干旱脅迫下野生大豆水通道蛋白GsPIP2;7功能研究

王 宇 趙 圓 王艷麗 俎天嬌 司增志 孫偉明 喬亞科 張 鍇

（河北科技師范學院，河北省作物逆境生物學重點實驗室（籌），河北 秦皇島 066004）

水通道蛋白（a quaporins，AQPs）是植物中運輸水分及其他小分子物質的重要通道，存在于所有真核生物和大多數原核生物中［1］。在高等植物中，AQPs 由6個高度保守的α-螺旋構成跨膜結構，通過A、B、C、D、E 5 個環相連接。水通道蛋白的B 環和E 環具有高度保守的天冬酰胺-脯氨酸-丙氨酸（Asn-Pro-Ala，NPA）獨特結構。B 環和E 環各自形成半個跨膜螺旋，圍繞形成狹窄的水孔，形成水通道蛋白的“水漏”結構模型［2］。

根據AQPs 在細胞內的位置可分為7 個亞族：質膜內在蛋白（plasma membrane intrinsicproteins，PIPs）、液泡膜內在蛋白（tonoplast intrinsic proteins，TIPs）、類根瘤素26（NOD26）膜蛋白（nodulin-26 like intrinsic proteins，NIPs）、膜內在小分子堿性蛋白（small basic intrinsic proteins，SIPs）、類GlpF 膜內在蛋白（GlpF-like intrnsic proteins，GIPs）、混合內在蛋白（hybrid intrinsic proteins，HIPs）和未鑒定的膜內在蛋白（X intrinsic proteins，XIPs）［3］。PIPs 存在于細胞質膜上，分為PIP1和PIP2 兩個亞類；TIPs 有α、β、γ、δ、和ε 五個亞類，分別存在于不同液泡膜上［4］；NIPs 位于質膜和細胞內膜上，分為NOD26和LIP2兩個亞類；SIPs位于內質網上，分為SIP1 和SIP2 兩個亞類，可促進水分運輸［5］；GIPs和HIPs 僅存在于小立碗蘚（Physcomitrella patens）等幾種苔蘚植物中［6］。

目前，在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中已發現35 個AQPs［7］、玉米（Zea mays）中36 個AQPs［8］、水稻（Oryza sativa）中33 個AQPs［9］、栽培大豆（Glycine max）中72個AQPs［10］、野生大豆（Glycine soja）中鑒定了62個AQPs［11］。前人研究結果說明水通道蛋白PIPs基因亞家族在植物對抗干旱、鹽脅迫等非生物脅迫時具有正向調控作用［11-16］。但是也有一些不同研究結果的報道，如Wang等［17-18］研究發現過表達野生大豆GsPIP2；1和GsTIP2；1的轉基因擬南芥對鹽和干旱脅迫的耐受性降低。此外，干旱脅迫下，不同植物中的PIPs基因表達量也不同［19-20］。以上研究結果表明，植物AQPs的基因轉錄及蛋白表達調控比較復雜，AQPs在調控植株非生物脅迫中的功能尚需進一步研究。

本課題組（河北科技師范學院野生大豆資源課題組）前期篩選到耐旱性強的野生大豆材料永46，對其干旱脅迫后的基因轉錄組進行了研究，發現與敏感材料相比，高耐旱野生大豆材料在干旱脅迫后AQPs基因存在顯著上調或下調表達。為了進一步明確AQPs 在野生大豆抗旱反應中的分子功能，本研究對野生大豆中的AQPs 蛋白結構進行分析，研究耐旱野生大豆材料的AQPs基因在干旱脅迫后的基因轉錄譜；通過轉基因技術在擬南芥中過表達GsPIP2；7基因，分析基因過表達植株與野生型在干旱脅迫下的耐旱能力差異，以期明確野生大豆中AQPs基因在干旱脅迫中的表達情況，揭示GsPIP2；7在野生大豆耐干旱脅迫中的調控功能，為培育耐旱栽培大豆奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料種植及取樣方法

高耐旱野生大豆材料永46 由河北科技師范學院野生大豆資源課題組提供。由于野生大豆籽粒外覆泥漿膜，播種之前需用小刀切種，切種在野生大豆籽粒種臍背面進行，避免破壞種臍。切種后的野生大豆籽粒播種于鋪滿營養土的培養缽中，上覆薄層蛭石。培養缽置于溫度25 ℃（白天）/15 ℃（晚上）、日照長度14 h的溫室中。野生大豆植株生長21 d 后，在營養缽中倒入300 mL 濃度為20%的PEG 6000 模擬干旱脅迫處理。干旱脅迫后分別在0（未干旱脅迫，對照）、6、12、24和48 h后隨機取野生大豆材料葉片1 g，迅速保存于液氮中，作為轉錄組分析的樣本。所有樣品設3 次生物學重復。

1.2 測序數據來源

永46 在干旱脅迫下的轉錄譜由華大基因（北京）進行測序。提取野生大豆葉片RNA，構建cDNA 文庫，利用BGISEQ-500 平臺進行測序。利用Trimmomatic 0.36 軟件對原始數據進行過濾，HISAT2 2.1.0 軟件比對野生大豆（Glycine soja）參考基因序列。通過華大基因交互系統（https：//report.bgi.com/ps/login/login.html）篩選在干旱脅迫后顯著變化（|log2FoldChange|＞1.5）的AQPs基因，基因表達量采用FPKM（Fregments Per Kilobase per Million）法進行計算，利用Heml 1.0.3.7 軟件對取對數值（log2）的基因表達量進行聚類分析，利用MEME（http：//alternate.meme-suite.org/tools/meme）在線分析工具進行蛋白結構域預測，利用TMHMM（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？TMHMM-2.0）在線分析工具進行蛋白跨膜結構域預測。

1.3 GsPIP2;7基因克隆及轉基因擬南芥后代鑒定

提取液氮保存的野生大豆材料永46的葉片RNA，反轉錄為cDNA 后，利用引物F（5′→3′）：GCTCTAGAA TGGCTAAAGATGTTGAGG/R（3′→5′）：AGGCCCGGGT TAAGCGTTGCTTCTGAAG 擴增GsPIP2；7基因（glysoja_008314）。擴增的基因連接到pMD18 載體（D101A，寶生物工程有限公司，大連）上，后轉到表達載體pCHAC（河北農業大學提供）上，以pCHAC：：GsPIP2；7陽性載體轉化農桿菌。擬南芥Columbia-0 生態型為受體，待植株生長至抽苔狀態，將擬南芥的花蕾部位置于含有農桿菌滲透液中浸花5 min，將擬南芥植株在黑暗條件下培養24 h 后正常培養，獲得T0代轉基因材料。收獲T0代種子種植，對生長的T1代轉基因材料進行潮霉素抗性篩選，即在含有20 mg·L-1潮霉素的MS 培養基中對轉基因擬南芥進行抗性篩選。培養7 d后，待擬南芥2 片子葉展開，將培養物轉移至無抗生素的MS 培養基中培養，收獲陽性后代轉基因材料。T2代轉基因材料篩選方法同T1代材料，最終獲得T3代轉基因材料。

1.4 轉GsPIP2;7基因擬南芥基因表達分析

轉基因植株GsPIP2；7基因表達量的測定參照王宇等［21］的方法。T3代純合的轉基因擬南芥種子的種植及干旱處理方法同1.1。取轉基因及野生型擬南芥材料植株葉片提取總RNA，反轉錄得到cDNA。以cDNA為模板，以擬南芥的Actin基因作為內參基因，所用引物如下：GsPIP2；7基因引物F（5′→3′）：GTCGTTGA TAAGGGCGTTGT/R（3′→5′）：GCACCCAAAGCAGTACCA TT；Actin基因引物F（5′→3′）：TGGAATCCACGAGACA ACCTA/R（3′→5′）：TTCTGTGAACGATTCCTGGA。采用One Step SYBR?PrimeScript? RT-PCR Kit 試劑盒（RR066A，寶生物工程有限公司，大連）進行實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）反應，利用Bio-Rad CFX96 熒光定量PCR 儀（伯樂，美國）測定目的基因及內參基因的Ct 值。數據采用2-ΔΔCt法進行分析。

1.5 轉GsPIP2;7基因擬南芥生長及生理指標測定

干旱脅迫后7 d進行干物質重和葉面積測定；利用根系分析系統進行植株根系測定；干旱脅迫后0 h（未干旱脅迫，對照）、12、24 和48 h 后取轉基因擬南芥和野生型擬南芥同一葉位的葉片測定如下生理指標：利用氮藍四唑（nitro-blue tetrazolium，NBT）光還原比色法測定超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性；利用愈創木酚法測定過氧化物酶（peroxidase，POD）活性；利用硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）比色法測定丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量；利用80%丙酮比色法測定葉綠素含量；利用過氧化氫酶測定試劑盒（A007-1-1，南京建成生物工程研究所）測定過氧化氫酶（catalase，CAT）活性。

1.6 數據分析

應用SAS 9.2 統計軟件進行各處理的差異顯著性分析，以P＜0.05為顯著水平。

2 結果與分析

2.1 野生大豆AQPs基因表達及蛋白結構分析

通過野生大豆轉錄組分析的基因注釋結果，鑒定到野生大豆中的69個GsAQPs基因。對69個GsAQPs基因所屬亞族進行分析，發現15個屬于NIPs亞族，25個屬于PIPs 亞族，23 個屬于TIPs 亞族，6 個屬于XIPs 亞族。對69 個GsAQPs 蛋白結構進行分析，發現全部GsAQPs蛋白均含有2 個NPA 基序結構，同一亞族中的蛋白具有相似的結構域，如所有的GsPIPs 均具有質膜水孔蛋白的保守結構域GGGANXXXXGY，但在其他亞族蛋白中均不含有此結構域，說明GsAQP 蛋白具有一定的保守性，并且各個亞族保守性存在差異（電子附圖1）。

在干旱脅迫下，抗旱野生大豆材料中有10 個GsPIPs基因表達差異達到顯著水平（圖1）。10 個差異表達GsPIPs基因有兩種表達模式：處理后6 和24 h 顯著上調表達，GsPIP1；9、GsPIP1；12、GsPIP2；8、GsPIP2；7屬于此種表達模式；處理后先下調表達，至24 h后上調表達，GsPIP2；2、GsPIP2；3、GsPIP1；4基因屬于此種表達模式。對10 個差異表達GsPIPs基因的蛋白結構進行分析（圖2），發現除GsPIP2；7 外，其余9 個GsPIPs 蛋白均有6個跨膜結構，由A、B、C、D、E 5個環相連接，在B 環和E 環均有1 個NPA 基序結構。鑒于GsPIP2；7 蛋白具有與其他GsPIPs 不同的獨特蛋白結構，并且GsPIP2；7在干旱脅迫下顯著上調表達，是上調表達最高的基因，故將其作為候選基因，研究該基因在干旱脅迫下的功能。

圖1 干旱脅迫處理后野生大豆GsPIPs基因表達聚類分析Fig.1 The cluster analysis of GsPIPs in wild soybean under drought stress

圖2 野生大豆GsPIPs蛋白結構域及重要結構域基序預測結果Fig.2 Prediction results of GsPIPs proteins domain and domain motif of wild soybean

2.2 GsPIP2;7基因過表達擬南芥后代篩選

轉基因擬南芥陽性植株真葉長出，而陰性苗的子葉黃化，真葉不能展開，生長停滯（電子附圖2）。對T1和T2代轉基因植株陽、陰性分離比進行卡方測驗，結果如表1 所示。轉基因擬南芥的陽、陰性分離比均符合孟德爾遺傳規律3∶1 的比例，說明外源基因為單顯性基因，遺傳規律遵循孟德爾分離定律。

表1 GsPIP2；7基因過表達擬南芥抗性篩選分離比Table 1 Isolation ratio of resistance identification in GsPIP2；7 overexpressed Arabidopsis thaliana

2.3 GsPIP2;7基因過表達擬南芥的生長指標測定

干旱脅迫4 d后，野生型擬南芥的葉片黃化失綠并且萎蔫，轉基因擬南芥的葉片邊緣開始卷曲，仍然保持綠色（圖3）。

圖3 干旱脅迫下野生型（A）與GsPIP2；7基因過表達（B）擬南芥的表型對比Fig.3 Phenotypic comparison between wild-type（A） and GsPIP2；7 overexpressed（B） Arabidopsis thaliana with drought stress

干旱脅迫7 d后，轉基因擬南芥的根系總長度是野生型的1.42 倍，達到顯著水平，根系表面積和總根體積與野生型之間無顯著差異（表2、電子附圖3）。轉基因擬南芥的葉干重、根干重、單株葉面積及根冠比均顯著高于野生型擬南芥。

表2 干旱脅迫后GsPIP2；7基因過表達擬南芥與野生型擬南芥生長指標差異Table 2 Differences of growth indexes between GsPIP2；7 overexpressed and wild-type Arabidopsis thaliana with drought stress

2.4 GsPIP2;7 基因過表達擬南芥的基因表達及生理指標測定

對干旱脅迫下過表達擬南芥的GsPIP2；7基因表達量進行測定，結果發現，與野生型相比，過表達植株的GsPIP2；7基因表達量在干旱脅迫下的各個時間點均顯著上調（圖4-A）。為進一步明確轉基因與野生型擬南芥在干旱脅迫下的生理差異，對氧化酶清除酶系（POD、CAT、SOD）酶活性進行了測定，發現與野生型相比，轉基因植株的POD 活性在干旱脅迫后12、24和48 h均顯著升高，CAT 活性在干旱脅迫后12 和24 h 顯著升高，SOD 活性在干旱脅迫后48 h 顯著升高（圖4-B、C、F）。MDA 含量反映細胞內的脂質過氧化水平，對其進行測定發現，轉基因植株的MDA 含量在干旱脅迫后48 h才有所增加，而野生型擬南芥的MDA 含量在12 h即快速升高，并且在12、24 和48 h 均較轉基因植株顯著增加（圖4-D）。

圖4 干旱脅迫下GsPIP2；7基因過表達擬南芥與野生型的GsPIP2；7基因相對表達量，SOD、CAT及POD活性，MDA及葉綠素含量比較Fig.4 The GsPIP2；7 gene relative expression，SOD，POD and CAT activity，MDA and chlorophyll content of GsPIP2；7 overexpressed and wild-type Arabidopsis thaliana with drought stress

鑒于轉基因擬南芥在干旱脅迫后4 d 葉片仍保持綠色（圖3），對其在干旱脅迫后的葉綠素含量進行了測定。結果發現，與野生型相比，轉基因植株的葉綠素含量降低速度更加緩慢，在干旱脅迫后24 和48 h 葉綠素含量差異達到顯著水平（圖4-E）。

3 討論

水通道蛋白AQPs 屬于主嵌入蛋白（major intrinsic protein，MIP）家族，廣泛分布于植物、動物和微生物中，是調節水及小分子物質進出細胞的重要通道，對生物的正常生長具有重要作用［3］。Zhang 等［11］研究報道了野生大豆中存在的62 個AQPs，包括15 個NIPs、19 個PIPs、21個TIPs和7個SIPs。本研究在野生大豆中鑒定到69個AQPs。與Zhang等［11］的研究結果相比，新鑒定的AQPs包括2個NIPs、6個PIPs、2個TIPs和4個XIPs。本研究鑒定到7 個類SIPs（SIPs-like）蛋白結構的野生大豆蛋白，由于這些SIPs-like 蛋白不含有典型的6 個跨膜結構域，故本研究未將其歸為野生大豆的AQPs。

目前，關于干旱脅迫下植物AQPs基因表達的研究報道較多［22-25］。如葡萄（Vitis vinifera）在干旱脅迫下VvPIP1；1表達量顯著上調，而VvPIP2；2表達量保持不變［20］。擬南芥在干旱脅迫下的AQPs基因表達模式有很大差異，如AtPIP2；5始終上調表達（脅迫后4、12、24、48 h），AtPIP1；5、AtPIP2；3、AtPIP2；4和AtPIP2；6始終下調表達，而AtPIP1；1和AtPIP1；2則是先上調表達（脅迫后4 和12 h）后下調表達（24 和48 h）［26］。水稻在干旱脅迫下OsPIP1；1和OsPIP1；2基因表達量上調，而全部的OsPIP2s基因均表現為下調［27］。以上研究結果均說明，干旱脅迫下植物AQPs基因表達模式比較復雜。本研究發現與上述結果類似，干旱脅迫下野生大豆GsPIPs基因有兩種主要表達模式：一種是“上調-下調-上調”表達模式，另一種是“下調-上調”表達模式。這進一步說明了干旱脅迫下植物AQPs基因表達受到復雜的信號網絡調控，但AQPs基因在植株抗旱中的調控機制還需進一步研究。

鑒于植物中的AQPs基因數量較多，研究單個AQP基因功能成為揭示AQPs基因功能的突破口。前人在擬南芥中和小麥（Triticum aestivum）中分別過表達珠美海棠（Malus zumi）、蘋果（Malus domestica）和小麥的PIP2；1基因，發現轉基因植株的干旱脅迫和鹽脅迫抗性增強，轉基因小麥在干旱和鹽脅迫下的CAT、SOD活性增加，MDA 含量較低，推測這是其比野生型植株生存能力更強的原因［28-30］。Zhang 等［31］關于柳枝稷（Panicum virgatum）PvPIP2；9基因的研究結果也發現，基因過表達植株在干旱脅迫下表現出更高的株高、葉長、地上生物量、纖維素含量和蛋白質含量，說明PIPs基因對植物耐干旱脅迫具有正向調控作用。此外，關于植物PIP2；7基因功能也有一些報道。如Khan 等［32］在擬南芥中過表達了麻風樹（Jatropha curcas）的JcPIP2；7基因，發現過表達植株在鹽和干旱脅迫下的根長增加，并在復水后能夠正常生長，表現出比野生型植株更強的抗鹽和抗干旱脅迫，Pou 等［33］也得到了相似的研究結果。本研究在擬南芥中過表達了野生大豆GsPIP2；7基因，發現與野生型相比，過表達植株在干旱脅迫下的根長更長，活性氧清除酶系的酶活性保持較高水平，這可能與細胞中較低的MDA含量有關。并且過表達植株的葉片保持綠色，葉綠素含量降低速率較慢，這都顯示出過表達植株對干旱脅迫表現更強的抗性。以上結果說明GsPIP2；7基因在野生大豆耐干旱脅迫中發揮正向調控作用，但其他AQPs基因是否發揮了相同的功能尚需進一步研究。

4 結論

本研究鑒定到69個野生大豆AQPs蛋白，其中2個NIPs、6 個PIPs、2 個TIPs 和4 個XIPs 為新鑒定AQPs 蛋白；分析了干旱脅迫下高抗干旱野生大豆材料的AQPs基因表達模式，發現差異表達AQPs基因主要有“上調-下調-上調”和“下調-上調”兩種表達模式。在擬南芥中過表達了野生大豆GsPIP2；7基因，發現過表達植株在干旱脅迫下的根系總長度更長，活性氧清除酶系活性較高，MDA 含量較低，葉綠素含量降低速率較慢，表現出較強的干旱脅迫耐性水平。