電子加速器輻照對紅花粉末及水提液微生物及羥基紅花黃色素A含量的影響

余楊健 謝和兵 ， 尼瑪次仁 ， 白瑪旦增 ，

（1安徽中醫藥大學藥學院，安徽 合肥 230013；2南通市海門長三角藥物高等研究院，江蘇 南通 226133；3江蘇神猴醫藥研究有限公司，江蘇 南通 226133；4西藏神猴藥業有限責任公司，西藏 日喀則 857000）

紅花（Carthamus tinctoriusL.）屬菊科一年生草本植物，多分布于新疆、云南、西藏、四川等地，具有活血化瘀、通經止痛的功效［1］。紅花作為中藥制劑中出現頻率較高的單味藥，是桃紅四物湯、二十五味珍珠丸等中成藥的重要原料藥之一［2-3］。紅花被衛生部列為藥食同源類花類品種，還兼作染料、飼料等的原料［4］。紅花中含有豐富的黃酮類［5］、生物堿［6］、苷類［7］、甾醇［8］、多糖［9］等成分，現代藥理學對紅花中的黃酮類成分研究最多。黃酮類成分主要包括羥基紅花黃色素A、槲皮素、蘆丁和山柰酚等，《中華人民共和國藥典》（2020 版）中同時將羥基紅花黃色素A 和山柰酚列為紅花藥材的含量質檢指標［10］。其中羥基紅花黃色素A是紅花的水溶性有效成分，屬于單查爾酮苷類化合物［11］，具有抗心肌缺血損傷［12-14］、抗炎［15-16］、抗帕金森病［17-18］、抗血栓［19］、降血糖［20］等多重藥理作用。

紅花藥材在種植、貯藏、加工炮制過程中常會引入微生物，而微生物超標會影響藥材和成品的質量，因此，在制劑的生產過程中常需對原料藥材、中藥提取物或制劑成品進行滅菌處理。目前常用的中藥滅菌方法包括干熱滅菌、微波滅菌、過熱蒸汽滅菌、輻照滅菌等［21］。紅花中的有效成分羥基紅花黃色素A對光、熱敏感［22-23］，易受外界條件的影響而發生改變［24-25］，常規的濕熱、干熱等滅菌工藝均會對紅花的質量產生不利影響。而輻照滅菌技術是利用電離輻射產生的電磁波直接作用于物體分子結構來殺滅微生物的一種方法，屬于“冷滅菌”工藝。與其他滅菌方法相比，輻照滅菌反應溫和、滅菌迅速、不會破壞藥物的有效成分，且不會殘留有害物質［26］，適用于含熱敏性成分中藥材的滅菌處理［27-28］，目前已廣泛應用于中藥材、藥品、食品、醫療器械等滅菌領域。2020 版《中華人民共和國藥典》中的“輻射滅菌法”規定“能夠耐輻射的醫療器械、生產輔助用品、藥品包裝材料、原料藥及成品等均可用本法滅菌”［29］。輻照滅菌技術包括60Co 輻照滅菌和電子加速器輻照滅菌。電子加速器輻照滅菌技術被譽為“21 世紀綠色滅菌加工技術”，可以通過發射高能電子束對藥物進行滅菌，與60Co輻照滅菌相比更安全環保、能耗更低，能量利用率高且不產生核廢物［30-32］。

本研究通過不同強度的電子束輻照處理紅花藥材，比較輻照前后紅花粉末和紅花水提液性狀、顯微、薄層、微生物及羥基紅花黃色素A含量變化，旨在為紅花和含紅花制劑的輻照滅菌提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅花購于西藏神猴藥業有限責任公司，經江蘇神猴醫藥研究有限公司鑒定為菊科植物紅花（Carthamus tinctoriusL.）的干燥花；羥基紅花黃色素A 對照品（純度為96.8%）、紅花對照藥材，中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈為色譜純，安徽時聯特種溶劑股份有限公司；磷酸（優級純），甲酸、丙三醇、乙酸、乙酸乙酯、丙酮為分析純，國藥集團化學試劑有限公司（上海）。

1.2 主要儀器與設備

20B高效萬能粉碎機，常州市強迪干燥設備有限公司；WMS-1037生物光學顯微鏡，上海無陌光學儀器有限公司；SHZ-A 雙數顯水浴恒溫振蕩器、UC-250DE 超聲清洗儀，上海精其儀器有限公司；Essentia LC-16 高效液相色譜儀，日本島津公司；DZ-10/20 電子加速器，安徽戈瑞電子科技股份有限公司；XSR205DU/AC 十萬分之一天平，美國梅特勒托利多科技有限公司；數顯電熱套，杭州振和科學儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品處理及輻照劑量的選擇 用20B 高效萬能粉碎機將紅花藥材粉碎成粗粉，過3 號篩（50 目）。將紅花粉末分為6組，裝入透明PET瓶中，每組4瓶，每瓶15 g，即得紅花粉末組。取紅花粉末30 g 置于圓底燒瓶中加12 倍水回流提取3 次，每次0.5 h，合并水提液。將紅花水提液分為6 組，裝入透明PET 瓶中，每組3 瓶，每瓶40 mL，即得紅花水提液組。所有試驗用輻照樣品均由中廣核戈瑞科技有限公司采用電子加速器進行輻照滅菌處理，輻照劑量分別為0、4、6、8、10 kGy。

1.3.2 性狀觀察 通過日光下目視、手觸、鼻嗅、口嘗等方式對紅花粉末和紅花水提液外觀、色澤、氣味、味道等進行直觀判斷［33］。

1.3.3 顯微鑒別 參照《中華人民共和國藥典》2020年版四部通則2001 顯微鑒別法［29］，取紅花粉末過5 號篩（80 目），挑取少量置于載玻片上，滴加甘油醋酸試液，蓋上蓋玻片，置于WMS-1037生物光學顯微鏡下觀察。

1.3.4 薄層色譜定性鑒別 分別取徑0、4、6、8、10 kGy 劑量輻照滅菌處理的紅花粉末各0.5 g 于具塞錐形瓶中，加80%丙酮5 mL，密塞，置于SHZ-A雙數顯水浴恒溫振蕩器中振搖15 min，靜置，用玻璃漏斗過濾，取濾液作為紅花供試品溶液。另取紅花對照藥材0.5 g，同法制成紅花對照品溶液。參照《中華人民共和國藥典》2020 年版四部通則0502 薄層色譜法［29］，吸取紅花對照品溶液和上述各供試品溶液各5 μL，分別點于同一硅膠H 薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-水-甲醇（7∶2∶3∶0.4，V/V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干。

1.3.5 羥基紅花黃色素A含量測定

1.3.5.1 色譜條件 色譜柱：Ultimate XB-C18 液相色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-乙腈-0.7%磷酸溶液（26∶2∶72）；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；檢測波長：403 nm；進樣量：10 μL。理論板數按羥基紅花黃色素A峰計算應不低于3 000。

1.3.5.2 對照品溶液的制備 精密稱取羥基紅花黃色素A對照品13.23 mg于100 mL容量瓶中，加25%甲醇定容，搖勻，微孔濾膜濾過，取續濾液，即得羥基紅花黃色素A對照品溶液，濃度為0.13 mg·mL-1。

1.3.5.3 紅花粉末供試品溶液的制備 取紅花粉末約0.4 g 置于具塞錐形瓶中，加入25%甲醇50 mL，稱定重量，超聲處理（功率300 W，頻率50 kHz）40 min，放冷，再稱定重量，用25%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得紅花粉末供試品溶液。

1.3.5.4 紅花水提液供試品溶液的制備 取紅花水提液5 mL 置于10 mL 容量瓶中，加25%甲醇定容，搖勻，微孔濾膜過濾，取續濾液，即得紅花水提液供試品。

1.3.5.5 羥基紅花黃色素A 含量測定 吸取上述對照品溶液和供試品溶液各10 μL，按1.3.5.1色譜條件用Essentia LC-16 高效液相色譜儀測定，記錄目標峰峰面積，采用外標法計算紅花粉末和紅花水提液中羥基紅花黃色素A含量。計算公式如下：

紅花粉末中羥基紅花黃色素A含量=（供試品溶液峰面積×對照品溶液濃度）/（對照品溶液峰面積×供試品溶液濃度）×100%；

紅花水提液中羥基紅花黃色素A含量=（供試品溶液峰面積×對照品溶液濃度×供試品溶液稀釋倍數×紅花水提液總體積）/（對照品溶液峰面積×紅花質量）×100%。

1.3.6 微生物限度測定 參照《中華人民共和國藥典》2020 年版四部通則1105 微生物計數法、1106 控制菌檢查法和1107非無菌藥品微生物限度標準［29］，對輻照前后紅花粉末和紅花水提液細菌總數、霉菌和酵母菌總數及大腸菌群進行檢查。

1.4 數據分析

采用SPSS 26.0 軟件進行統計學分析，輻照前后含量數據比較采用單因素方差分析中的事后多重比較，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 輻照前后性狀觀察

由圖1 可知，輻照前后紅花粉末和紅花水提液外觀、色澤、氣味均未發生明顯變化。紅花粉末呈紅黃色或紅色，質柔軟，氣微香，味微苦；紅花水提液呈棕褐色，氣微香，味苦澀。說明電子加速器輻照滅菌對紅花粉末和紅花水提液性狀無明顯影響。

圖1 輻照前后紅花粉末和紅花水提液性狀Fig.1 Characteristics of safflower powder and safflower aqueous extract before and after irradiation

2.2 輻照前后紅花粉末的顯微鑒別

由圖2可知，紅花粉末輻照前在顯微鏡下可見花冠、花絲、柱頭碎片分布，有長管狀分泌細胞位于導管旁，含黃棕色至紅棕色分泌物。花冠裂片頂端表皮細胞外壁突起呈短絨毛狀。柱頭和花柱上部表皮細胞分化成圓錐形單細胞毛，先端尖或稍鈍。花粉粒類圓形、橢圓形或橄欖形，具3個萌發孔，外壁有齒狀突起。草酸鈣方晶常見于薄壁細胞中。輻照后上述顯微特征均能看到，說明電子加速器輻照滅菌未明顯改變紅花粉末顯微特征。

圖2 紅花粉末輻照前后顯微特征（10×40）Fig.2 Microscopic characteristics of safflower powder before and after irradiation （10×40）

2.3 輻照前后紅花粉末薄層鑒別

在供試品色譜中，經0、4、6、8、10 kGy 輻照劑量輻照的紅花粉末在與紅花對照藥材色譜相應的位置上，顯示相同顏色的斑點，說明電子加速器輻照滅菌未明顯改變紅花粉末薄層色譜（圖3）。

圖3 紅花粉末輻照前后薄層色譜圖Fig.3 Thin layer chromatogram of safflower powder before and after irradiation

2.4 輻照前后紅花粉末和紅花水提液中羥基紅花黃色素A含量變化

不同劑量輻照下紅花粉末和紅花水提液中羥基紅花黃色素A 含量測定高效液相色譜圖見圖4 和圖5。結果表明，輻照前后目標峰圖譜無明顯改變。輻照前后紅花粉末及其水提液中羥基紅花黃色素A含量測定結果如表1 所示，統計學分析表明，輻照前后紅花粉末羥基紅花黃色素A含量無顯著變化；與輻照前相比，輻照后紅花水提液羥基紅花黃色素A 含量明顯下降，其中6、8、10 kGy組均具有顯著性差異。

表1 不同輻照劑量對紅花中羥基紅花黃色素A含量的影響（n=2）Table 1 Content of hydroxysafflor yellow A before and after irradiation of safflower powder and safflower aqueous extract （n=2）

圖4 不同輻照劑量下紅花粉末高效液相色譜圖Fig.4 High performance liquid chromatography of safflower powder under different irradiation doses

圖5 不同輻照劑量下紅花水提液高效液相色譜圖Fig.5 High performance liquid chromatography of safflower aqueous extract under different irradiation doses

2.5 微生物限度變化

輻照前紅花粉末和紅花水提液微生物限度均不符合《中華人民共和國藥典》2020 年版四部通則中非無菌藥品微生物限度標準（細菌總數≤2×103CFU·g-1，霉菌和酵母菌總數≤200 CFU·g-1，控制菌大腸埃希菌不得檢出）［29］。輻照后細菌總數、霉菌和酵母菌總數均顯著下降（P＜0.05），分別采用6 kGy和4 kGy輻照劑量輻照時，紅花粉末和紅花水提液霉菌和酵母菌總數及大腸菌群總數達到藥典規定標準，但細菌總數仍很高，當輻照劑量為10 kGy 時，紅花粉末和水提液細菌總數達到藥典規定水平（表2）。

表2 不同輻照劑量對紅花微生物限度的影響（n=2）Table 2 Effect of different irradiation doses on microbial limit of safflower（n=2）

3 討論

3.1 電子加速器輻照對紅花及其水提液定性指標的影響

中藥材的質量變化情況通常從性狀顯微、薄層鑒別三個方面進行初步定性判斷。性狀是考察藥材質量變化最直觀的指標，顯微鑒別可以確定藥材固有的組織、細胞、內含物特征，薄層鑒別可以對藥材的主要化學成分進行定性比對。但中藥材的成分復雜，尤其是含有淀粉、揮發油、蛋白質等物質的中藥材性狀、顯微等定性指標易在加工炮制、熱滅菌等過程中發生顯著變化。輻照滅菌技術最大的優勢在于滅菌過程中不改變藥材的溫度，屬于一種冷滅菌技術，對藥材的性狀等定性指標影響較小。本研究表明，電子加速器輻照后，紅花及其水提液性狀、顯微、薄層鑒別均無明顯改變，符合電子束輻照作用溫和、無殘留的特點。

3.2 電子加速器輻照對紅花及其水提液有效成分含量變化的影響

紅花及其相關制劑的滅菌方式一般采用濕熱滅菌，但紅花中的羥基紅花黃色素A 在受熱和堿性條件下極不穩定，會降解成對羥基苯甲醛和對羥基肉桂酸［34］。羥基紅花黃色素A 的不穩定性可能與其分子結構中所含的官能團有關，羥基、羧基等基團的存在導致黃酮類的B 環與A 環脫離，從而降低了羥基紅花黃色素A 的穩定性［35］。本研究發現，經電子束輻照后，紅花粉末中羥基紅花黃色素A 含量未發生顯著變化，而紅花水提液中有效成分羥基紅花黃色素A含量整體顯著下降，其原因可能是在水溶液狀態下，電子束穿透性更高，高能電子束直接作用于細菌的遺傳物質結構達到殺菌的同時，使水發生電離產生具有強氧化性的氧離子［36］，增加了羥基紅花黃色素A 分子的不穩定性；而在干燥粉末狀態下，含水量較低，電子束穿透性降低，高能電子束殺菌的同時產生的氧離子較少，對羥基紅花黃色素A 分子的穩定性影響較小。此外，已有研究發現紅花醇提液經60Co 輻照滅菌后，羥基紅花黃色素A 含量發生了顯著變化［37］，這與本試驗結果一致。由此推斷，含紅花的水或乙醇提取物及以羥基紅花黃色素A為活性成分的水溶液或乙醇溶液制劑均不宜采用電子束、60Co輻照的方法進行滅菌。

3.3 電子加速器輻照對紅花及其水提液微生物的影響

紅花在田間種植、人工采摘、自然晾干、儲存等過程中容易被微生物污染，1997年衛生部發布的《60Co輻射中藥滅菌劑量標準》中將紅花列為允許輻照的中藥材品種之一［38］。輻照技術可以通過發射高能射線直接或間接作用于微生物的生物大分子，如核糖核酸、酶、蛋白質等，破壞其結構，從而達到抑制或殺死微生物的效果，具有廣譜性，但不同微生物對電離輻射的敏感性不同。本研究表明，與輻照前相比，4～10 kGy 輻照處理均能顯著降低細菌總數、霉菌和酵母菌總數，且輻照劑量與細菌總數、霉菌和酵母菌總數呈負相關，說明紅花及水提液中的微生物對電子束的敏感性較高。

4 結論

本研究結果表明，含紅花的水提物以及以羥基紅花黃色素A為活性成分的水溶液制劑不宜采用電子束輻照進行滅菌，而紅花粉末以及以羥基紅花黃色素A為活性成分的固體制劑可用電子束輻照進行滅菌，為紅花和含紅花制劑的輻照滅菌提供了參考依據。