取食Cry3Aa蛋白后黃曲條跳甲成蟲中腸組織的病理變化

龔成慧 渠成 魏亦云 王然 羅晨 石旺鵬

摘要

為明確Cry3Aa蛋白對黃曲條跳甲成蟲的致死效果及作用機理，采用浸葉法測定了黃曲條跳甲成蟲取食Cry3Aa蛋白后的死亡情況，并利用透射電鏡觀察了Cry3Aa蛋白處理后成蟲中腸組織的病理學變化。結果顯示，取食濃度為2?mg/mL的Cry3Aa蛋白6?d和12?d后黃曲條跳甲成蟲的死亡率分別為33.33%和77.78%;透射電鏡觀察發現，蛋白處理后成蟲中腸發生了明顯的病理變化，并且隨著時間的延長，病理變化更加明顯，主要表現為：柱狀細胞變形、細胞間隙增大、微絨毛縮短并腫脹、線粒體變形、內質網腫脹。本研究表明黃曲條跳甲成蟲中腸是Cry3Aa蛋白的重要作用部位，研究結果為揭示Cry3Aa蛋白對黃曲條跳甲成蟲的作用機理奠定了基礎。

關鍵詞

黃曲條跳甲;?Cry3Aa蛋白;?致死效果;?中腸組織;?病理變化

中圖分類號：

S?433.5;?S?476.1

文獻標識碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2022182

Pathological?changes?in?the?midgut?of?Phyllotreta?striolata?adults?after?feeding?on?Cry3Aa

GONG?Chenghui1，2，?QU?Cheng1，?WEI?Yiyun1，?WANG?Ran1，?LUO?Chen1*，?SHI?Wangpeng2*

（1.?Institute?of?Plant?Protection，Beijing?Academy?of?Agriculture?and?Forestry?Sciences，?Beijing?100097，?China;

2.?College?of?Plant?Protection，China?Agricultural?University，?Beijing?100083，?China）

Abstract

In?order?to?clarify?the?lethal?effect?and?mechanism?of?Cry3Aa?protein?on?adults?of?Phyllotreta?striolata，the?mortality?of?adults?fed?with?Cry3Aa?protein?was?determined?by?leaf?dipping?method，and?the?pathological?changes?of?midgut?tissue?of?adults?were?observed?by?transmission?electron?microscopy.?The?results?showed?that?the?mortality?rates?of?adults?fed?with?Cry3Aa?protein?at?2?mg/mL?were?33.33%?and?77.78%?after?six?days?and?12?days，respectively.?Obvious?pathological?changes?were?observed?in?the?midgut?of?adult?treated?with?protein?by?transmission?electron?microscopy，and?the?pathological?changes?became?more?obvious?with?the?extension?of?time，mainly?including?deformation?of?columnar?cells，enlargement?of?intercellular?space，?shortening?and?swelling?of?microvilli，deformation?of?mitochondria?and?swelling?of?endoplasmic?reticulum.?The?above?results?showed?that?the?midgut?of?P.?striolata?adults?was?the?important?action?site?of?Cry3Aa?protein.?This?study?laid?a?foundation?for?the?mechanism?study?of?Cry3Aa?protein?on?P.?striolata?adults.

Key?words

Phyllotreta?striolata;?Cry3Aa?protein;?lethal?effect;?midgut?tissue;?pathological?change

黃曲條跳甲Phyllotreta?striolata屬鞘翅目Coleoptera葉甲科Chrysomelidae，是我國十字花科作物的重要害蟲，喜食油菜、芥菜、白菜等［12］，以成蟲和幼蟲取食為害，成蟲常聚集在蔬菜葉片背面取食，造成葉片穿孔，影響光合作用，也可取食莖、葉柄、花或頂端分生組織，導致植株萎蔫死亡;幼蟲在地下蛀蝕根皮，咬斷須根，導致植株萎蔫，還可傳播十字花科軟腐病，影響經濟價值［3］。隨著種植結構的調整和設施栽培的推廣，其發生為害逐年加重，在廣東的為害面積已超過小菜蛾Plutella?xylostella。黃曲條跳甲成蟲善跳躍，卵、幼蟲、蛹土棲，導致防治困難，加之長期不合理的施用化學農藥使其產生了極高的抗性。

蘇云金芽胞桿菌Bacillus?thuringiensis（Bt）是一種革蘭氏陽性細菌，會形成伴孢晶體蛋白［45］，其致病作用依賴于殺蟲蛋白，如Cry蛋白［6］。Cry蛋白對靶標昆蟲特異性強，對人類、脊椎動物、植物無害，可全部生物降解［7］，是替代化學農藥的重要生物防治產品。Cry蛋白在對鱗翅目害蟲的防治中已有廣泛應用，對鞘翅目害蟲防治的應用亦逐漸增多。目前Cry3、Cry5、Cry7和Cry8等Cry蛋白均可用于防治鞘翅目昆蟲，但Cry3Aa蛋白效果最好，專一性最強［8］。

Cry蛋白被昆蟲攝入中腸腸腔后，會被中腸堿性環境激活，穿過圍食膜，與中腸刷狀緣膜囊泡（brash?border?membrane?vesicle，?BBMV）上的受體蛋白結合，造成細胞穿孔、中腸溶解、昆蟲死亡［7，?9］。鱗翅目昆蟲幼蟲取食Bt蛋白后中腸組織會發生明顯的病理學變化。如棉鈴蟲Helicoverpa?armigera取食含?Bt?蛋白（Cry1Ac或?Cry2Ab?或?Vip3Aa）的飼料后，其中腸微絨毛會腫脹、脫落，線粒體和內質網會出現斷裂、變形等現象［1012］。鞘翅目昆蟲取食Bt蛋白后亦有類似的組織病理變化，如：大黑鰓金龜Holotrichia?oblita取食Bt?HBF18、FCD114、QDL402等菌株后中腸腸壁細胞出現變形、排列疏松、空洞等現象［13］;暗黑鰓金龜Holotrichia?parallela取食Bt菌株HD8E和HD8G后中腸出現微絨毛脫落、細胞間隙增大、內質網腫脹、線粒體變形等現象［14］;黃曲條跳甲取食Bt菌株HA和HD會導致其中腸微絨毛腫脹、底膜脫落［15］。

蘇云金芽胞桿菌菌株G033A于2007年獲得國家發明專利授權，于2017年在我國登記用于防治黃曲條跳甲，取食G033A中Cry3Aa蛋白后中腸組織的病理變化尚未見報道。因此，本研究在測定Cry3Aa蛋白對黃曲條跳甲成蟲殺蟲活性的基礎上，利用透射電鏡觀察了Cry3Aa蛋白對成蟲中腸組織造成的病理學影響，為進一步明確Cry3Aa蛋白的作用機制和更好地應用于生產提供理論依據。

1?材料與方法

1.1?供試材料

黃曲條跳甲種群采自華南農業大學實驗基地，在北京市農林科學院植物保護研究所養蟲室內用油菜（品種：‘夏綠2號）飼養2代后取羽化后3?d的成蟲試驗。飼養溫度為（26±1）℃，濕度為（75±5）%，光周期L∥D=16?h∥8?h。

Cry3Aa蛋白購于美延（北京）農業科技有限責任公司;ME204型電子天平，梅特勒托利多儀器（上海）有限公司;SZM42型體視顯微鏡，奧斯微光學儀器有限公司;HT7800型透射電子顯微鏡，日立高新技術公司。

1.2?試驗方法

1.2.1?Cry3Aa蛋白對黃曲條跳甲成蟲的致死效果

采用浸葉法測定Cry3Aa蛋白對黃曲條跳甲成蟲的致死效果。將Cry3Aa蛋白用50?mmol/L?Na2CO3溶液稀釋成2、1、0.5、0.25、0.125?mg/mL?5個濃度。

選取溫室種植的新鮮無蟲孔帶根的健壯10葉期油菜洗凈晾干，油菜去掉嫩心處葉片，僅留最外層2～3片葉，浸葉2?min后自然風干，

每處理3個重復，以不做任何處理的油菜為空白對照。

將上述處理過的油菜單株栽種于育苗盆（上口徑90?mm，底徑60?mm，高65?mm）中，用封口膜將育苗盆封住（避免昆蟲與土壤接觸），并在封口膜上扎孔透氣，外邊罩上一次性塑料瓶，每瓶接入饑餓處理24?h的黃曲條跳甲成蟲10頭，瓶口用紗布包住。每24?h觀察1次黃曲條跳甲死亡情況，連續觀察14?d。輕觸無明顯反應的試蟲視為死亡。

1.2.2?成蟲中腸組織樣品處理及電鏡觀察

黃曲條跳甲成蟲處理方法同1.2.1，處理濃度為2?mg/mL，取樣時間為處理后6?d和12?d。用自制吸蟲器吸取成蟲，每處理取至少3頭放入50?mL離心管中，饑餓24?h后置于冰上解剖。用滅菌解剖鑷去除成蟲足、翅和頭部，使成蟲背面朝上，沿背側線輕輕撕開體壁，去除氣管、脂肪、肌肉等，取出黃曲條跳甲成蟲腸道，截取中腸（中腸位于胃盲囊和馬氏管中間）（圖1），用1?mL預冷的0.15?mol/L?NaCl溶液漂洗3次后，放入固定液中固定2?h。送至中國農業大學生命科學研究中心制作切片（超薄、橫切）進行透射電鏡觀察。

1.3?數據分析

數據采用Excel?2003進行整理，計算校正死亡率，用Graphpad?Prism?5作圖軟件繪制折線圖。

死亡率=死亡蟲數/處理總蟲數×100%；

校正死亡率=（處理組死亡率-空白對照組死亡率）/（1-空白對照組死亡率）×100%。

2?結果與分析

2.1?Cry3Aa蛋白對黃曲條跳甲成蟲的致死效果

取食Cry3Aa蛋白后6?d和12?d，黃曲條跳甲成

蟲的校正死亡率隨著Cry3Aa蛋白濃度的降低而逐漸降低（圖2）。處理，2?mg/mL處理后6?d和12?d，成蟲校正死

亡率分別為33.33%和77.78%。

2.2?取食Cry3Aa蛋白6?d和12?d后黃曲條跳甲成蟲中腸柱狀細胞及細胞間隙變化

對照組成蟲中腸腸壁柱狀細胞形狀規整，細胞飽滿，內容物多，排列緊密，細胞間隙小或沒有細胞間隙（圖3a）。Cry3Aa蛋白處理后6?d，細胞出現破裂、變形現象，有部分細胞內容物散入腸腔，細胞排列相對疏松，細胞間隙變大（圖3b）。處理后12?d，中腸細胞排列混亂，形態難以辨別，細胞內容物大量散落至腸腔中，細胞間隙大，腸道穿孔（圖3c）。

2.3?取食Cry3Aa蛋白6?d和12?d后黃曲條跳甲成蟲中腸細胞微絨毛的變化

對照組成蟲中腸腸壁柱狀細胞頂部的微絨毛細長，數量較多，排列整齊有序（圖4a）。Cry3Aa蛋白處理后6?d，成蟲中腸微絨毛腫脹變粗，長度明顯變短（圖4b）。處理后12?d成蟲中腸微絨毛同樣表現為腫脹、變粗、變短，與處理6?d無明顯差異（圖4c）。

2.4?取食Cry3Aa蛋白6?d和12?d后黃曲條跳甲成蟲中腸細胞線粒體的變化

對照組成蟲中腸腸壁柱狀細胞線粒體呈橢圓形或紡錘形，輪廓完整，雙層膜結構清晰，內脊可見（圖5a）。Cry3Aa蛋白處理后6?d，成蟲中腸少量線粒體出現變形現象，線粒體被拉長、變細，輪廓相對不完整，但仍然可見雙層膜結構（圖5b）。處理12?d后，成蟲中腸線粒體變形更加嚴重，線粒體集中且偏向于細胞邊緣，或集中散落至腸腔，輪廓不清晰（圖5c）。

2.5?取食Cry3Aa蛋白后6?d和12?d黃曲條跳甲成蟲中腸細胞內質網的變化

結果如圖6所示，對照組成蟲中腸腸壁柱狀細胞內質網呈扁平囊狀，排列整齊（圖6a）。蛋白處理后6?d，內質網輪廓不清晰，輕微腫脹，整體上看較為模糊（圖6b）。蛋白處理后12?d，內質網腫脹，整體上非常模糊，已無法明確觀察到內質網的具體構造（圖6c）。

3?結論與討論

已有研究表明，Cry3Aa蛋白主要對鞘翅目昆蟲起作用，如對谷蠹Rhyzopertha?dominica［16］和椰心葉甲Brontispa?longissima［17］均有較好的致死效果。黃曲條跳甲幼蟲在地下為害，成蟲取食地上部植物葉片。本試驗發現Cry3Aa蛋白對黃曲條跳甲成蟲有一定的致死作用，在田間施用Cry3Aa蛋白防治黃曲條跳甲成蟲也可有效降低下一代幼蟲的數量，從而起到防治效果。

Bt?Cry蛋白經昆蟲攝入后，在其體內被活化，會與昆蟲中腸上皮的靶標結合，造成細胞穿孔，引起昆蟲中腸超微結構發生病理學變化，導致昆蟲死亡［18］。Sousa等［19］、Cunha等［20］的研究也證明Cry蛋白會造成昆蟲中腸的病理學變化，例如中腸細胞變形、細胞間隙增大、微絨毛腫脹變粗、線粒體和內質網腫脹變形。

本研究使用透射電鏡觀察Cry3Aa蛋白處理后黃曲條跳甲中腸，發現其柱狀細胞變形、細胞間隙變大、微絨毛腫脹脫落、線粒體和內質網膨脹變形、邊界不清晰。在鱗翅目昆蟲中，如棉鈴蟲［11］、歐洲玉米螟Ostrinia?nubilalis［21］、黏蟲Mythimna?separata［21］、二點委夜蛾Athetis?lepigone［22］等昆蟲經Cry蛋白處理后其中腸上皮柱狀細胞、微絨毛等組織都發生了明顯的變化，表現為微絨毛脫落、杯狀細胞和柱狀細胞變形、邊界模糊、線粒體等細胞器變形等病理學變化，本研究得到了類似的結果。但鞘翅目中并無杯狀細胞（主要存在于鱗翅目和毛翅目幼蟲），因此本研究中所說的細胞變化僅指柱狀細胞。在鞘翅目中，Bt菌株HD8E和HD8G對暗黑鰓金龜［14］、?BtHA和BtHD菌株對黃曲條跳甲［15］、?Bt?HBF1菌株對銅綠異麗金龜Anomala?corpulenta［23］等中腸病理學變化都與本研究結果一致。宋健等的研究發現隨著處理時間的延長，昆蟲中腸病理變化更加顯著且嚴重，本研究結果也與其一致［23］。以上研究均可證明使用Bt處理不同目的昆蟲，都會導致昆蟲中腸發生病理學變化，這也驗證了Bt蛋白主要作用于昆蟲中腸，與昆蟲中腸上特異位點結合，相互作用后導致昆蟲中腸穿孔這一理論。但本試驗僅為對Cry3Aa蛋白對黃曲條跳甲致死作用的初步研究，還需開展進一步分子生物學相關研究，明確Bt?Cry蛋白與黃曲條跳甲中腸受體作用機制，為Cry3Aa蛋白的田間應用奠定基礎。

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