血漿中ZNF582甲基化在結(jié)直腸癌早期診斷中的可行性研究

戴彥苗,彭惠平,王杰,夏晨靜,高黎明,徐宏偉

(昆山市中醫(yī)醫(yī)院 脾胃肝膽科,江蘇 昆山 215300)

根據(jù)國家腫瘤中心發(fā)布的最新中國癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù),結(jié)直腸癌新發(fā)病例數(shù)已經(jīng)上升至所有癌癥中的第2位(40.8萬),死亡人數(shù)已經(jīng)上升至所有癌癥中的第4位(19.6萬),自2000年以來的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌發(fā)病率和死亡率一直呈增長趨勢[1]。結(jié)直腸癌在癌前病變階段進(jìn)行干預(yù)的5年生存率約為100%,在癌癥早期階段進(jìn)行干預(yù)的5年生存率高達(dá)90%,而當(dāng)結(jié)直腸癌發(fā)展到Ⅳ期時(shí)的5年生存率驟降至14%[2]。當(dāng)前我國Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期和未知分期結(jié)直腸癌的診治比例分別為3.5%、29.2%、29.8%、16.3%和11.2%[3]。因此,實(shí)現(xiàn)結(jié)直腸癌早期篩查進(jìn)而進(jìn)行早期干預(yù),對于降低結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率具有重要意義。

結(jié)直腸癌篩查的金標(biāo)準(zhǔn)為結(jié)腸鏡,但是其是一種侵入性的檢查方法,痛苦較大且侵犯隱私,整體的依從率較低。且在中國這樣的發(fā)展中國家,醫(yī)療資源有限,結(jié)腸鏡難以作為結(jié)直腸癌初篩的手段[4]。亞太地區(qū)結(jié)直腸腫瘤預(yù)測評分標(biāo)準(zhǔn)是2014年亞太結(jié)直腸癌篩查會(huì)議中提出的一種共識(shí)方法,該方法是一種有效的對亞太地區(qū)無癥狀人群結(jié)直腸癌初篩手段[5],目前已經(jīng)在我國的結(jié)直腸癌初篩工作中廣泛應(yīng)用,但是其存在靈敏度低和特異性差的問題[6]。免疫法糞便潛血試驗(yàn)(fecal immunochemical test,FIT)是一種結(jié)直腸癌篩查中常用的非侵入性的檢查手段,其對結(jié)直腸癌具有較高的靈敏度,但是對非進(jìn)展期腺瘤等癌前病變的靈敏度相對較低。DNA甲基化是與癌癥發(fā)生高度相關(guān)的表觀遺傳修飾,癌癥組織中釋放的游離DNA攜帶的甲基化信息進(jìn)入血液或糞便后,檢測血液或糞便樣本中DNA甲基化水平變化可以成為一種有效的結(jié)直腸癌非侵入性早期診斷方法,且該方法相對于傳統(tǒng)的問卷法和FIT,具有靈敏度高和特異性強(qiáng)的優(yōu)勢,已經(jīng)逐漸被納入各國的最新結(jié)直腸癌篩查指南[7-8]。鋅指蛋白582(zincfingerprotein582,ZNF582)位于人的19號染色體,含有1個(gè)KRAB-A-B結(jié)構(gòu)域和9個(gè)鋅指模型[9]。ZNF582啟動(dòng)子區(qū)域甲基化被發(fā)現(xiàn)與宮頸癌及食管鱗癌的發(fā)病有顯著相關(guān)性[10-11],且有研究發(fā)現(xiàn)其在結(jié)直腸癌組織中的甲基化水平也存在異常[9],但是ZNF582在血漿樣本的甲基化水平及其作為一種非侵入性的檢測標(biāo)志物在結(jié)直腸癌早期診斷中應(yīng)用價(jià)值研究卻鮮有報(bào)道。因此,本研究探討血漿中ZNF582甲基化的檢測用于結(jié)直腸癌早期診斷的可行性。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2021年1月1日至2022年6月30日,在昆山市中醫(yī)醫(yī)院進(jìn)行結(jié)腸鏡檢查的患者。其中確診為結(jié)直腸癌患者78例(結(jié)腸癌組),包含Ⅰ期10例、Ⅱ期24例、Ⅲ期23例、Ⅳ期8例、未知分期13例;男50例,女28例,平均年齡為63歲。結(jié)直腸息肉患者62例(結(jié)直腸息肉組),其中男34例,女28例,年齡31～81歲,平均59歲。另選結(jié)腸鏡檢查正常者83例為正常對照組,其中男34例,女49例,年齡23～79歲,平均49歲。所有結(jié)直腸癌和結(jié)直腸息肉患者均經(jīng)病理確診。

1.2 血漿ZNF582甲基化檢測

使用10 ml BD Vacutainer?K2E(EDTA)采血管采集10 ml靜脈外周血,經(jīng)1 350×g離心2次后分離出3.5 ml血漿。使用蘇州唯善生物科技有限公司的甲基化檢測樣本前處理試劑盒提取3.5 ml血漿中游離DNA并對血漿游離DNA進(jìn)行亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化和純化。純化后的DNA使用100 μl洗脫液洗脫,放置于-20 ℃保存。血漿中ZNF582甲基化檢測使用蘇州唯善生物科技有限公司的ZNF582甲基化檢測試劑盒,該試劑盒中包含1組ZNF582甲基化特異性引物和Taqman探針,同時(shí)檢測1個(gè)人源內(nèi)參基因β-Actin(ACTB),當(dāng)ACTB的Ct值<35時(shí)判定為樣本量足夠,否則為無效樣本。檢測時(shí),取15 μl 游離DNA樣本加入15 μl PCR反應(yīng)混合液中,隨后放入ABI7500熒光定量PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)。具體反應(yīng)條件為:95 ℃熱啟動(dòng)20 min;95 ℃變性10 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸10 s,共50個(gè)循環(huán);40 ℃降溫1 min。以甲基化ZNF582的Ct值代表其甲基化水平,Ct值越低則甲基化水平越高。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用Windows SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用MedCalc軟件繪制ROC曲線,以結(jié)腸鏡和病理檢查結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn),計(jì)算各檢測方法的靈敏度和特異性。

2 結(jié) 果

2.1 血漿中的ZNF582甲基化水平

結(jié)直腸癌組患者血漿中的ZNF582甲基化水平顯著高于結(jié)直腸息肉組和正常對照組(P<0.000 1),而結(jié)直腸息肉組血漿中的ZNF582甲基化水平也顯著高于正常對照組(P<0.000 1),見圖1。

圖1 血漿樣本中ZNF582甲基化水平

2.2 ZNF582甲基化診斷結(jié)直腸癌ROC曲線

ZNF582甲基化診斷結(jié)直腸癌的ROC曲線AUC值為0.879(95%CI0.818 ～0.925),約登指數(shù)最大值(0.634 4)所在的Ct值為35.7,對應(yīng)的靈敏度和特異性分別為73.1%和90.4%,見圖2。根據(jù)ROC曲線所得到的最佳Cut-off值,對后續(xù)的數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步的分析。

圖2 血漿ZNF582甲基化診斷結(jié)直腸癌的ROC曲線

2.3 血漿ZNF582甲基化對結(jié)直腸癌的診斷效果

根據(jù)ROC曲線得到的Cut-off值(Ct值<35.7),對結(jié)直腸癌、結(jié)直腸息肉和正常樣本進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn),血漿中ZNF582甲基化對結(jié)直腸息肉的靈敏度為37.1%,對結(jié)直腸癌的靈敏度為73.1%,在正常對照中的檢出率為9.6%(對應(yīng)特異性為90.4%)(圖3A)。ZNF582甲基化對不同分期的結(jié)直腸癌診斷效果具體分析發(fā)現(xiàn),對Ⅰ期結(jié)直腸癌的靈敏度可達(dá)90%,對Ⅱ期結(jié)直腸癌的靈敏度為79.2%,對Ⅲ期結(jié)直腸癌的靈敏度為60.9%,對Ⅳ期結(jié)直腸癌的靈敏度為100.0%,對未知分期的結(jié)直腸癌靈敏度為53.8%(圖3B)。進(jìn)一步對結(jié)直腸癌根據(jù)不同特征進(jìn)行分組分析后發(fā)現(xiàn),血漿中ZNF582甲基化對不同性別、分期、分化程度以及腫瘤大小的結(jié)直腸癌檢測靈敏度無顯著差異,但是對不同年齡的結(jié)直腸癌檢測靈敏度有顯著差異(P<0.05),見表1。

圖3 血漿ZNF582甲基化對結(jié)直腸息肉和結(jié)直腸癌樣診斷的靈敏度與特異性(A)和ZNF582甲基化在不同癌癥分期的靈敏度(B)

表1 血漿ZNF582甲基化對不同分組結(jié)直腸癌樣本檢測的靈敏度差異

3 討 論

結(jié)直腸癌是威脅人類健康最常見的惡性腫瘤之一,當(dāng)前在我國呈現(xiàn)發(fā)病率逐年升高和逐漸年輕化的趨勢[1]。因此,實(shí)現(xiàn)結(jié)直腸癌的早期診斷和早期干預(yù)是降低結(jié)直腸癌發(fā)病率和死亡率的重要手段。DNA甲基化是哺乳動(dòng)物中最常見的表觀遺傳修飾,主要發(fā)生在基因的啟動(dòng)子區(qū)域,當(dāng)基因的啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平異常時(shí),通常會(huì)導(dǎo)致抑癌基因或原癌基因的表達(dá)水平發(fā)生變化,從而導(dǎo)致癌癥的發(fā)生。因此,DNA甲基化被認(rèn)為是一種潛在有效的癌癥早期診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物[12]。

當(dāng)前,使用血漿或糞便中DNA甲基化作為結(jié)直腸癌早期診斷的標(biāo)志物已經(jīng)在臨床上得到了成功應(yīng)用[13]。例如,血漿的SEPT9甲基化已經(jīng)被美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)和國家藥品監(jiān)督管理局(NMPA)批準(zhǔn)用于結(jié)直腸癌的輔助診斷,其對結(jié)直腸腺瘤和結(jié)直腸癌的靈敏度為10%～22%和68%～77%,特異性達(dá)80%～96%[14-15]。SDC2甲基化是另一個(gè)被NMPA批準(zhǔn)用于結(jié)直腸癌輔助診斷的標(biāo)志物,其在糞便樣本中對進(jìn)展期腺瘤及結(jié)直腸癌的靈敏度可以達(dá)到42%和84%,特異性達(dá)98%[16]。

ZNF582與維持細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分化、腫瘤轉(zhuǎn)化和細(xì)胞周期控制密切相關(guān)[17], 最近的研究也表明,啟動(dòng)子中的甲基化ZNF582是癌癥沉默的重要表觀遺傳機(jī)制[18]。高官壯等[9]探索了ZNF582基因啟動(dòng)子區(qū)在結(jié)直腸癌組織中的甲基化狀態(tài),發(fā)現(xiàn)其在結(jié)直腸癌組織中的甲基化水平顯著高于癌旁組織。但是針對血漿中的ZNF582甲基化水平的研究及其用于結(jié)直腸癌早期診斷的可行性探索卻鮮有報(bào)道。血漿中的循環(huán)腫瘤DNA(circulatingtumor DNA, ctDNA)來源于腫瘤組織凋亡或壞死所產(chǎn)生的DNA片段,因此在血漿中的ctDNA濃度非常低且在檢測時(shí)存在極大的挑戰(zhàn)性。本研究對血漿中ZNF582的甲基化水平進(jìn)行了探索性的檢測嘗試,通過高靈敏度的甲基化特異性熒光定量PCR可以有效地檢測到血漿中ctDNA所攜帶的ZNF582甲基化信息,且ZNF582在結(jié)直腸癌血漿中的甲基化水平顯著高于其在正常對照中甲基化水平。根據(jù)ROC曲線分析發(fā)現(xiàn),血漿中的ZNF582甲基化可以顯著區(qū)分結(jié)直腸癌和正常人群,具有較高的靈敏度和特異性。與此同時(shí),對不同分期的結(jié)直腸癌樣本分析發(fā)現(xiàn),ZNF582在Ⅰ期腸癌中的甲基化水平達(dá)到了90%,這比血漿中SEPT9甲基化在Ⅰ期腸癌中僅有不足50%的靈敏度要高出很多。因此血漿中的ZNF582甲基化是一種潛在的有效的非侵入性結(jié)直腸癌早期診斷標(biāo)志物。另外,與糞便樣本采集對比,血漿樣本具有高通量、易均一化處理的優(yōu)勢,在大規(guī)模人群體檢及篩查時(shí)應(yīng)用更為方便。雖然血漿樣本中的游離DNA量遠(yuǎn)少于糞便樣本,但是本研究結(jié)果顯示,血漿中ZNF582甲基化對結(jié)直腸癌的檢測靈敏度與糞便中SDC2甲基化差異僅有約10%,且血漿ZNF582甲基化在Ⅰ期結(jié)直腸癌的靈敏度上更具優(yōu)勢(90%vs.87%),以上數(shù)據(jù)也反映出血漿ZNF582甲基化是一種操作簡便且高效的結(jié)直腸癌早期診斷方法。

本研究還存在一些不足,納入的樣本數(shù)量有限,且為單研究中心的病例對照研究,因此在檢測結(jié)果上可能存在一些偏倚性。在未來希望可以納入更多的樣本,展開多中心的前瞻性研究,深入地探索血漿中ZNF582甲基化用于結(jié)直腸癌早期診斷的臨床效果。

綜上所述,血漿中ZNF582甲基化在結(jié)直腸癌診斷中具有較高的靈敏度和特異性,可以作為一種潛在的新型結(jié)直腸癌早期診斷的替代性方法。