磷酸二氫鉀影響馬鈴薯對晚疫病抗性的初步研究

張哲 劉霞 王興國 楊俐 陳麗 黃勛 張雅敏 楊艷麗

摘要

本研究以馬鈴薯品種‘麗薯6號為試材，對葉面噴施不同濃度磷酸二氫鉀4?d后的植株接種晚疫病菌，測定晚疫病發生的嚴重度，并測定磷酸二氫鉀和晚疫病菌處理后14?d內馬鈴薯植株的PAL、SOD、POD、PPO、Chi、GLU活性及SP含量。結果表明，在一定濃度范圍內，磷酸二氫鉀可減輕馬鈴薯晚疫病的發生，隨著施用濃度的增加，晚疫病發病逐漸減輕。其中磷酸二氫鉀質量濃度為0.6%時，晚疫病發病最輕，接種晚疫病菌后8?d防效達35.64%，12?d時仍超過30%，但濃度超過0.6%，晚疫病發生加重。同時，噴施磷酸二氫鉀可不同程度地提升健康和接種晚疫病菌的馬鈴薯植株體內6種防御酶活性及可溶性蛋白含量。因此，磷酸二氫鉀在一定時間段內可誘導馬鈴薯對晚疫病的抗性，減輕晚疫病的發生。

關鍵詞

磷酸二氫鉀;?馬鈴薯晚疫病;?抗病性

中圖分類號：

S?432.1

文獻標識碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2022070

A?preliminary?study?on?the?effects?of?potassium?dihydrogen?phosphate?on?the?resistance?of?potato?to?late?blight

ZHANG?Zhe1，?LIU?Xia1，?WANG?Xingguo1，?YANG?Li2，?CHEN?Li1，

HUANG?Xun1，?ZHANG?Yamin1，?YANG?Yanli1*

（1.?College?of?Plant?Protection，?Yunnan?Agricultural?University，?Kunming?650201，?China;

2.?Dali?Station?of?Plant?Protection?and?Inspection，?Yunnan?Province，?Dali?671000，?China）

Abstract

The?potato?variety?‘Lishu?no.6?was?sprayed?with?different?concentrations?of?potassium?dihydrogen?phosphate.?Four?days?later，?the?plants?were?inoculated?with?Phytophthora?infestans?to?determine?the?severity?of?potato?late?blight.?The?activities?of?PAL，?SOD，?POD，?PPO，?Chi，?GLU?and?the?contents?of?SP?in?potato?plants?were?determined?within?14?days?after?treatment.?The?results?showed?that?potassium?dihydrogen?phosphate?could?reduce?the?occurrence?of?potato?late?blight.?With?increasing?application?concentrations，?the?occurrence?of?potato?late?blight?gradually?decreased，?but?when?the?concentration?exceeded?0.6%，?the?occurrence?of?potato?late?blight?became?more?serious.?When?the?concentration?of?potassium?dihydrogen?phosphate?was?0.6%，?the?severity?of?potato?late?blight?was?the?least，?and?the?control?effect?was?35.64%?on?day?eight?after?treatment，?and?remained?stable?（>30%）?12?days?after?treatment.?At?the?same?time，?spraying?potassium?dihydrogen?phosphate?increased?the?activity?of?six?defense?enzymes?and?soluble?protein?content?to?varying?degrees?in?healthy?and?inoculated?potato?plants.?Therefore，?potassium?dihydrogen?phosphate?can?induce?potato?resistance?to?late?blight?during?specific?periods?of?time，?and?thus?reduce?the?occurrence?of?potato?late?blight.

Key?words

potassium?dihydrogen?phosphate;?potato?late?blight;?disease?resistance

馬鈴薯晚疫病是由致病疫霉Phytophthora?infestans（Mont.）?de?Bary引起的毀滅性卵菌病害，可造成產量損失20%～40%，甚至絕收，曾導致“愛爾蘭大饑荒”［1］。目前，防治該病主要以選育抗病品種輔以化學防控為主，然而隨著晚疫病菌群體結構的迅速變化，出現了品種抗病性喪失［2］、菌株產生抗藥性［3］等問題。因此，探索和實施綠色防控技術尤為重要。

誘導抗病性是由多種生物或非生物因子所激發，依賴植物化學或物理防衛屏障的主動抗病過程［4］。能夠激發誘導抗病性的各種因子稱為激發子，目前已發現多種激發子可以通過迅速激活植物體內生理生化反應來引起一系列防御酶活性的增強及病程相關蛋白的積累，進而提高植物抗病性。主要有苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine?ammonialyase，?PAL）、超氧化物歧化酶（superoxide?dismutase，?SOD）、過氧化物酶（peroxidase，?POD）、多酚氧化酶（polyphenol?oxidase，?PPO）、幾丁質酶（chitinase，?Chi）、β1，3葡聚糖酶（β1，3glucanase，?GLU）和可溶性蛋白（soluble?protein，?SP）等，它們的活性或含量變化與植株的抗病性密切相關［5］。如哈茨木霉Trichoderma?harzianum?T1055誘導向日葵對苗枯病的抗性［6］，枯草芽胞桿菌Bacillus?subtilis?BS208誘導番茄對灰霉病的抗性［7］，苯并噻二唑誘導香蕉對枯萎病的抗性［8］，水楊酸誘導番茄對枯萎病的抗性［9］，亞磷酸鉀誘導馬鈴薯對晚疫病的抗性等［10］。

磷酸二氫鉀（KH2PO4）作為農業生產上常用的葉面肥，具有污染小、吸收快的特點，可顯著提升作物的產量和品質［11］，也具備提升作物抗寒［12］、抗倒伏［13］及抗干熱風［14］的能力，然而磷酸二氫鉀在馬鈴薯抗晚疫病方面的研究未見報道。本研究通過對馬鈴薯噴施磷酸二氫鉀后接種晚疫病菌，測定了不同濃度處理下晚疫病發生的嚴重度，并對6種防御酶活性及可溶性蛋白含量的變化情況進行分析，以期探究磷酸二氫鉀能否影響馬鈴薯對晚疫病的抗性。

1?材料與方法

1.1?材料

供試馬鈴薯為中抗馬鈴薯晚疫病品種‘麗薯6號，由云南省麗江市農科所選育。供試晚疫病菌Phytophthora?infestans菌株共12株，由云南農業大學馬鈴薯病害研究室保存，分別采自云南馬鈴薯大春作一季作區中的12個縣市，涵蓋了目前能夠鑒定出的晚疫病菌的1～11個致病基因。

供試培養基為黑麥番茄培養基［3］。配制方法為：稱取黑麥60?g/L，加入適量水后滅菌、榨汁、煮沸，篩網過濾，加入瓊脂20?g/L，番茄汁150?mL/L、CaCO3?1.2?g/L，調節pH至6.5～7.0，滅菌備用。

栽培基質為蛭石、珍珠巖體積比1∶1的混合基質。試驗所用肥料包括尿素（N≥46%）、過磷酸鈣（P2O5≥12%）、硫酸鉀（K2O≥52%）及磷酸二氫鉀（有效成分≥99%，P2O5≥52%，K2O≥34%），除尿素購自安陽中盈化肥有限公司外，其他均購自河北先正農業科技有限公司。

1.2?試驗方法

1.2.1?孢子懸浮液的制備

將12個晚疫病菌菌株分別接種至黑麥番茄培養基中，18℃黑暗培養10～14?d，使用無菌水沖洗刮下菌絲，270目無菌網篩過濾，用血球計數器調節孢子囊數目為5×104個/mL，然后將所有菌株菌懸液混合，置于4℃中1?h，釋放游動孢子，備用。

1.2.2?噴施磷酸二氫鉀后馬鈴薯晚疫病發生情況調查

試驗在云南農業大學溫室內進行，挑選經過催芽且大小一致的健康種薯種植于花盆中，每盆種植一個種薯。化肥施用量為尿素?4.4?g/盆、過磷酸鈣?8.3?g/盆、硫酸鉀3.9?g/盆，其中2/3的量與基質拌勻后裝盆作為基肥，1/3的量作為追肥，齊苗后14?d進行追施。

種植后45?d，用無菌水將磷酸二氫鉀配制成質量濃度分別為0%、0.15%、0.3%、0.6%、1.2%的溶液，于傍晚無風時將溶液噴灑至植株葉片，直到正反面均有明顯液滴為止。每處理3盆，重復3次。磷酸二氫鉀處理后4?d，使用1.2.1中制備的孢子懸浮液進行整株噴霧接種，然后用保鮮袋保濕24?h，以噴無菌水為對照。

接種后，每4?d調查1次病級，總共調查2次。分級標準按照田間藥效試驗準則（一）?殺菌劑防治馬鈴薯晚疫病：GB/T?17980342000中的標準［15］，根據調查結果計算病情指數和防效。

病情指數=∑（各級病葉數×相應病級值）×100/（調查總葉數×9）;

防效=（對照病情指數-處理病情指數）/對照病情指數×100%。

1.2.3?試驗設計及樣品采集

經過預試驗，發現使用不同濃度磷酸二氫鉀處理馬鈴薯后接種晚疫病菌，以0.6%濃度處理發病最輕。因此在進行上述試驗的同時，取與1.2.2中同一批種植且生長45?d的馬鈴薯，分別于當天和第4天按表1的方案進行處理（方法、接種濃度與1.2.2一致），每處理3盆，重復3次。分別于處理后0、2、4、6、8、10、12、14?d對同一處理各植株自頂端向下第3～5葉位長勢一致、充分展開的復葉進行混合采樣，每次采樣3.0?g，然后立即放入冰盒中，使用液氮速凍后-80℃保存備用。

測定樣品中防御酶活性及可溶性蛋白含量。

1.2.4?防御酶活性及可溶性蛋白含量的測定方法

PAL、SOD、POD、PPO、Chi、GLU活性及SP含量的測定分別采用苯丙氨酸法［8］、氮藍四唑法［8］、愈創木酚法［8］、鄰苯二酚法［16］、3，5二硝基水楊酸法［1718］、考馬斯亮藍G250法［19］，稍有修改。

1.3?數據分析

使用Excel進行數據統計，DPS?7.05進行單因素方差分析，多重比較方法為Duncan氏新復極差法。

2?結果與分析

2.1?噴施磷酸二氫鉀后馬鈴薯晚疫病的發生情況

不同濃度的磷酸二氫鉀噴施馬鈴薯植株后第4天接種晚疫病菌，之后每4?d調查發病情況，總共2次。結果表明，隨著磷酸二氫鉀施用濃度的增加，發病嚴重度逐漸減輕，超過一定濃度后，病害的發生加重。0.6%濃度處理的植株發病最輕，8?d時防效為35.64%，12?d時為30.94%。而1.2%濃度處理，雖然處理后8?d發病程度最低，但12?d時發病較重，8?d時防效達40.54%，但12?d時大幅下降，僅為17.40%。因此，磷酸二氫鉀在一定時間段內可減輕馬鈴薯晚疫病的發生，噴施0.6%的磷酸二氫鉀效果最佳（圖1，表2）。

2.2?噴施磷酸二氫鉀對馬鈴薯防御酶活性及可溶性蛋白含量的影響

噴施磷酸二氫鉀可不同程度地提升健康和感病的馬鈴薯植株PAL、SOD、POD、PPO、Chi、GLU活性及SP含量。

2.2.1?苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性的變化

空白對照植株PAL活性呈先下降后緩慢上升然后穩定的趨勢，而噴施磷酸二氫鉀不接種晚疫病菌的處理（T1），處理后PAL活性迅速上升，4?d時顯著高于對照，是對照的1.32倍。10?d時PAL活性達到最高水平，高出空白對照41.44%，隨后有所下降，但仍顯著高于對照。噴無菌水后接種晚疫病菌的處理（T2）、噴施磷酸二氫鉀后接種晚疫病菌的處理（T3），處理后6?d植株PAL活性均急劇增加，分別是空白對照的1.60倍、2.06倍。8?d時T2、T3處理均達到峰值，T3處理PAL活性高于T2處理28.06%，隨后均呈下降趨勢，但T3處理相比T2處理仍具顯著差異（表3）。

2.2.2?超氧化物歧化酶（SOD）活性的變化

噴施磷酸二氫鉀不接種晚疫病菌的處理（T1）在處理后

2?d植株SOD活性顯著高于空白對照，10?d后T1處理和空白對照SOD活性均呈下降趨勢，但T1處理SOD活性仍顯著高于空白對照。噴無菌水后接種晚疫病菌的處理（T2）、噴施磷酸二氫鉀后接種晚疫病菌的處理（T3），處理后植株SOD活性均顯著增強，處理后6?d和8?d時T3處理SOD活性分別比T2處理高8.87%和12.45%。處理后10～14?d，T2、T3處理SOD活性均下降，但T3處理SOD活性仍處于較高水平，平均比T2處理高1.43?U/（g·min）且差異顯著（表4）。

2.2.3?過氧化物酶（POD）活性的變化

噴施磷酸二氫鉀可使植株POD活性快速增加，處理后2～8?d，噴施磷酸二氫鉀不接種晚疫病菌的處理（T1）POD活性分別比空白對照高25.47%、52.20%、40.08%、44.90%，隨后其POD活性持續下降，但仍顯著高于空白對照。接種晚疫病菌后植株POD活性均急劇增加，處理后6?d和8?d時變化最為明顯，噴無菌水后接種晚疫病菌的處理（T2）POD活性在6?d和8?d時分別是4?d時的2.09倍和2.27倍，而噴施磷酸二氫鉀后接種晚疫病菌的處理（T3）POD活性在6?d和8?d時分別比T2處理高18.69%和16.20%。8?d后T2處理POD活性大幅下降，而T3處理下降幅度較小，且與T2處理相比具有顯著差異（表5）。

2.2.4?多酚氧化酶（PPO）活性的變化

噴施磷酸二氫鉀后植株PPO活性上升，處理后4?d，噴施磷酸二氫鉀不接種晚疫病菌的處理（T1）相比空白對照達到顯著水平，且在處理后4～14?d保持了較高活性，平均高出空白對照25.71%。噴無菌水后接種晚疫病菌的處理（T2）、噴磷酸二氫鉀后接種晚疫病菌的處理（T3），處理后植株PPO活性均迅速提升，而T3處理的植株PPO活性提升更明顯，處理后6?d時T2、T3處理分別比空白對照高25.50%、47.64%。8?d時，T2、T3處理達到最高水平，T3處理PPO活性比T2處理高15.54%。此后，T3處理在12?d內維持了較高水平，然后下降，而T2處理PPO活性迅速下降，12?d時與T3處理差異最顯著，僅為T3處理植株PPO活性的74.68%（表6）。

2.2.5?幾丁質酶（Chi）活性的變化

噴施磷酸二氫鉀不接種晚疫病菌的處理（T1）在處理后2～12?d植株的Chi活性顯著提高，平均比空白對照高0.94?U/（g·h），而空白對照Chi活性在整個采樣期在一個較低的水平上下波動。接種晚疫病菌可導致植株Chi活性大幅增加，處理后6?d，噴無菌水后接種晚疫病菌的處理（T2）、噴施磷酸二氫鉀后接種晚疫病菌的處理（T3）分別是空白對照的1.62、1.91倍。T2、T3處理在處理后6～10?d維持了較高的Chi活性，隨后下降，且10～12?d時下降最為明顯，T2處理降幅為19.76%，而T3處理降幅較低，僅為10.78%（表7）。

2.2.6?β1，3葡聚糖酶（GLU）活性的變化

噴施磷酸二氫鉀不接種晚疫病菌的處理（T1）在處理后2～10?d植株GLU活性顯著提高，隨后雖有所下降，但其與空白對照仍具顯著差異，而對照植株GLU活性一直處于較低的水平，無明顯變化。噴無菌水后接種晚疫病菌的處理（T2）、噴施磷酸二氫鉀后接種晚疫病菌的處理（T3），處理后GLU活性均急劇上升，處理后6?d時T2、T3處理GLU活性分別是空白對照的1.45、1.73倍，8?d時T2、T3處理GLU活性達到最高水平，且T3處理比T2處理高16.08%。此外，T3處理GLU活性在處理后6～10?d保持了較高水平，而T2處理的較高水平僅保持在6～8?d，持續時間短，之后T2、T3處理GLU活性大幅下降，但14?d時T3處理仍比T2處理高21.74%，而T2處理GLU活性已低于對照（表8）。

2.2.7?可溶性蛋白（SP）含量的變化

噴施磷酸二氫鉀不接種晚疫病菌的處理（T1）植株SP含量顯著提升，而對照植株SP含量變化較小。處理后2～14?d，T1處理植株SP含量平均比

0?d?高16.83%。接種馬鈴薯晚疫病菌后，植株SP含量均大幅上升，6?d時噴無菌水后接種晚疫病菌的

處理（T2）、噴施磷酸二氫鉀后接種晚疫病菌的處理（T3）的SP含量相比空白對照分別增加了27.33%、46.48%。T2處理SP含量在處理后6～8?d維持在較高水平，第10天開始大幅下降，14?d時其SP含量已低于空白對照，而T3處理在處理后6～10?d處于比T2處理更高的水平，之后有所下降，但降幅較小（表9）。

綜上，噴施磷酸二氫鉀可降低馬鈴薯晚疫病發生的嚴重度，并提升植株防御酶活性及可溶性蛋白含量，進而誘導馬鈴薯對晚疫病的抗性，且處理后6～10?d最為明顯。因此，可結合馬鈴薯晚疫病預警系統，在大田晚疫病發生前6～10?d噴施磷酸二氫鉀，不僅可減輕晚疫病的發生，還可降低化學農藥的施用量，實現馬鈴薯晚疫病綠色防控的同時增加馬鈴薯產量。

3?結論與討論

近年來，誘導抗性作為一種穩定、有效的防治方法被廣泛應用和研究。林敏等［10］利用亞磷酸鉀處理馬鈴薯后，植株體內防御基因表達量、氧化酶活性及可溶性蛋白含量均顯著提升，進而提升了馬鈴薯對晚疫病的抗性。朱毅勇等［20］使用磷酸鹽處理黃瓜后，黃瓜POD、Chi、GLU活性明顯提升，減輕了炭疽病的發生。Ata等［21］使用兩種磷酸鹽處理甜菜，均可誘導POD、PPO、PAL活性提升，使甜菜對銹病的抗性增強。本研究通過測定4個質量濃度的磷酸二氫鉀處理馬鈴薯后晚疫病的發生情況，發現磷酸二氫鉀可減輕馬鈴薯晚疫病的發生，且濃度為0.6%的處理晚疫病發生最輕，而濃度為1.2%的處理出現前期發病輕微，但后期發病加重的情況，未見相關報道可以參考，需要進一步加以驗證。

病原菌和激發子的作用可引起植物體內多種防御酶活性及蛋白含量的變化，它們在抵抗病害過程中發揮了非常關鍵的作用。其中，PAL是苯丙烷代謝途徑中的關鍵限速酶，大量植保素及酚類物質通過該途徑合成［9］。SOD、POD可清除組織或細胞中過多活性氧，保護植株免受氧化作用造成的損傷。此外，POD還參與木質素的合成，也可將酚類物質氧化成對病原菌毒性更強的醌類物質［7，22］。Chi和GLU常協同表達，具有降解病原菌細胞壁中的幾丁質和β1，3葡聚糖成分的作用。病程相關蛋白是植物受病原菌侵染后誘導產生的一類可溶性蛋白，其含量反映了植株在逆境脅迫下對自身的保護能力［23］。本研究發現噴施磷酸二氫鉀后，均可顯著提升馬鈴薯植株體內PAL、SOD、POD、PPO、Chi、GLU活性及SP含量，表明磷酸二氫鉀可通過提升防御酶活性及可溶性蛋白含量的形式，誘導馬鈴薯植株對晚疫病的抗性，這與林敏等［10］、朱毅勇等［20］使用磷酸鹽誘導植物抗性提升的研究結果相似。

綜上，磷酸二氫鉀可在一定時間段內誘導馬鈴薯對晚疫病的抗性，從而減輕晚疫病的發生。但本研究尚未對其他抗病機制進行深入探討，因此關于噴施磷酸二氫鉀后馬鈴薯植株防御基因的表達、防衛信號的識別和傳遞等方面的研究將是下一階段工作的重點。此外，在使用磷酸二氫鉀增強植株對晚疫病抗性的同時，綜合運用多種防治措施，將更有利于實現馬鈴薯晚疫病的綠色防控。

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