LncRNA TUG1靶向調節(jié)miR-21/PTEN軸抑制糖尿病腎病大鼠腎纖維化的作用機制研究

陳生曉,甘艷,鄺才花,張蕾,符大天

(1.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第928醫(yī)院 腎病風濕科,海南 海口 571159; 2.海南省婦女兒童醫(yī)學中心藥劑科,海南 ?？?571159; 3.海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 藥學部,海南 ?？?570102)

糖尿病腎病(DN)是1型和2型糖尿病(T1DM和T2DM)的一種常見并發(fā)癥,對公眾健康構成相當大的威脅[1-2]。DN是慢性腎病的主要原因,顯著增加了糖尿病患者的死亡率。DN的組織形態(tài)學異常包括早期腎小球肥大、腎小球基底膜增厚、足細胞耗竭、系膜基質擴張和腎小管損傷[3]。晚期的腎臟改變包括腎小球硬化和腎小管間質纖維化,臨床上以腎功能喪失為特征,伴有或不伴有白蛋白尿,并發(fā)展為終末期腎病(ESRD)。目前對DN患者的治療方式主要是嚴格控制血糖和降壓/降脂治療,這些干預措施并不能阻止患者的腎臟病理變化[4]。因此,迫切需要了解DN進展的基本機制。

長鏈非編碼RNAs(LncRNAs)是一種200 nt長的非編碼RNA,不具有蛋白質編碼能力。研究表明,LncRNAs在DN的發(fā)展中起著至關重要的作用[5]。Liu等[6]研究指出,過表達LncRNA PVT1通過FOXA1途徑抑制足細胞損傷和凋亡,從而抑制DN的疾病進程。Zhang等[7]研究指出,LncRNA Rpph1通過與Gal-3的相互作用促進DN的炎癥和系膜細胞增殖。LncRNA TUG1是DN的一個生物標志物。LncRNA TUG1位于人類染色體22q12.2上,在多種人類癌癥中扮演著致癌基因的作用。有研究[8]指出,LncRNA TUG1通過提高PGC-1α表達從而減輕DN的組織學損害。lncRNA TUG1在DN的進展中發(fā)揮了重要作用。研究[9]發(fā)現(xiàn),LncRNA TUG1可以調節(jié)線粒體生物能量,并通過調節(jié)miR-377靶向過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARγ)來緩解DN的細胞外基質(ECM)積累。然而,lncRNA TUG1在DN的腎臟纖維化中的作用仍不清楚。MicroRNA(miRNA)是一種分子量較小的非編碼單鏈RNA,與靶基因的3′非翻譯區(qū)(3′UTR)結合,使靶基因降解或阻止其翻譯成蛋白質[10]。研究[11]證實,大量的miRNAs例如miR-192、miR-200c、miR-217參與了DN的發(fā)病機制。研究表明,miR-21通過靶向磷酸酯酶與張力蛋白同源物(PTEN)基因激活磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶(PI3K/Akt)信號通路,導致腎臟纖維化蛋白Col1α2、纖連蛋白異常表達和腎小球異常肥大。本研究應用鏈脲佐菌素構建DN大鼠模型,旨在探索LncRNA TUG1 在DN大鼠腎纖維化中的作用及其潛在分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

8周齡SPF級SD(Sprague-Dawley)雄性大鼠,體質量220～240 g[由海南藥物研究所有限責任公司提供,生產許可證號:SCXK(瓊)2020-0007]。腎小球系膜細胞HBZY-1細胞系(美國ATCC細胞庫);FBS、RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco,美國);CCK-8溶液(多金多分子技術有限公司,美國馬里蘭州羅克維爾);RIPA裂解緩沖液(碧云天生物技術有限公司,中國上海);BCA蛋白測定試劑盒、TRIzol試劑、cDNA合成試劑盒、ABI 7500實時PCR系統(tǒng)(賽默飛世爾科技公司,美國);增強型化學發(fā)光試劑(默克公司,德國);GAPDH(Abcam公司,英國);SYBR-Green PCR試劑盒(東洋紡生物科技有限公司, 日本)。本研究經(jīng)中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第928醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 細胞培養(yǎng)

含有20% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)HBZY-1細胞,應用30 mmol·L-1葡萄糖構建HBZY-1細胞系的誘導模型。

1.3 DN動物模型構建

動物飼養(yǎng)環(huán)境參照中華人民共和國國標GB14925-2010,溫度20～26 ℃(日溫差≤4 ℃),相對濕度40%～70%,人工照明,12 h明暗交替。大鼠動物模型構建如文獻[12]所示。將鏈脲佐菌素(STZ)溶解在0.1 mol·L-1檸檬酸緩沖液中,大鼠腹腔注射60 mg·kg-1STZ,1次·d-1,連續(xù)5 d,建立DN大鼠模型。血糖水平超過16.5 mmol·L-1被確定為成功的DN模型。將DN大鼠分為LncRNA TUG1過表達組和模型對照組(LncRNA-NC組)兩組。LncRNA TUG1過表達組大鼠尾靜脈注射200 μl慢病毒LV-TUG1;LncRNA-NC組大鼠尾靜脈注射200 μl的LV-NC。

1.4 CCK-8實驗方法

使用CCK-8實驗檢測各種處理方法對細胞活力的影響。對數(shù)生長期的HBZY-1細胞以5×104個·(100 μl)-1的密度接種至96孔板中,在含有5% CO2的培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h,吸去培養(yǎng)基后加入10 μl CCK-8溶液孵育4 h,使用酶標儀在450 nm測定每組細胞的吸光度,并使用Graphpad prism軟件繪制細胞增殖曲線。

1.5 Western blot試驗方法

細胞和組織樣本在RIPA裂解緩沖液中裂解,并使用BCA蛋白測定試劑盒檢測蛋白濃度。30 μg·孔-1的總蛋白上樣后應用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進行分離,并應用濕轉法轉移至PVDF膜上。在室溫下用5%的BSA溶液封閉1 h,加入一抗在4 ℃下孵育過夜。將膜與相應的山羊抗兔二抗在室溫下孵育2 h,并通過化學發(fā)光法進行檢測。使用增強型化學發(fā)光試劑對蛋白質進行可視化,GAPDH作為內部參照。

1.6 實時熒光定量逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-qPCR)試驗方法

通過RT-qPCR測定細胞和組織樣本中的LncRNA TUG1、miR-21以及纖維化相關指標。使用TRIzol試劑從組織和細胞中提取總RNA并逆轉為cDNA,應用SYBR-Green PCR試劑盒在ABI 7500實時PCR系統(tǒng)進行qPCR。熱循環(huán)條件如下:95 ℃預變性5 min,95 ℃變性5 s,60 ℃退火30 s(40個循環(huán)), 2-ΔΔct法計算實驗結果。引物見表1。

表1 引物序列Tab 1 Primer Sequence

1.7 蘇木精-伊紅(HE)染色

HE染色評估腎臟組織的形態(tài)變化。將腎組織固定在4%多聚甲醛中,石蠟包埋后按照標準程序切成5 μm切片進行HE染色,在顯微鏡下對切片的5個隨機區(qū)域進行拍照。

1.8 雙熒光素酶報告基因實驗方法

將WT或MUT LncRNA TUG1結合位點亞克隆到pCDNA3.1質粒。HBZY-1細胞在轉染前24 h在24孔板中進行電轉,miR-21 mimic、miR-221mimic和相應的對照物與10 μg的pCDNA3.1-WT-TUG1或pCDNA3.1-MUT-TUG1共同轉染。雙熒光素酶報告基因測定系統(tǒng)檢測熒光素酶活性。

1.9 統(tǒng)計學處理

采用統(tǒng)計軟件SPSS 20.0對數(shù)據(jù)進行分析,計數(shù)資料以均數(shù)±標準差表示,兩組間的比較采用t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。多組間的比較將各項指標數(shù)據(jù)按下面的程序分析:用Levene’s檢驗方差齊性,如果沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05),用單因素方差分析(ANOVA)進行統(tǒng)計分析,如果 ANOVA 有統(tǒng)計學意義(P<0.05),用 LSD法進行全面的比較;如果方差不齊(P<0.05),則用Dunnett’s T3檢驗進行統(tǒng)計分析。

2 結 果

2.1 動物模型構建以及DN大鼠腎臟組織中LncRNA TUG1表達水平檢測

與對照組相比,DN模型大鼠的血糖、血肌酐、尿白蛋白水平均顯著上升(P<0.05),DN大鼠動物模型構建成功。RT-qPCR實驗結果顯示,與對照組相比,DN模型大鼠腎臟組織中LncRNA TUG1表達水平顯著降低(P<0.05),如圖1A所示。LncRNA表達譜芯片實驗結果顯示,DN大鼠腎臟組織中共有30個異常表達的LncRNA,其中LncRNA TUG1是最顯著上調的LncRNA,如圖1B所示。HE染色實驗結果顯示,與對照組相比,模型組大鼠腎臟組織形態(tài)學顯著改變,腎小球形狀不規(guī)則、體積增大,腎小球內細胞排列紊亂,腎小囊結構模糊,如圖1C所示。

a與對照組相比,P<0.05,n=10A.STZ處理8周后DN大鼠血糖、血肌酐、尿白蛋白、LncRNA TUG1表達水平檢測;B.熱圖以及火山圖展示DN大鼠腎臟組織中LncRNA表達譜的差異;C.HE染色檢測大鼠腎臟組織形態(tài)學圖1 DN大鼠模型構建驗證以及LncRNA TUG1表達水平檢測A.Detection of blood glucose, serum creatinine, urinary albumin and LncRNA TUG1 expression in DN rats after 8 weeks of treatment with streptozotocin; B.Heat map and volcano map show the difference of LncRNA expression profile in kidney tissue of DN rats; C.HE staining used to detect the histomorphology of rat kidneyFig 1 Verification of DN rat model construction and detection of LncRNA TUG1 expression

2.2 過表達LncRNA TUG1對DN大鼠腎臟組織纖維化的影響

RT-qPCR實驗結果顯示,與LncRNA-NC組相比,LncRNA TUG1過表達組大鼠腎臟組織中LncRNA TUG1表達水平上升,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),如圖2A所示。過表達LncRNA TUG1能夠顯著降低DN大鼠模型的尿白蛋白含量(P<0.05),如圖2B所示。RT-qPCR實驗結果顯示,過表達LncRNA TUG1降低了腎臟組織中纖維連接蛋白(FN)、人Ⅳ型膠原(Col-4)和轉化生長因子β1(TGFβ1)mRNA表達水平(P<0.05),如圖2C所示。HE染色結果顯示,與LncRNA-NC組相比,LncRNA TUG1過表達組大鼠腎臟組織形態(tài)學顯著改善,具體表現(xiàn)為腎小球內細胞較為整齊,腎小囊結構完整,輪廓清晰,如圖2D所示。Western blot實驗結果顯示,過表達LncRNA TUG1降低了腎臟組織中FN、Col-4和TGFβ1蛋白表達水平(P<0.05),如圖2E所示。過表達LncRNA TUG1能夠顯著降低DN大鼠腎臟組織纖維化水平,抑制DN的病理進程。

a 與LncRNA-NC組比較,P<0.05,n=10A.RT-qPCR實驗檢測LncRNA-NC組與LncRNA TUG1過表達組大鼠腎臟組織中LncRNA TUG1表達差異; B.LncRNA-NC組和LncRNA TUG1過表達組大鼠尿蛋白檢測; C.RT-qPCR檢測過表達LncRNA TUG1對腎臟組織中FN、Col-4和TGFβ1 mRNA表達水平的影響; D.HE染色檢測LncRNA-NC組與LncRNA TUG1過表達組大鼠組織學差異; E.Western blot檢測過表達LncRNA TUG1對腎臟組織中FN、Col-4和TGFβ1蛋白表達水平的影響圖2 過表達LncRNA TUG1對DN大鼠腎臟組織纖維化的影響A.Difference of LncRNA TUG1 expression in kidney tissues of rats in LncRNA-NC group and LncRNA TUG1 overexpression group detect by RT-qPCR; B.Detection of urine protein of rats in LncRNA-NC group and LncRNA TUG1 overexpression group; C.The effect of overexpression LncRNA TUG1 on FN, Col-4 and TGFβ1 mRNA expression in kidney tissue detect by RT-qPCR; D.Histological differences of rats in the LncRNA-NC group and LncRNA TUG1 overexpression group detected by HE staining; E. The effect of overexpression of LncRNA TUG1 on FN, Col-4 and TGF β1 protein expression in kidney tissue detect by Western blotFig 2 Effects of overexpression of LncRNA TUG1 on renal fibrosis in DN rats

與LncRNA-NC組相比,過表達LncRNA TUG1能夠顯著下調miR-21表達水平(P<0.05),促進PTEN蛋白表達(P<0.05),并顯著降低磷酸化磷脂肌醇3激酶(p-PI3K)及磷酸化蛋白激酶(p-Akt)蛋白表達水平(P<0.05),如圖3所示。

a與LncRNA-NC組相比,P<0.05A.RT-qPCR實驗檢測大鼠腎臟組織中miR-21表達水平;B. Western blot實驗檢測大鼠腎臟組織中PTEN、PI3K、Akt蛋白表達水平圖3 過表達LncRNA TUG1對PI3K/Akt信號通路的影響A.The expression level of miR-21 in rat kidney tissue detected by RT-qPCR;B.The expression level of PTEN, PI3K and Akt proteins in rats kidney tissue detected by Western blotFig 3 Effects of overexpression of LncRNA TUG1 on PI3K/Akt signaling pathway

2.3 LncRNA TUG1與miR-21的相互作用

LncBase(https:∥diana.e-ce.uth.gr/lncbasev3)預測發(fā)現(xiàn)miR-21是LncRNA TUG1的潛在作用靶點。圖4A顯示了LncRNA TUG1與miR-21的直接結合情況。Pearson相關分析指出,在DN大鼠腎臟組織中,LncRNA TUG1表達水平與miR-21表達水平呈負相關,與PTEN mRNA表達水平呈正相關,如圖4B、C所示。雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示,在腎小球膜細胞HBZY-1細胞系中,miR-21抑制了LncRNA TUG1野生型報告基因的熒光素酶活性,然而突變型報告基因的熒光素酶活性未被miR-21抑制,如圖4D所示。

a P<0.05A.LncBase生物信息軟件預測LncRNA TUG1與miR-21的直接結合情況; B.LncRNA TUG1表達水平與PTEN mRNA的相關性; C.LncRNA TUG1表達水平與miR-21的相關性;D.雙熒光素酶報告基因實驗檢測LncRNA TUG1與miR-21的直接作用關系圖4 LncRNA TUG1與miR-21的相互作用A.LncBase bioinformatics software predicts the direct combination of LncRNA TUG1 and miR-21; B.The correlation between LncRNA TUG1 expression level and PTEN mRNA; C.The correlation between LncRNA TUG1 expression level and miR-21; D.The direct interaction between LncRNA TUG1 and miR-21 detected by fluorescein reporter experimentFig 4 Interaction between LncRNA TUG1 and miR-21

2.4 過表達LncRNA TUG1對HBZY-1細胞增殖及纖維化蛋白表達水平的影響

RT-qPCR實驗結果顯示,在高糖誘導下的HBZY-1細胞中,LncRNA TUG1表達水平顯著升高(P<0.05),miR-21表達水平顯著降低(P<0.05),纖維化相關指標FN、Col-4和TGFβ1表達水平顯著升高(P<0.05)。過表達LncRNA TUG1能夠顯著上調miR-21表達水平(P<0.05),抑制FN、Col-4和TGFβ1 mRNA表達水平(P<0.05),如圖5A所示。

a與對照組相比,P<0.05A.RT-qPCR檢測不同處理方式對HBZY-1細胞LncRNA TUG1、miR-21、FN、Col-4和TGFβ1表達的影響;B.CCK-8實驗檢測不同處理方法對HBZY-1細胞的增殖能力的影響圖5 過表達LncRNA TUG1對HBZY-1細胞增殖以及纖維化蛋白表達的影響A.The effects of different treatment methods on LncRNA TUG1, miR-21, FN, Col-4 and TGFβ1 in HBZY-1 cells detect by RT-qPCR;B.The effects of different treatment methods on the proliferation of HBZY-1 cells detect by CCK-8 testFig 5 Effects of overexpression of LncRNA TUG1 on the proliferation of HBZY-1 cells and the expression of fibrosis protein

CCK-8實驗結果顯示,與對照組相比,高糖誘導下的HBZY-1細胞的增殖能力顯著升高(P<0.05)。與高糖誘導組相比,過表達LncRNA TUG1能夠顯著抑制HBZY-1細胞的增殖能力(P<0.05),如圖5B所示。

2.5 miR-21 mimic對過表達LncRNA TUG1的抗增殖以及抗纖維化作用的影響

RT-qPCR實驗結果顯示,與過表達LncRNA TUG1+miR-con組相比,過表達LncRNA TUG1+miR-21 mimic組細胞中miR-21表達水平顯著升高(P<0.05),FN、Col-4和TGFβ1 mRNA表達水平顯著升高(P<0.05),如圖6A所示。CCK-8實驗結果顯示,與過表達LncRNA TUG1+miR-con組相比,過表達LncRNA TUG1+miR-21 mimic組細胞增殖能力顯著升高(P<0.05),如圖6B所示。結果顯示miR-21 mimic抑制過表達LncRNA TUG1的抗增殖以及抗纖維化效應。Western blot實驗結果表明,與過表達LncRNA TUG1+miR-con組相比,過表達LncRNA TUG1+miR-21 mimic組細胞中PTEN蛋白表達水平顯著降低(P<0.05),而p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白表達水平顯著升高(P<0.05),如圖6C所示。

a與LncRNA TUG1+miR-21 mimic組相比,P<0.05A.RT-qPCR檢測不同處理方式對HBZY-1細胞miR-21、FN、Col-4和TGFβ1表達水平的影響;B.CCK-8實驗檢測不同處理方法對HBZY-1細胞增殖能力的影響;C.Western blot實驗檢測不同處理方法對HBZY-1細胞中PTEN、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白表達水平的影響圖6 miR-21 mimic對過表達LncRNA TUG1的抗增殖以及抗纖維化作用的影響A.The effects of different treatment methods on miR-21, FN, Col-4 and TGF β 1 in HBZY-1 cells detected by RT-qPCR; B. The effects of different treatment methods on the proliferation of HBZY-1 cells detected by CCK-8 test; C.The effects of different treatment methods on the expression levels of PTEN, p-PI3K/PI3K and p-Akt/Akt proteins in HBZY-1 cells detected by Western blotFig 6 Effects of miR-21 mimic on anti proliferation and anti fibrosis of overexpression LncRNA TUG1

3 討 論

越來越多的研究表明,lncRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡是轉錄后基因調控的核心調節(jié)機制。例如,LncRNA H19通過作為miR-199a-5p的分子海綿,上調VEGF A以增強間充質干細胞的生存和血管生成能力[13]。LncRNANEAT1通過靶向miR-132來調節(jié)膠質瘤細胞中的SOX2表達,從而抑制細胞侵襲[14]。此外,miRNAs是DN發(fā)展過程中的重要調節(jié)因子。Liu等[15]研究指出,BMP-7通過調節(jié)miR-21/Smad7信號傳導抑制DN的腎臟纖維化。Zhou等[16]研究結果顯示,miR-21的下調通過靶向TIMP3抑制了STZ誘導的DN大鼠疾病進程,并且在高糖處理的足細胞中抑制其凋亡。Guo[17]研究結果顯示,miR-21通過PTEN/Akt信號通路調控納米二氧化硅誘導的DN大鼠腎臟纖維化。本研究生物信息學分析結果顯示,MiR-21是LncRNA TUG1的一個潛在靶點。雙熒光素酶報告基因實驗進一步指出,LncRNA TUG1以序列特異的方式與miR-21發(fā)生直接作用。Wang等[18]研究結果指出,LncRNA TUG1通過抑制miR-21促進TIMP3的表達來改善DN。Li等[19]研究結果顯示,LncRNA TUG1通過調節(jié)miRNA-21/PTEN軸促進血管平滑肌細胞的增殖和動脈硬化。

FN、Col-4和TGFβ1是纖維化的常見指標,TGF-β1為強致纖維化因子,與腎纖維化密切相關,Smads為TGF-β1下游靶分子。周靖等[20]發(fā)現(xiàn),下調大鼠腎組織TGF-β1可使Smads蛋白的磷酸化水平降低,從而改善大鼠腎臟纖維化。本研究通過CCK8和RT-qPCR實驗探討LncRNA TUG1對腎小球系膜細胞HBZY-1的增殖以及纖維化的影響。結果顯示,過表達LncRNA TUG1顯著抑制了HBZY-1細胞的增殖以及纖維化指標FN、Col-4和TGFβ1的表達。同時,LncRNA TUG1和PTEN相關研究結果顯示,LncRNA TUG1和PTEN在invivo水平的表達呈正相關。PI3K是一種細胞內磷脂酰肌醇激酶,具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性。Akt是一種蛋白激酶,也叫蛋白激酶B(PKB)。PI3K首先被酪氨酸激酶激活,將磷脂酰肌醇4,5-二磷酸酯(PIP2)轉化為磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸酯(PIP3),促進Akt在質膜上的積累。然后,Akt的Thr308在3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1(PDK1)的協(xié)助下被磷酸化[21]。最后,被激活的Akt可以在多種生理過程中發(fā)揮其生物功能,包括細胞增殖、分化、凋亡、遷移和代謝。大量的研究已經(jīng)探索了DN腎纖維化與PI3K/Akt信號通路的相關關系。Chen等[22]研究指出,PI3K/Akt的激活參與了高糖條件下誘發(fā)的腎小管間質纖維化。Li等[23]發(fā)現(xiàn)在HK2細胞中敲除SHIP導致PI3K/Akt通路的激活,隨后上調了TGF-β1、α-SMA和collagen type 3的表達。此外,Zhu等[24]還發(fā)現(xiàn),在STZ誘導的糖尿病小鼠和體外人類腎小管上皮細胞中,高糖條件下磷酸化Akt(Ser 473)、磷酸化Akt(Thr 308)、CTGF和α-SMA的水平都有所提高,應用PI3K/Akt信號轉導途徑的抑制劑LY294002能夠顯著抑制CTGF、fibronectin和膠原蛋白的含量。本研究結果顯示,過表達LncRNA TUG1通過抑制miR-21表達上調PTEN表達,并可能通過抑制PI3K/Akt信號通路從而抑制DN大鼠腎纖維化。

綜上所示,我們的研究指出LncRNA TUG1是DN疾病進程中的一個重要的調控因子。LncRNA TUG1通過分子海綿作用調控miR-21,隨后調節(jié)PTEN的表達來抑制DN的腎臟纖維化。這個LncRNA TUG1/miR-21/PTEN途徑可能在DN的發(fā)展中扮演重要的角色,并可能成為DN的一個治療靶點。