難治性肺炎支原體肺炎患兒外周血TIM-3及其配體Galectin-9表達水平及意義

李偉,付建平,張國慶,聶雯,向守珍

(重慶開州婦幼保健院1.兒科,2.檢驗科,重慶 開州 405499)

肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae,MP)是學齡兒童、青少年及年輕人肺部感染中最為常見的病原體[1]。近些年來,在引起社區獲得性肺炎的病原體中,MP占比越來越大,其相關的難治性肺炎支原體肺炎(refractory Mycoplasma pneumoniae pneumonia,RMPP)的發生率在國內外不斷上升[2]。RMPP患兒早期主要表現為咳嗽、發熱等呼吸道感染癥狀,若不及早預防和治療,將進一步引發慢性咳嗽和哮喘病癥,出現肺外多臟器損害,嚴重時甚至可造成死亡[3]。因此,早期預估RMPP發生風險、制定針對性防御措施對降低RMPP發病率及改善預后有重要意義。T細胞免疫球蛋白黏蛋白分子3(T cell immunoglobulin mucin molecule 3,TIM-3)是Th1細胞表面特異性表達的Ⅰ型跨膜蛋白,可特異性結合Treg細胞表面表達的半乳糖凝集素-9(Galectin-9),二者結合后可抑制T細胞增殖,調控免疫應答反應[4-5]。研究顯示,TIM-3、Galectin-9在肺結核患者血清中表達水平明顯升高[6]。然而目前關于TIM-3、Galectin-9在RMPP中的表達情況仍缺少相關研究。本研究對120例RMPP患兒和109例普通肺炎支原體肺炎(general Mycoplasma pneumoniae pneumonia,GMPP)患兒進行血清TIM-3、Galectin-9水平測定,以期對RMPP的發病進行早期識別,進而為其治療及預后預測提供數據支持。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2020年1月至2021年12月我院兒科收治的120例RMPP患兒為RMPP組,選取同期109例GMPP患兒為GMPP組。納入標準:(1) 患兒均經臨床確診,符合《兒童肺炎支原體肺炎診治專家共識(2015年版)》[7]中相關標準,患兒經正規大環內酯類抗生素治療超過7 d,仍持續發燒、臨床癥狀加重、肺部影像加重,則定義為RMPP;(2) 患兒家屬了解此項研究內容,并同意患兒參與本研究,患兒病例資料記錄完整;(3) 患兒年齡≤13歲;(4) 經血常規、尿常規、病原微生物培養及其他相關檢測,無支原體外的其他細菌、病毒等感染。排除標準:(1) 合并神經系統疾病、先天性遺傳代謝疾病者;(2) 既往有肺發育不良、細菌性肺炎、肺結核、支氣管哮喘或其他急慢性肺部疾病者;(3) 疾病恢復期者;(4) 入組前1個月內有干擾素、抗炎藥物、血液制品、免疫抑制劑、腎上腺皮質激素治療史者。本試驗獲我院臨床倫理委員會批準,符合倫理標準。

1.2 觀察指標

收集記錄兩組患兒初次入院時年齡,性別,住院時間,肺外并發癥,是否累及雙側肺,是否有胸腔積液、胸膜增厚、喘息、肺部濕啰音,C反應蛋白(C-reactive protein,CRP),白細胞(white blood cell,WBC)等資料。其中CRP采用免疫比濁法檢測(日本東芝120全自動生化分析儀),WBC采用日本Sysmex公司生產的SF-3000全自動血細胞分析儀及配套試劑檢測。所有患兒于入院時抽取外周靜脈血5 ml,室溫下靜置1 h,3 000 r·min-1離心15 min,收集血清,采用酶聯免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)法檢測患兒血清TIM-3(試劑盒購自深圳海思安生物技術有限公司,貨號:HAS-50765)、Galectin-9(試劑盒購自武漢楚銳科藥業科技有限公司,貨號:CEH0148)水平,檢測儀器為美國Bio-Rad公司生產的xMark全自動酶標儀,檢測步驟嚴格按試劑盒說明進行。標準品濃度作為橫坐標,吸光度值作為縱坐標繪制標準曲線,根據標準曲線方程和血清樣品吸光度值計算血清TIM-3、Galectin-9水平。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 RMPP組與GMPP組一般資料的比較

RMPP組與GMPP組年齡、性別及有胸腔積液、胸膜增厚、喘息、肺部濕啰音患兒比例差異均無統計學意義(P>0.05)。RMPP組住院時間長于GMPP組(P<0.05),CRP、WBC及肺外并發癥、累及雙側肺患兒比例顯著高于GMPP組(P<0.05)。見表1。

表1 RMPP組與GMPP組一般資料的比較Tab 1 General data comparison between RMPP group and GMPP group

2.2 RMPP組與GMPP組血清TIM-3、Galectin-9水平比較

RMPP組血清TIM-3、Galectin-9水平顯著高于GMPP組(P<0.05),見表2。

表2 RMPP組與GMPP組血清TIM-3、Galectin-9水平比較Tab 2 Comparison of serum TIM-3 and Galectin-9 levels between RMPP group and GMPP

2.3 RMPP患兒血清TIM-3、Galectin-9水平與住院時間、肺外并發癥、累及雙側肺、CRP、WBC的相關性

Pearson及Spearman相關分析結果顯示,RMPP患兒血清TIM-3與Galectin-9水平呈正相關(r=0.530,P<0.05);RMPP患兒血清TIM-3、Galectin-9水平與住院時間、CRP、WBC、肺外并發癥、累及雙側肺呈正相關(P<0.05)。見圖1、表3。

圖1 RMPP患兒血清TIM-3與Galectin-9水平的相關性Fig 1 Correlation between serum TIM-3 and Galectin-9 levels in children with RMPP

表3 RMPP患兒血清TIM-3、Galectin-9水平與住院時間、肺外并發癥、累及雙側肺、CRP、WBC的相關性Tab 3 Correlation of serum TIM-3 and Galectin-9 levels with hospital stay, extrapulmonary complications, bilateral lung involvement, CRP and WBC in children with RMPP

2.4 血清TIM-3、Galectin-9水平預測GMPP進展為RMPP的效能

血清TIM-3、Galectin-9水平及二者聯合預測GMPP進展為RMPP的AUC分別為0.811(95%CI0.756～0.866)、0.793(95%CI0.736～0.851)、0.862(95%CI0.803～0.900),其中聯合預測AUC顯著高于二者單獨預測AUC(Z=1.898、2.568,P<0.05),敏感度分別為66.7%、68.3%、78.3%,特異度分別為88.1%、78.9%、73.5%,TIM-3、Galectin-9臨界值分別為8.85 ng·ml-1、32.54 ng·L-1。見圖2。

圖2 血清TIM-3、Galectin-9水平預測GMPP進展為RMPP的ROC曲線Fig 2 ROC curve of serum TIM-3 and Galectin-9 levels predicting the progression of GMPP to RMPP

2.5 影響GMPP進展為RMPP的多因素Logistic回歸分析

將GMPP是否進展為RMPP(GMPP=0,RMPP=1)作為因變量,以TIM-3、Galectin-9、住院時間、CRP、WBC、肺外并發癥、累及雙側肺為自變量進行Logistic回歸分析,結果顯示TIM-3、Galectin-9是影響GMPP進展為RMPP的獨立危險因素(P<0.05)。見表4。

表4 影響GMPP進展為RMPP的多因素Logistic回歸分析Tab 4 Multi-factor Logistic regression analysis affecting the progress of GMPP to RMPP

3 討 論

MP是一類具有高度多形性的最小原核細胞型微生物,不能使用標準技術進行培養,且無細胞壁,這一特性使其對所有針對細胞壁的抗生素不敏感[8-9]。MP引起的肺炎通常是良性和自限性的,然而部分病例在經治療后仍可能存在病情難以緩解或加重現象,此類患者為RMPP[10-12]。研究顯示,RMPP患兒較GMPP患兒住院時間長,體內炎癥反應水平高,炎癥因子CRP、WBC等水平高[13]。本研究結果與既往研究相符。

RMPP的發病機制目前仍缺乏相關定論,多個研究表明,免疫應答反應及炎癥反應在RMPP的發生發展中發揮重要作用,且RMPP的特點是對病原體的過度免疫反應[14]。TIM家族是T細胞亞群中新的免疫應答關鍵性調節因子,調節Th1和Th2細胞參與的免疫應答,維持機體內免疫平衡[15-16]。TIM-3在自身免疫性疾病、慢性病毒感染和腫瘤中起著重要作用,除了表達于Th1細胞表面外,在巨噬細胞、樹突狀細胞和單核細胞等免疫細胞上同樣有較高的表達[17-18]。Galectin-9是TIM-3的配體之一,是一種半乳糖結合蛋白,同樣參與機體免疫反應和炎癥反應的調節,在炎癥因子刺激下表達水平增加[19]。梁津等[20]研究顯示,相較于正常體檢人群,肺炎患者血清TIM-3水平更高。徐歡[21]研究顯示,Galectin-9與兒童獲得性肺炎的嚴重程度呈正相關,可作為評估病情的指標。本研究中RMPP患兒血清TIM-3、Galectin-9表達水平顯著高于GMPP患兒。可能是因為MP引發患兒體內炎癥反應,炎癥因子水平升高,同時MP感染會激活體內的免疫系統,造成免疫失衡,免疫細胞合成并釋放TIM-3、Galectin-9,進一步間接誘發炎癥反應及免疫功能障礙;而炎癥反應的劇烈程度直接與患兒病情相關,因此相較于GMPP,RMPP患兒血清TIM-3、Galectin-9水平更高。此外,RMPP患兒血清TIM-3、Galectin-9與住院時間、CRP、WBC等均呈正相關,且二者是影響GMPP進展為RMPP的獨立危險因素。進一步提示TIM-3、Galectin-9高表達可能參與RMPP的發生發展,其具體機制可能與二者在炎癥反應及免疫應答反應中的作用有關,有待基礎研究驗證。

本研究中血清TIM-3、Galectin-9單個指標在預測RMPP時存在一定局限性,敏感度均較低。因此本研究進一步將血清TIM-3、Galectin-9聯合,結果顯示其預測AUC及敏感度均有一定程度的提高。提示臨床研究可將TIM-3、Galectin-9聯合用作RMPP的輔助預測指標,根據檢測指標是否大于各自臨界值以及ROC曲線的變化趨勢評估RMPP發生風險。TIM-3、Galectin-9作為RMPP血清標志物,其檢測費用可被大多數患兒家庭接受,適合在各基層醫院推廣使用。

綜上所述,RMPP患兒血清TIM-3、Galectin-9表達水平異常升高,可能參與了RMPP的發生發展。二者聯合檢測可輔助預測RMPP臨床發生風險,當GMPP患兒血清TIM-3、Galectin-9檢測水平分別大于其臨界值8.85 ng·ml-1、32.54 ng·L-1時,臨床醫師應注意其發展為RMPP的可能性。相關患兒除臨床常規對癥治療外,應及時糾正其體內炎癥反應及免疫功能紊亂,以縮短病程、改善預后。本研究為單中心的臨床研究,樣本選擇可能存在偏倚,需大規模、多中心的前瞻性研究來進一步證實。