基于激光促釋固相微萃取分析烏鱧不同部位揮發性成分

宋恭帥 王丹麗 袁婷蘭 李 玲 龔金炎

（浙江科技學院生物與化學工程學院，浙江省農產品化學與生物加工技術重點實驗室，浙江 杭州 310023）

烏鱧（Channa argus），俗稱黑魚、烏魚等，鱸形目鱧科鱧屬。烏鱧體色呈黑色，體側有不規則黑斑，廣泛分布于我國各大水系，是常見的淡水食用魚［1］。烏鱧營養豐富，含有人體所需的鈣、鐵等微量元素，且蛋白、脂肪含量高，具有較高的藥用和食用價值［1-2］。烏鱧因刺少、采肉率高且肉質細嫩鮮美而深受消費者喜愛，具有滋補調養、祛風治疳、生肌補血、促進傷口愈合等功效［3-4］。吳小東［5］研究發現，烏鱧魚膽中的牛黃膽酸鈉和牛黃鵝去氧膽酸鈉具有一定的抗炎活性。周朝偉等［6］通過對烏鱧進行營養成分分析，證明了其具有較高的營養價值。但作為一種經濟魚類，烏鱧各個部位在實際生產開發中均會產生不同程度的腥臭味，影響了其利用價值。

國內外對于烏鱧不同部位揮發性成分的研究較少，相關研究主要集中于魚肉保鮮［1，7］和高效養殖技術［8］方面。戶帥鋒等［7］以殼聚糖、山梨酸-殼聚糖微囊粉末及山梨酸為抗菌物質，制備出復合抗菌薄膜，延長了烏鱧貨架期。馬文慧等［4］分析測定了烏鱧魚片在貯藏過程中的品質變化，發現低溫處理能減緩凍藏過程中蛋白質和脂質劣變。吳紅霞［8］從多方面探討了烏鱧的養殖條件，發現與傳統養殖技術相比，綜合養殖技術的應用使烏鱧增產增效達30%。烏鱧不同部位揮發性成分會影響其利用價值，故需研究各部位揮發性成分的差異。

揮發性成分的分析包括成分收集與分析，目前較為常用的收集方法是頂空固相微萃取法（headspace solid phase microextraction，HS-SPME）［9］。然而傳統的HS-SPME 主要采用熱輔助解吸（heat assisted desorption，HAD），存在萃取時間較長、萃取頭使用壽命短等問題［10］。激光作為一種高質量的光源，因具有較好的方向性、單色性、相干性及亮度等特性而被廣泛應用于科學研究［11］。激光可有效促進樣品中揮發性成分的快速釋放，極大縮短了揮發性物質的釋放時間，從而有效提高了揮發性成分的萃取效率［12-13］。Song 等［12-13］建立了一種新型的激光照射解吸（laser irradiation desorption，LID）技術以取代HAD，使樣品中揮發性成分在較短時間內獲得釋放，整個分析過程高效、簡便且成本較低。因此，本研究采用新型的LID技術進行解吸，并進一步通過頂空固相微萃取-氣質聯用技術（headspace solid phase microextraction gas chromatography mass spectrometry，HS-SPME-GC/MS）分析鑒定烏鱧不同部位的揮發性成分，根據數理統計得到區分不同部位的重要成分，旨在為烏鱧的腥味研究和有效利用提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 材料

烏鱧，由浙江省水產質量檢測中心提供。

1.2 儀器與設備

Thermo Trace DSQ Ⅱ 氣相色譜與質譜聯用儀，美國Thermo Fisher Scientific 公司；二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷涂層萃取頭（50/30 μm），美國Supelco 公司；二極管激光器（最大允許輸出功率為50 W，最長工作波長為450 nm），長春鐳仕光電科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品制備 用220 V 的電壓將3 條體長（約25 cm）、體重（約2 000 g）大致相同的鮮活烏鱧電擊至暈，用刀取內臟和鰓，剝皮、取肉。分別從3條烏鱧身上各取內臟、鰓、肌肉和皮膚10 g 分裝入頂空瓶中，置于-4 ℃冰箱冷藏備用。

1.3.2 感官評定 隨機選取20 名經過相關培訓的評估人員（男女性人數相同）對不同部位的烏鱧樣品進行感官評價。根據樣品特性確定5 種感官指標，包括油脂味、青草味、堅果味、土腥味和魚腥味，并根據氣味強弱進行打分評定［12］。評分標準從很弱（-2 分）依次遞增至很強，共五個等級（-2、-1、0、1、2）。

1.3.3 頂空固相微萃取條件 將老化好的萃取頭插入進樣瓶頂空部分約2 mm，萃取溫度約50 ℃，待吸附完成后，取出萃取頭并立即插入GC 進樣口，于250 ℃條件下解吸3 min。

利用二極管激光器對烏鱧樣品進行照射，并分析激光照射功率、樣品添加量與照射時間3 個單因素對烏鱧樣品中揮發性風味物質萃取效果的影響。

1.3.4 GC/MS 檢測條件 GC 條件：HP-88 毛細管色譜柱（30 m × 0.25 mm，0.20 μm）；不分流進樣；進樣口溫度：250 ℃；載氣：高純氦氣；升溫程序：起始柱溫70 ℃，保持1 min，以4 ℃·min-1的速度升至180 ℃，保持5 min；再以3 ℃·min-1的速度升至230 ℃，保持5 min。

MS 條件：電子離子源溫度200 ℃；檢測器溫度280 ℃；傳輸線溫度250 ℃；電子能量70 eV；質量掃描范圍m/z30～500。

1.3.5 化合物定性分析 選取常見的己醛、1-戊烯-3-醇、壬醛等10 種標準品，基于保留指數和特征離子碎片等進行烏鱧樣品中揮發性成分的定性分析，剩余揮發性成分則通過相關譜庫（FFNSC1.3、NIST11s和NIST11）進行相似度檢索，并以正構烷烴的保留指數為基準，計算剩余揮發性成分的保留指數［14-16］。

1.4 數據處理

每組樣品重復測試3 次，所有試驗數據均以平均值±標準偏差表示，并采用SPSS 21.0 軟件對數據進行顯著性分析。采用SIMCA 14.1 軟件對數據進行化學計量統計。

2 結果與分析

2.1 感官評定結果

圖1 為烏鱧內臟、肌肉、皮及鰓4 個不同部位的特征氣味差異雷達圖。結果表明，烏鱧不同部位的氣味差異較為明顯。肌肉與鰓中魚腥味、油脂味和土腥味最強，這可能與烏鱧生活的環境有關。此外，在4 個部位中都含有較強的土腥味，這可能是由于烏鱧通過食物鏈攝入附有含土腥味細菌的藍藻、硅藻等浮游生物及部分水草。相比之下，內臟和皮中油脂味最弱，主要是由于這兩個部位的組織結構較為緊密，導致游離脂質的含量較少。

圖1 烏鱧不同部位感官評分雷達圖Fig.1 The radar chart of organoleptic scores for different parts of snakehead

2.2 激光照射條件對揮發性物質萃取效果的影響

激光能量的強弱與其照射功率的大小有關［14］。如圖2-A 所示，隨著照射功率的升高，己醛、己醇、1-辛烯-3-醇和壬醛的峰面積均呈現先增大后減小的趨勢，當照射功率為10 W 時，4 種特征揮發性成分的峰面積最大，說明該條件下的萃取效果最佳。功率過低時，內臟表面的溫度較低，其揮發性成分不能完全揮發出來；功率過高時，導致表面溫度過高，易使內臟發生化學變化而產生新的揮發性物質，故選擇10 W 為最佳激光照射功率。

圖2 照射功率（A）、樣品添加量（B）及照射時間（C）對揮發性成分萃取率的影響Fig.2 Effect of irradiation power （A），sample volume （B） and irradiation time （C） on the extraction efficiency of the selected characteristic compounds

在相同照射功率下，樣品添加量越大，升溫速率越慢，從而導致揮發性成分不易揮發。由圖2-B可知，在添加量為2～3 g時，樣品中揮發性成分的峰面積均隨添加量的增加而增大，添加量為3 g 時，各物質峰面積最大。之后，隨著樣品添加量的增加，各物質的峰面積均逐漸減小。因此，最佳樣品添加量為3 g。

在相同激光照射功率及樣品添加量下，照射時間越長，溫度變化越明顯。由圖2-C 可知，4 種特征揮發性物質的峰面積受照射時間影響較大。在3～5 min時，峰面積均隨照射時間的延長而增大，5 min 時各物質峰面積達到最大值，故選擇5 min 為最佳照射時間。

2.3 烏鱧不同部位揮發性成分分析

采用LID-HS-SPME-GC/MS 分別對烏鱧的內臟、鰓、肌肉和皮4 個部位進行揮發性成分的測定和分析，結果如表1 所示。4 個樣品中共檢出40 種揮發性成分，包括醛類13種、醇類7種、酮類2種、烴類7種、酯類2 種以及其他類9 種，其中17 種成分為4 個部位共有。由表1 還可以看出，烏鱧不同部位揮發性成分的種類和含量均有明顯差異。

表1 烏鱧內臟、肌肉、皮和鰓的揮發性成分Table 1 Volatile components of viscera，muscles，skin and gills of snakehead

醛類物質主要來源于不飽和脂肪酸的分解，感覺閾值相比其他物質低，即使微量也會對整體的氣味產生一定的影響，具有脂肪味、魚腥味、青草味等［17］。烏鱧體內共檢出13 種醛類物質，其中內臟10 種、肌肉10 種、皮9 種、鰓9 種。己醛和壬醛是含量最高的兩種物質，分別貢獻魚腥味、青草味和脂肪味、魚腥味、清香味，是烏鱧體內腥味的主要來源。己醛在肌肉中含量最高，為15.45 μg·kg-1；而壬醛在皮中的含量最高，為18.52 μg·kg-1，內臟中最低，僅為0.83 μg·kg-1。4 個部位中，肌肉和皮的醛類物質總含量較高，分別為33.64 和37.55 μg·kg-1，說明醛類對肌肉和皮氣味形成影響較大，可能是其腥臭味的主要來源［18-19］。

醇類物質一般由羰基化合物還原產生，可分為飽和醇與不飽和醇。不飽和醇的感覺閾值更低，對整體氣味的影響更大［20-21］。烏鱧體內共檢出7 種醇類物質，其中1-辛烯-3-醇是共有且含量最高的物質，在內臟、肌肉、皮、鰓中的相對含量分別為5.58、9.65、7.84、17.36 μg·kg-1，具有令人不愉快的土腥味；且醇類物質在鰓中的總含量最高（24.90 μg·kg-1），對鰓氣味的形成影響較大。土腥味是影響烏鱧口感的一個關鍵因素，而醇類物質是水產品中泥土味或者類似金屬味的主要來源［22-24］。

烴類物質在烏鱧體內檢出量較低但種類豐富，共有7種，其中乙苯、對二甲苯和2，6，10-三甲基-十六烷為4 個部位所共有。烴類主要是由脂肪酸烷基自由基的均裂產生，普遍閾值高，對烏鱧腥味的直接貢獻不大。但烯烴類在一些特定條件下會形成酮、醛，因此對大烏鱧腥味存在潛在影響［25］。另外，酮類、酯類物質種類少且相對含量較低，對整體的氣味影響不大。其他類中有幾種胺類物質，一般來說具有臭味，對烏鱧腥味特征的形成有一定貢獻［26］。

2.4 主成分分析

主成分分析（PCA）是多變量數據分析常用的方法，目的是了解觀測變量之間的相似性或差異性，為進一步分析提供參考［27-28］。本研究利用SIMCA 14.1 軟件進行PCA，對烏鱧4 個部位的共計40 種揮發性成分進行數據轉換和降維，取2個主成分，得到二維平面圖如圖3-A 所示（J 表示肌肉、N 表示內臟、P 表示皮、S 表示鰓）。第1主成分對解釋變量的貢獻最大，貢獻率為47.80%，第2主成分的貢獻率為27.70%。擬合度（R2）和預測能力（Q2）可用來評價模型的有效性［29］。通過計算可知，該模型的R2為92.30%，Q2為89.20%（大于50%），說明其具有良好的可靠性和預測性。36個烏鱧樣品被分為統計學意義的集群，即肌肉、內臟、皮和鰓，分布在不同區域。肌肉、內臟和其他兩個樣品明顯區分開，皮和鰓之間的距離相對較近，說明烏鱧不同部位的檢測變量（揮發性成分）存在一定差異性，而四組觀測變量之間的距離也反映了觀測變量或檢測變量的差異和相似程度。

圖3 多元統計分析Fig.3 Multivariate statistical analysis

圖3-B 為主成分載荷散點圖，在置信區間為95%的情況下，第1主成分中甲氧基苯肟、3，5，5-三甲基-2-己烯、苯甲醛、3-甲硫基-丙醛等揮發性成分所占比重較大，說明這些變量對于形成第1主成分的貢獻較大，結合表1表明這些物質在區分樣品中起到重要作用；同理，第2 主成分中4-甲基-5-癸醇、2-戊基呋喃、十二醛、己醛、戊醛等揮發性成分作用較大。PCA 距離圖（DModX）表示訓練集中的一個觀測值到模型平面或超平面的距離，與觀測值的剩余標準差成正比。DModX臨界值是由F分布計算而來，若觀測值是臨界值的2倍或以上，則認為是異常值。由圖3-C可知，本試驗所有觀測值均在臨界值以下，說明模型中數據有效可靠，不存在異常值，可進行正交偏最小二乘判別分析。

2.5 正交偏最小二乘判別分析

為確定烏鱧不同部位的特征氣味物質，本研究在PCA 基礎上進一步進行正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）。OPLS-DA 是不同于PCA 的一種有監督作用的判別分析統計方法，與偏最小二乘判別分析（partial least-square discriminant analysis，PLS-DA）相比，OPLS-DA 觀測變量矩陣中與預測變量矩陣中無關聯的“噪音”變量會被濾除，可更好地解釋觀測值并有效實現對相應變量的預測［30-31］。

對烏鱧4 個不同部位的36 個觀測變量和40 個檢測變量進行OPLS-DA 分析，累計R2X為95.50%，累計R2Y為97.80%，均接近于100%，且累計Q2為97.40%（大于50%），說明模型的擬合度和預測性較好。變量重要性投影值（variable importance for the projection，VIP）圖可總結各個變量的重要程度，一般地，VIP 值大于1的變量稱為重要變量，而小于0.5的則為不重要變量，介于1 和0.5 之間的為灰色區域［32］。圖3-D 中將各個變量的VIP 值從大到小進行了排列，共有7 個變量的VIP 值≥1，分別為壬醛、己醛、1-辛烯-3-醇、正己酸乙烯基酯、2-（氮雜環丙烷-1-基）乙胺、辛醛、3，5，5-三甲基-2-己烯。壬醛、己醛、1-辛烯-3-醇是排列前三的揮發性成分，與表1中的分析結果一致，說明這3 種物質是判別烏鱧不同部位的重要特征氣味物質，貢獻了魚腥味、青草味、脂肪味、油膩味、土腥味、蘑菇味等氣味特征，是烏鱧腥臭味的主要來源。

3 討論

水產動物中腥味物質的組成較為復雜，同一種原料不同部位的腥味組成會存在差異。本研究表明，烏鱧魚皮中腥味物質最多，而肌肉中相對較少，主要與魚類自身結構及生活環境有關，這與王國超等［33］報道的結果相一致。脂肪含量較高的魚體中往往含有更多的腥味物質，這是由于脂肪分解后易產生酮、醛類等揮發性物質。而脂肪分解所需的酶類及微生物更多地存在于魚皮及內臟中。淡水魚中含有較強的土臭味與泥土味，此外，水體中的某些藻類及放線菌又會加重魚體中的腥味。而這些腥味物質往往是先進入魚體內臟，再進入肌肉組織中。

目前，水產動物中腥味物質的評價方法主要包括感官評價及儀器檢測分析。感官評定是最方便、最直接的方法，但一般需要專業的感官評定者完成，其結果存在一定的主觀性。儀器檢測分析方法則是利用前處理技術與色譜質譜技術相結合來實現對樣品中揮發性成分的分析，其中HS-SPME-GC/MS 技術是最為常用的儀器分析方法。作者前期利用傳統的HS-SPMEGC/MS 測定了5 種不同提取方法制備的甲魚油中的揮發性成分，結果表明，需在60 ℃條件下吸附30 min，前處理時間較長［17］。而本試驗采用激光照射促釋技術僅需5 min，且離子強度相差不大，證明新型激光促釋技術結合固相微萃取能快速有效地測定烏鱧不同部位的揮發性成分。后續研究可嘗試將該技術應用于更多不同的樣品中。

4 結論

烏鱧4 個部位的揮發性成分種類和含量都有明顯不同，尤其是呈現魚腥味、土腥味的壬醛、己醛、1-辛烯-3-醇在4 個部位的含量差異較大。PCA 發現，4 個部位能明顯區分開，且模型中的數據有效可靠，沒有異常值，并證明了4 種樣品間有明顯差異；OPLS-DA 確定了壬醛、己醛、1-辛烯-3-醇為判別4 個部位最主要的氣味物質，貢獻了魚腥味、青草味、脂肪味、油膩味、土腥味、蘑菇味等，是烏鱧特征氣味的主要來源。