LncRNA MIAT靶向調節miR-532-3p對心力衰竭小鼠心肌細胞凋亡的影響

劉國斌,余謙,付國齊

(1.四川大學華西醫院金堂醫院/金堂縣第一人民醫院 心血管內科,四川 成都 610400; 2.成都市第五人民醫院心內科,四川 成都 611130)

心力衰竭(heart failure,HF)是心血管疾病的終末階段,在我國患病率呈上升趨勢,患者5年生存率較低,死亡率較高,HF的發病機制為心室重構,其病理基礎為心肌纖維化造成心肌細胞凋亡,因此,降低心肌凋亡對于改善HF患者癥狀有重要意義[1-2]。LncRNA可參與調控心肌肥大、纖維化和血管新生等HF的多個病理變化,其中,長鏈非編碼RNA心肌梗死相關轉錄本(lncRNA MIAT)在急性心肌梗死、冠心病等患者水平升高,研究顯示,lncRNA MIAT還可誘導心臟纖維化[3-5]。lncRNAs與miRNAs相互作用,可調控mRNA參與心血管疾病的發生[6]。本研究經Starbase分析顯示,LncRNA MIAT與miR-532-3p有互補結合序列,研究[7]顯示,miR-532-3p在HF中表達水平降低,過表達miR-532-3p可顯著降低異丙腎上腺素誘導的心肌細胞損傷與凋亡。但LncRNA MIAT是否靶向調節miR-532-3p影響HF小鼠的心肌細胞凋亡尚未見報道,本研究通過構建HF小鼠模型,探究lncRNA MIAT對心肌細胞凋亡的影響及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 動物

健康雄性C57BL/6小鼠,12～16周,體質量為24～26 g,購于四川省中醫藥科學院,許可證號為SCXK(川)2018-19。

1.2 主要試劑

1.3 方法

1.3.1 造模及分組 本研究經本院動物福利倫理委員會批準,根據參考文獻[8],采用注射阿霉素法建立HF小鼠模型,小鼠適應性飼養1周后,腹腔注射7 mg·kg-1阿霉素,Sham組注射等量生理鹽水,每周1次,連續給藥8周,心臟彩超檢測小鼠心功能指標,左心室射血分數(LVEF)<60%則為造模成功。

造模后將小鼠分為Sham組、HF組、sh-NC組、sh-MIAT組、sh-MIAT+anti-NC組、sh-MIAT+anti-miR-532-3p組,另設置空白對照組(Control組),每組10只,其中sh-NC組、sh-MIAT組、sh-MIAT+anti-NC組、sh-MIAT+anti-miR-532-3p組小鼠尾靜脈分別注射50 nmol·L-1相對應的質粒,每周2次,連續4周,Control組、Sham組、HF組尾靜脈注射等量生理鹽水。

1.3.2 小鼠心功能指標檢測 末次給藥24 h后腹腔注射戊巴比妥麻醉小鼠,心臟彩超檢查心臟功能,記錄小鼠LVEF、左心室舒張末期內徑(LVDd)、左心室收縮末期內徑(LVDs)、左心室短軸縮短率(FS)等心功能指標。

1.3.3 標本采集及心肌組織染色 麻醉處死小鼠,無菌條件下開胸取出心臟,一半組織生理鹽水沖洗后置于-80 ℃冰箱保存,另一半組織4%多聚甲醛固定,石蠟包埋后切片。將心肌組織切片脫蠟至水,分別進行HE染色和Masson染色,光學顯微鏡下觀察心肌組織病理學變化及纖維化。

1.3.4 心肌細胞凋亡檢測 取心肌組織切片脫蠟至水,根據TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒進行TUNEL染色,顯微鏡下觀察,陽性細胞呈棕色或褐色,計算細胞凋亡率。

1.3.5 心肌組織LncRNA MIAT、miR-532-3p檢測 Trizol試劑提取總RNA,RT-qPCR檢測小鼠心肌組織LncRNA MIAT、miR-532-3p水平。LncRNA MIAT上游引物序列5′-TGGAACAAGTCACGCTCGATT-3′,下游引物序列5′-GGTATCCCAAGGAATGAAGTCTGT-3′;miR-532-3p上游引物序列5′-ACACTCCCCTCCCACACCCAAGG-3′;下游引物序列5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′。反應體系共25 μl,其中SYBR Green Mix 15 μl,上下游引物各0.5 μl,cDNA模板1.0 μl,ddH2O 8 μl。PCR反應程序:95 ℃ 45 s;95 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s,38個循環。以GAPDH、U6為內參,采用2-ΔΔCT計算LncRNA MIAT、miR-532-3p的相對表達量。

1.3.6 LncRNA MIAT與miR-532-3p關系驗證 H9c2細胞接種于含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養基中,在溫度為37 ℃,體積分數為5%的CO2培養箱中培養,取對數生長期的細胞接種于6孔板中培養,待細胞貼壁生長至60%左右時,將LncRNA MIAT野生型(WT)和突變型(MUT)質粒與miR-NC、miR-532-3p minics共轉染H9c2細胞48 h,檢測細胞相對熒光素酶活性。

1.3.7 Western blot檢測小鼠心肌組織Caspase-3、collagenⅠ和collagen Ⅲ蛋白表達 心肌組織加入RIPA裂解液,勻漿后3 000 r·min-1離心15 min取上清,蛋白定量后取30 μg蛋白電泳并轉膜,加入Caspase-3(1∶1 500)、collagenⅠ(1∶1 000)和collagen Ⅲ(1∶1 000)一抗稀釋液,孵育過夜,再加入IgG二抗(1∶2 000)稀釋液,室溫孵育2 h,ECL溶液顯影,以β-actin為內參,分析蛋白相對表達。

(3)城市危險因素復雜多樣，風險評價過程中存在很大程度的隨機性和不確定性，云模型的應用則恰好的表達了風險的隨機性、不確定性和模糊性。構建城市災害綜合風險評價云模型，評價中將定性與定量指標綜合分析，以某市為例，評價該市的災害綜合風險等級為中等風險級別，以期為城市防災減災規劃提供理論依據。

1.4 統計學處理

2 結 果

2.1 造模結果

造模后HF組小鼠LVEF為(47.52±3.43)%,顯著低于Sham組的(81.23±5.26)%及Control組的(79.64±5.35)%(P<0.05),且LVEF均<60%,提示造模成功。

2.2 各組小鼠心功能指標比較

與Sham組比較,HF組小鼠LVDd、LVDs顯著升高,LVEF、FS顯著降低(P<0.05);與sh-NC組比較,sh-MIAT組小鼠LVDd、LVDs顯著降低,LVEF、FS顯著升高(P<0.05);與sh-MIAT+anti-NC組比較,sh-MIAT+anti-miR-532-3p組小鼠LVDd、LVDs顯著升高,LVEF、FS顯著降低(P<0.05),Control組與Sham組、sh-NC組與HF組、sh-MIAT組與sh-MIAT+anti-NC組之間各指標差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組小鼠心功能指標比較Tab 1 Comparison of cardiac function indexes of mice in each n=10)

2.3 各組小鼠心肌組織病理變化

HE染色結果顯示,Control組和Sham組小鼠心肌細胞結構完整,心肌纖維緊密,細胞排列整齊,間質無水腫,而經過造模后,HF組和sh-NC組小鼠心肌細胞腫脹,細胞排列紊亂,間質明顯水腫,有大量炎癥細胞浸潤,部分細胞核丟失(圖1箭頭所示),表明心肌組織損傷嚴重;轉染質粒后,sh-MIAT組和sh-MIAT+anti-NC組較HF組細胞腫脹減輕,細胞排列較為規則,細胞核增大,輕度水腫,心肌損傷有所減輕,而同時轉染sh-MIAT及miR-532-3p抑制劑后,sh-MIAT+anti-miR-532-3p組較sh-MIAT+anti-NC組病理損傷加重,細胞排列紊亂,細胞核凝縮,間質明顯水腫,大量炎癥細胞浸潤。見圖1。

箭頭示大量炎癥細胞浸潤,部分細胞核丟失,間質明顯水腫圖1 小鼠心肌組織HE染色(×200)Fig 1 HE staining of mouse myocardial tissue(×200)

2.4 各組小鼠心肌組織纖維化情況

Masson染色結果顯示,心肌細胞染色呈紅色,膠原纖維染色呈藍色(圖2箭頭所示),Control組和Sham組心肌纖維排列整齊、緊密,有少量膠原纖維,造模后HF組和sh-NC組心肌纖維排列紊亂,有大量心肌纖維顯示,表明造模后發生心肌纖維化,而轉染質粒后,sh-MIAT組和sh-MIAT+anti-NC組較HF組心肌纖維化減輕,膠原纖維明顯減少;sh-MIAT+anti-miR-532-3p組較sh-MIAT+anti-NC組心肌纖維化加重,可見大量藍色膠原纖維。見圖2。

箭頭表示膠原纖維圖2 小鼠心肌組織Masson染色(×200)Fig 2 Masson staining of mouse myocardial tissue(×200)

2.5 各組小鼠心肌細胞凋亡比較

TUNEL染色結果顯示,Control組和Sham組僅有少量心肌細胞凋亡,與Sham組比較,HF組小鼠心肌細胞凋亡率顯著升高(P<0.05);轉染質粒后,與sh-NC組比較,sh-MIAT組小鼠心肌細胞凋亡數顯著降低(P<0.05),同時轉染sh-MIAT+anti-miR-532-3p后,與sh-MIAT+anti-NC組比較,sh-MIAT+anti-miR-532-3p組小鼠心肌細胞胞凋亡率顯著升高(P<0.05);Control組與Sham組、sh-NC組與HF組、sh-MIAT組與sh-MIAT+anti-NC組之間心肌細胞凋亡率差異無統計學意義(P>0.05)。見圖3、表2。

圖3 TUNEL染色檢測小鼠心肌細胞凋亡(×200)Fig 3 Detection of myocardial cell apoptosis in mice by TUNEL staining(×200)

表2 各組小鼠心肌細胞凋亡率比較Tab 2 Comparison of apoptosis rates of myocardial cells in each n=10)

2.6 各組小鼠心肌組織Caspase-3、collagenⅠ和collagen Ⅲ蛋白表達的比較

與Sham組比較,HF組小鼠心肌組織Caspase-3、collagenⅠ和collagen Ⅲ蛋白表達水平顯著升高(P<0.05);與sh-NC組比較,sh-MIAT組小鼠心肌組織Caspase-3、collagenⅠ和collagen Ⅲ蛋白表達水平顯著降低(P<0.05);與sh-MIAT+anti-NC組比較,sh-MIAT+anti-miR-532-3p組小鼠心肌組織Caspase-3、collagenⅠ和collagen Ⅲ蛋白表達水平顯著升高(P<0.05),Control組與Sham組、sh-NC組與HF組、sh-MIAT組與sh-MIAT+anti-NC組之間Caspase-3、collagenⅠ和collagen Ⅲ蛋白表達差異無統計學意義(P>0.05)。見圖4、表3。

A.Control組;B.Sham組;C.HF組;D.sh-NC組;E.sh-MIAT組;F.sh-MIAT+anti-NC組;G.sh-MIAT+anti-miR-532-3p組圖4 Western blot檢測小鼠心肌組織Caspase-3、collagenⅠ和collagen Ⅲ蛋白表達Fig 4 Expressions of Caspase-3, collagen Ⅰ and Ⅲ in mouse myocardial tissue detected by Western blot

表3 各組小鼠心肌組織Caspase-3、collagenⅠ和collagen Ⅲ蛋白表達的比較Tab 3 Comparison of protein expressions of Caspase-3, collagen Ⅰ and Ⅲ in myocardial tissue of mice in each n=10)

2.7 各組小鼠心肌組織LncRNA MIAT、miR-532-3p表達比較

與Sham組比較,HF組小鼠心肌組織LncRNA MIAT表達水平顯著升高,miR-532-3p表達水平顯著降低(P<0.05);與sh-NC組比較,sh-MIAT組小鼠心肌組織LncRNA MIAT表達水平顯著降低,miR-532-3p表達水平顯著升高(P<0.05);與sh-MIAT+anti-NC組比較,sh-MIAT+anti-miR-532-3p組小鼠心肌組織miR-532-3p表達水平顯著降低(P<0.05),LncRNA MIAT表達水平差異無統計學意義(P>0.05);Control組與Sham組、sh-NC組與HF組、sh-MIAT組與sh-MIAT+anti-NC組之間LncRNA MIAT、miR-532-3p表達差異無統計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 各組小鼠心肌組織LncRNA MIAT、miR-532-3p表達比較Tabl 4 Comparison of LncRNA MIAT and miR-532-3p expression in myocardial tissue of mice in each n=10)

2.8 LncRNA MIAT與miR-532-3p相互關系

Starbase分析顯示LncRNA MIAT與miR-532-3p有互補結合序列,雙熒光素酶報告基因檢測結果顯示,LncRNA MIAT野生型質粒與miR-532-3p minics共轉染H9c2細胞后,熒光素酶活性顯著降低(P<0.05),見圖5。

a 與miR-NC比較,P<0.05A．LncRNA MIAT與miR-532-3p靶向預測;B.雙熒光素酶活性檢測結果圖5 LncRNA MIAT與miR-532-3p靶向驗證Fig 5 Targeting verification of LncRNA MIAT and miR-532-3p

3 討 論

HF是由多種原因引起心肌結構與功能的改變,對患者造成不良影響,其死亡率高,預后較差,從分子水平研究HF發病機制,對HF的靶向治療具有重要意義[9]。HF的病理基礎為心室重構,主要表現為心肌纖維化、心肌細胞肥大[10]。本研究采用注射阿霉素法建立HF小鼠模型,造模后小鼠LVDd、LVDs顯著升高,LVEF、FS顯著降低;HE染色顯示小鼠心肌細胞腫脹,細胞排列紊亂,間質明顯水腫,有大量炎癥細胞浸潤,部分細胞核丟失;Masson染色顯示心肌纖維排列紊亂,可見大量心肌纖維;TUNEL染色結果顯示小鼠心肌細胞凋亡增多,與牛歡等[8]報道相似,提示造模成功。

LncRNA在心臟發育與HF中發揮重要調控作用,通過參與調控炎癥、氧化應激、心肌肥大、心肌纖維化、凋亡等多種機制與HF的發生密切相關[11-12]。LncRNA MIAT與冠心病、HF的發生有關,研究[13]顯示,LncRNA MIAT在心房顫動患者血清表達水平升高,體外與體內實驗顯示富含LncRNA MIAT血清來源的胞外囊泡能促進心房纖維化、炎癥和氧化應激,加重心房重構,導致房顫。Zhao等[14]研究顯示,在HF大鼠模型中,沉默LncRNA MIAT可能通過PI3K/Akt信號通路改善心肌纖維化,緩解HF。本研究結果顯示,HF小鼠模型注射sh-MIAT后,與sh-NC組比較,sh-MIAT組小鼠LVDd、LVDs顯著降低,LVEF、FS顯著升高,HE染色顯示細胞腫脹減輕,細胞排列較為規則,細胞核增大,輕度水腫,提示抑制LncRNA MIAT表達可顯著改善HF小鼠心功能及心肌損傷。心肌纖維化是心臟重塑的主要表現,其病理改變表現為纖維蛋白增生和各種膠原的失衡,collagenⅠ和collagen Ⅲ為主要心肌膠原蛋白,其水平增加導致膠原重塑,使心室舒張與收縮功能受損[15]。本研究中HF小鼠模型注射sh-MIAT后,與sh-NC組比較,Masson染色顯示sh-MIAT組小鼠心肌纖維化減輕,膠原纖維明顯減少,Western blot結果顯示collagenⅠ和collagen Ⅲ蛋白表達水平顯著降低,提示抑制LncRNA MIAT表達可抑制HF心肌纖維化和膠原重塑。心肌細胞凋亡是HF的特征之一,Caspase-3是細胞凋亡最后的執行者,本研究還顯示,給予HF小鼠sh-MIAT治療后,心肌細胞凋亡率降低,心肌組織Caspase-3表達水平降低,提示抑制LncRNA MIAT表達可抑制HF引起的心肌細胞凋亡。

lncRNAs通過調控miRNA表達進而調控下游靶基因參與心血管疾病的發生,如LncRNA MIAT可通過調控miR-214-3p表達,促進糖尿病心肌病炎癥反應和心肌纖維化[16]。本研究經Starbase分析及雙熒光素酶報告基因實驗證實,LncRNA MIAT可靶向負調控miR-532-3p表達。miR-532-3p在腫瘤領域研究較多,可調控細胞增殖分化等,還與心血管疾病的發生有關,研究顯示,miR-532-3p可通過靶向調控粒細胞巨噬細胞集落刺激因子2(GM-CSF)受體α亞基參與動脈粥樣硬化斑塊形成的調節,促進動脈粥樣硬化血栓形成[17]。研究顯示,miR-532-3p為內皮細胞向間質轉化的正向調節因子,能抑制蛋白酶絲氨酸23表達,在急性心肌梗死中減輕心臟損傷[18]。本研究結果顯示,HF小鼠心肌組織LncRNA MIAT表達水平升高,miR-532-3p表達水平降低,anti-miR-532-3p與sh-MIAT共同治療HF小鼠后,可顯著逆轉sh-MIAT對HF小鼠心肌損傷的保護作用,提示抑制LncRNA MIAT表達可通過靶向調控miR-532-3p表達改善HF小鼠的心功能及心肌損傷,降低心肌細胞凋亡。

綜上所述,HF小鼠心肌組織LncRNA MIAT表達水平升高,抑制LncRNA MIAT表達,可通過靶向上調miR-532-3p表達改善HF引起的小鼠心肌損傷,降低心肌細胞凋亡。