg/L顯著高于其他濃度處理。花后70 d處理0.2 mg/L和0.4 mg/L顯著增加葉片蔗糖含量。花后80 d時，0.4 mg/L處理的蔗糖含量顯著高于對照和其他處理，相較于對照增加了22%。

外源處理對葉片葡萄糖含量影響自花后50 d開始有顯著變化。處理0.4 mg/L在花后自響應起至末期（花后50～80 d）均增加短枝葉片葡萄糖含量且顯著高于對照。處理0.2 mg/L于花后60～70 d相較于對照顯著增加了葉片葡萄糖含量。處理1.0 mg/L在花后50 d時提高了葡萄糖含量，顯著高于對照。短枝葉片果糖含量對處理的響應時間最晚，且只在60 d和70 d發(fā)生了顯著變化。花后60 d時，處理0.4 mg/L葡萄糖含量顯著高于對照和其他處理，處理1.0 mg/L卻使葉片的葡萄糖含量相較于對照和其他處理顯著降低。花后70 d處理0.2 mg/L和0.4 mg/L顯著高于對照和處理1.0 mg/L。綜合變化趨勢來看，處理使葉片中果糖含量在花后40 d時先有所降低，50～70 d不同程度升高后，花后80 d時又下降。

同蔗糖一樣，在花后40 d時短枝葉片山梨糖醇含量已經(jīng)發(fā)生變化。此時各濃度處理均上調(diào)了葉片中山梨糖醇含量，其中處理0.2 mg/L的山梨糖醇含量顯著高于對照和1.0 mg/L；在花后50 d時該濃度處理顯著降低了山梨糖醇含量，60 d時又有所提高。處理0.4 mg/L在花后50 d和60 d時均分別顯著高于對照。在所有采樣時間內(nèi)，處理1.0 mg/L對山梨糖醇含量影響變化與對照間沒有顯著差異。山梨糖醇含量呈現(xiàn)規(guī)律性變化，花后40 d時各處理增加了短枝葉片中山梨糖醇的含量，花后50 d時呈不同程度下調(diào)趨勢，60 d上升后60～80 d對照和各處理的山梨糖醇含量在逐漸降低。

2.2 外源24-Epi對當年生短枝葉片糖代謝相關基因表達量的影響

與蔗糖合成相關聯(lián)的基因蔗糖合酶基因? MdSUSY1、蔗糖磷酸合成酶基因? MdSPS6 在外源24-Epi處理后發(fā)生顯著變化（圖2）。 MdSUSY1 表達量在花后40 d均呈現(xiàn)不同程度增加，且處理0.4 mg/L和1.0 mg/L顯著高于對照。處理0.4 mg/L在花后50 d顯著下調(diào)了基因? MdSUSY1表達，但花后70 d和80 d時該濃度處理使其表達顯著高于對照。花后40 d處理0.4 mg/L和1.0 mg/L上調(diào)基因? MdSPS6 表達且顯著高于對照。花后60 d和80 d時，0.4 mg/L顯著增加基因? MdSPS6 表達量，但在花后70 d處理0.2 mg/L顯著下調(diào)該基因表達水平。

己糖激酶基因? MdHXK1 在花后60～80 d發(fā)生顯著變化，在此期間處理0.4 mg/L均顯著上調(diào)表達。同時在花后60 d和70 d處理0.2 mg/L也顯著增加了基因? MdHXK1 的表達量。處理1.0 mg/L在花后60 d相較于對照顯著上調(diào)? MdHXK1 表達，但70 d時卻又顯著下調(diào)。處理1.0 mg/L在花后50 d和70 d顯著上調(diào)果糖激酶基因? MdFK4 表達水平。0.4 mg/L在花后70～80 d顯著上調(diào)? MdFK4 表達。0.2 mg/L處理僅在花后80 d對? MdFK4 基因表達產(chǎn)生影響，顯著低于對照和其他兩個濃度處理。

山梨糖醇合成關鍵基因6-磷酸山梨醇脫氫酶? MdS6PDH 在外源處理后的前期變化較明顯。花后40 d（即處理12 h），3種濃度處理顯著上調(diào)? MdS6PDH 表達。花后50 d處理0.2 mg/L和0.4 mg/L促使基因? MdS6PDH 表達顯著低于對照，但在花后60 d此兩種濃度處理使基因表達顯著高于對照。花后80 d處理0.4 mg/L，基因? MdS6PDH 相對表達量顯著低于對照和1.0 mg/L。

2.3 外源24-Epi對當年生短枝葉片成花相關基因表達量的影響

由圖3可見，基因? MdSOC1 相對表達量在花后50 d響應處理發(fā)生顯著變化，此時外源0.4 mg/L處理顯著增加了其表達量，同濃度處理在花后70～80 d也顯著上調(diào)? MdSOC1 表達；且在花后50 d和80 d時，0.4 mg/L濃度處理后基因? MdSOC1 表達量顯著高于對照和其他兩個濃度處理。花后60 d時處理0.2 mg/L和1.0 mg/L顯著下調(diào)了? MdSOC1 表達，但處理1.0 mg/L在花后70 d時顯著上調(diào)了該基因表達。

花后40 d時基因? MdFT 表達量已發(fā)生顯著變化，外源0.2 mg/L處理顯著降低該基因表達水平，1.0 mg/L卻使表達量顯著升高，但此時0.4 mg/L處理的基因表達量與對照較接近無明顯變化。花后50 d時處理0.4 mg/L 和1.0?mg/L上調(diào)了? MdFT 表達顯著高于對照。在60～80 d僅有處理0.4 mg/L對? MdFT 表達水平產(chǎn)生顯著影響，處理0.4 mg/L在花后50 d和70～80 d顯著上調(diào)了基因表達。

同? MdSOC1 一樣，基因? MdFLC 表達于花后50 d才開始變化，0.2 mg/L和1.0 mg/L顯著上調(diào)了表達；處理0.4 mg/L在此期顯著下調(diào)了基因表達。花后80 d，0.4 mg/L和1.0 mg/L顯著上調(diào)? MdFLC 表達。

外源0.2 mg/L處理在花后40 d顯著下調(diào)? MdSVP 表達；但花后50 d起均使表達量增加，尤其50 d和70～80 d顯著高于對照。0.4 mg/L處理在花后40 d和50 d顯著下調(diào)表達水平。1.0 mg/L在花后50 d和60 d顯著上調(diào)了基因? MdSVP 表達水平。

3 討? 論

3.1 外源24-Epi對當年生短枝葉片可溶性糖含量及相關基因表達的影響

在花芽分化研究過程中，研究普遍認為碳水化合物的積累有利于花芽分化。糖作為主要能源來源參與植物開花過程[14]，可溶性糖的累積是花芽分化的營養(yǎng)基礎。糖通過光合作用在成熟葉片中合成，最終由韌皮部輸送到需養(yǎng)部位加以貯藏利用，實現(xiàn)從源到庫的轉(zhuǎn)運[15]。借助 RNA 測序技術發(fā)現(xiàn)‘長富和‘煙富蘋果花期短枝頂芽差異表達的基因與糖信號通路存在關聯(lián)[16]。本研究發(fā)現(xiàn)不同濃度的外源24-表油菜素內(nèi)酯處理影響了當年生短枝葉片的可溶性糖含量。

外源處理后（花后40 d），蔗糖含量得到顯著增加。雖然在花后50 d時各濃度處理降低蔗糖含量，但在花芽生理分化期后期各濃度處理仍增加葉片蔗糖含量，尤其處理0.4 mg/L促使葉片蔗糖含量顯著高于對照。蘋果葉片中蔗糖合成的主要 SPS 家族基因蔗糖磷酸合成酶? MdSPS6，與蔗糖相關的基因蔗糖合成酶? MdSUSY1 表達量也明顯升高。花后40 d時， MdSUSY1 表達量的增加較為明顯。處理0.4 mg/L對這兩個基因表達水平影響變化較為明顯。李天來等[17]對番茄幼苗葉噴施epi-BL，發(fā)現(xiàn)葉片蔗糖含量下降，這與本研究結果有相似之處，但處理明顯提高了番茄葉片 SUSY 的 mRNA 水平促進轉(zhuǎn)錄水平的積累。Petzold等[18]在對蠶豆的研究中也有類似發(fā)現(xiàn)，外源24-Epi顯著增加了蠶豆葉片對蔗糖的吸收。蔗糖代謝是調(diào)控花芽分化的代謝樞紐之一，雖然目前尚不清楚蔗糖是作為信號分子還是作為能源物質(zhì)影響花芽分化，但可以肯定的是蔗糖的積累有利于花芽分化。在本研究中發(fā)現(xiàn)以濃度0.4 mg/L處理，除花后50 d外其他時間蔗糖含量均顯著高于對照，外源24-Epi增加了‘長富2號當年生短枝葉片蔗糖累積。山梨糖醇含量也在花后40 d亦開始響應處理發(fā)生變化，但此時只有0.2 mg/L濃度處理顯著提高了葉片中山梨糖醇含量。外源24-Epi對山梨糖醇影響在花芽生理分化期后期不顯著，處理誘導變化發(fā)生在40～60 d，在此期間0.2 mg/L和0.4 mg/L的外源24-Epi顯著增加了山梨糖醇含量。6-磷酸山梨醇脫氫酶基因? S6PDH主要在葉片表達，其參與的反應是山梨糖醇合成的關鍵調(diào)控步驟[19]。對基因? MdS6PDH 定量分析發(fā)現(xiàn)，花后40 d各濃度處理的該基因表達均顯著高于對照，變化與山梨糖醇含量變化相一致。 MdS6PDH 在花后80 d表達顯著下調(diào)，此期山梨糖醇含量雖也有所下調(diào)但未達到顯著水平。

相較于蔗糖和山梨糖醇，葡萄糖和果糖對外源24-Epi處理的響應較晚。在花后50 d時，0.2 mg/L和0.4 mg/L外源24-Epi處理顯著增加葉片中葡萄糖含量，同時在花后60～80 d處理0.4 mg/L葉片中葡萄糖含量顯著高于對照。張麗之等[20]研究發(fā)現(xiàn)噴施葡萄糖可作為一種調(diào)控‘富士蘋果成花的有效手段。本研究發(fā)現(xiàn)外源24-Epi處理增加了當年生短枝葉片葡萄糖含量，這可能是外源24-Epi有利于蘋果花芽生理分化的又一原因。果糖在花后60 d時才發(fā)生顯著變化。葡萄糖和果糖在處理后沒有立即響應外源處理，可能是其本身對油菜素內(nèi)酯響應較晚，還存在另一可能，即前期累積的蔗糖通過蔗糖合成酶或轉(zhuǎn)化酶轉(zhuǎn)化分解形成了較多的葡萄糖和果糖，致使二者在葉片中含量增加。己糖激酶（HXK）已被證明是擬南芥中的葡萄糖感受器[21]，本研究同時對葡萄糖感應因子己糖激酶基因? ?HXK1進行了定量分析，其結果與葡萄糖含量變化較為一致，然而果糖激酶基因? MdFK4 與葉片中果糖含量變化一致性卻不是很高。

不同濃度外源24-Epi處理對短枝頂芽毗鄰葉的可溶性糖含量變化有一定影響，且不同濃度處理存在不相一致的變化。有關 BR 濃度與其效應的關系，Tong 等[22]認為外源處理的 BR 濃度不同，會造成不同甚至相反的生理效應。在本研究中濃度0.4 mg/L外源24-Epi處理促進葉片中蔗糖、葡萄糖和果糖含量增加，較為明顯地積累了源葉中碳水化合物，這可為后期短枝頂芽發(fā)育需要較多的可溶糖能量積累做好“源”端準備，可以促進輸送較多同化物。同時糖也是高等植物葉片光合作用的產(chǎn)物[23]，當年生短枝葉片中可溶性糖含量增多也恰從另一方面證明外源24-Epi對光合作用起到積極促進作用。

3.2 外源24-Epi對當年生短枝葉片成花相關基因表達的影響

在擬南芥中已有研究表明，BR通過調(diào)控 FLC 表達從而影響開花時間[24]。SVP 可能是受 BR 的直接調(diào)控[25]。并且有研究表明 SVP、 FT 和 SOC1 間存在關聯(lián)直接作用[26]。同時鑒于前人研究結果 FLC 作為參與春化和自主途徑的關鍵開花抑制因子，在蘋果花芽分化階段幾乎沒有在芽中表達[27]。在本研究中為了探究 BR 如何影響蘋果成花相關基因，對當年生短枝葉片中的? MdFT、? MdSOC1、? MdFLC、? MdSVP 基因相對表達量進行了實時熒光定量分析。結果表明? MdFT 和? MdSVP 在處理第2天（花后40 d）就已對外源處理產(chǎn)生顯著響應， MdSOC1 和? MdFLC 相較于對照雖均有不同程度下調(diào)但此期未達顯著變化。但蘋果成花誘導是一個較長時間的持續(xù)性過程，在本研究中? MdFT 和? MdSOC1 的表達量于花后50 d、70 d和80 d有一致的轉(zhuǎn)錄水平，均被0.4 mg/L外源24-Epi顯著上調(diào)，這可能是有利于‘長富2號蘋果花芽生理分化的因素。本研究僅對部分成花關鍵基因進行了 RT-qPCR 相對表達量的分析，但未證明外源24-表油菜素內(nèi)酯是如何直接或間接影響具體哪個成花相關基因從而調(diào)控整個蘋果成花途徑，尚需后續(xù)的研究給予解答。

4 結? 論

綜上所述，于蘋果盛花期后2次疊加施用0.4 mg/L外源24-表油菜素內(nèi)酯有利于可溶性糖含量積累，促進成花基因表達，對果樹光合作用起到一定促進作用。在實際生產(chǎn)中可以參考這一手段調(diào)控蘋果樹體生長。

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Abstract In order to explore the effect of exogenous brassinosteroids on the soluble sugar content in the annual spur leaves，24-Epicastasterone was used as exogenous treatment agent，‘Nagafu 2 apple trees were treated with 24-Epi at 35 and 39 days with two overlapping concentrations of 0.2 mg/L，0.4 mg/L and 1.0 mg/L after full bloom. The changes of soluble sugar content in the annual spur leaves were measured，and the quantitative real-time PCR analysis of soluble sugar and flowers related genes was conducted.The results showed that different concentrations of exogenous 24-Epicastasterone had different changes in soluble sugar content，and the concentration of 0.4 mg/L treatment had better effect in the set concentration gradient.The content of sucrose was significantly higher than the control at other times except for 50 days after full bloom; the content of glucose and fructose was higher than that of the control from 50-80 days after full bloom.The content of sorbitol increased after exogenous treatment，but decreased at 70-80 days.Similar changes occurred in soluble sugar-related gene expression.The expression of the flower-promoting genes? MdSOC1 and? MdFT were significantly higher than those of the control at 50 days and 70-80 days after full bloom.The above results indicated that exogenous oleuropein lactone treatment at appropriate concentrations could increase the soluble sugar content of annual spur leaves，accumulate carbohydrates in the? leaves，facilitate nutrient transport，and the accumulate the expression of flower-promoting genes.

Key words Malus domestica; Brassinolide; Soluble sugar; Flowering; Gene expression