北京地區桃黑斑病新癥狀的發現與診斷

周瑩 周悅妍 李永華 李世訪 燕繼曄

摘要

2019年-2020年在北京地區桃園病害調研普查時發現一種桃樹病害的新發癥狀新葉壞死，主要癥狀表現為當年新生枝條頂端新葉和生長點腐爛壞死。為明確這種新葉壞死癥狀是否由病原菌侵染引起，從北京平谷2個鄉鎮3個桃園采集35份病梢樣品，經病樣組織分離和菌株純化，選取12個代表性菌株進行形態學鑒定、系統進化分析以及致病性測定。結果顯示，通過形態學鑒定和多基因（ITS，?Alt?a1，?gpd）系統發育分析，以上分離株均鑒定為鏈格孢Alternaria?alternata;3株代表性菌株的致病性測定驗證了A.alternata是引起新葉壞死癥狀的病原菌，并且該病原菌也能導致桃枝條和果實發病，產生黑斑病癥狀。這是首次報道A.alternata除了引起桃果實黑斑癥狀之外，還可以引起桃樹新葉壞死癥狀，結果進一步豐富了鏈格孢侵染桃樹的癥狀多樣性，為鏈格孢引起的病害的整體防控提供了理論基礎。

關鍵詞

桃樹;?新葉壞死;?新癥狀;?病原鑒定;?鏈格孢

中圖分類號：

S?436.621.1

文獻標識碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2021551

Occurrence?and?diagnosis?of?new?symptoms?of?peach?black?spot?disease?in?Beijing

ZHOU?Ying1，2，?ZHOU?Yueyan1，?LI?Yonghua1，?LI?Shifang2，?YAN?Jiye1*

（1.?Institute?of?Plant?Protection，?Beijing?Academy?of?Agricultural?and?Forestry?Sciences，?Beijing?Key?Laboratory?of?Environment

Friendly?Management?of?Fruits?Pests?in?North?China，?Beijing?100097，?China;?2.?State?Key?Laboratory?for?Biology?of?Plant

Diseases?and?Insect?Pests，?Institute?of?Plant?Protection，?Chinese?Academy?of?Agricultural?Sciences，?Beijing?100193，?China）

Abstract

A?new?young?leaf?necrosis?symptom?was?observed?in?peach?orchards?located?in?Beijing?during?2019-2020：?brown?rot?spots?on?growing?tips?and?new?leaves?of?young?shoots.?To?determine?whether?the?symptom?is?caused?by?pathogenic?infection，?35?samples?were?collected?from?three?peach?orchards?in?two?towns?of?Pinggu，?Beijing.?After?pathogen?isolation，?twelve?representative?fungal?isolates?were?identified?as?Alternaria?alternata?according?to?morphological?characteristics?and?multigene?（ITS，?Alt?a1，?gpd）?phylogenetic?analysis.?Pathogenicity?assay?of?three?representative?isolates?confirmed?that?A.alternata?was?the?causal?agent?of?young?leaf?necrosis?symptom.?It?also?caused?black?spot?symptom?on?twigs?and?fruits.?Our?study?provides?new?evidences?for?the?symptoms?caused?by?A.alternate?and?a?new?theoretical?basis?for?integrated?control?of?this?disease.

Key?words

peach;?young?leaf?necrosis;?new?symptom;?identification;?Alternaria?alternata

桃樹Prunus?persica?L.原產于我國，至今有4?000多年的栽培歷史。桃樹在我國南北方廣泛種植，2020年我國桃樹種植面積達到了86.70萬hm2［1］，產量位居世界第一，是我國僅次于蘋果、梨的第三大落葉果樹［2］。桃樹生長過程中，會受到很多病害的影響，包括褐腐病、黑斑病、穿孔病、流膠病等［3］。隨著桃園種植年限增加、品種更替以及氣候環境的改變等多因素影響，近年來一些桃園出現了一些新的病害問題［45］。2019年－2020年期間在北京地區桃園病害調研普查時發現一種新的癥狀，該癥狀發生在當年新生枝條頂端，初期在生長點及嫩梢新葉形成腐爛壞死，隨著病害的發展，壞死向周圍葉片擴展，造成新梢頂端萎蔫干枯，影響次年結果枝的生長發育，造成產量損失;該癥狀與梨小食心蟲引起的折梢癥狀很相似，有時會被誤判為蟲害現象。為了明確這種癥狀是否由病原菌侵染引起，本研究收集田間病樣進行病原菌分離、鑒定以及致病性試驗，從而為該病害防控提供科學依據。

1?材料與方法

1.1?病害癥狀觀察

2019年-2020年連續2年在北京平谷峪口鎮和大華山鎮桃樹種植園選3個果園對桃樹新葉壞死癥狀的發生情況進行調查，品種主要有‘秋彤‘早蜜‘瑞光28號，從5月起每隔10～14?d觀察一次，記錄癥狀的形成與發展過程，7月調查記錄病梢率，每個果園隨機選取5株樹，每株樹在東西南北4個方位各調查10個當年新發枝條。

病樣采集及接種材料：從北京平谷3個病害調查點采集具有典型新葉壞死癥狀的桃樹新梢病樣共計35個;離體接種材料為‘瑞光5號的葉片和‘北京14號枝條、果實，活體接種材料為溫室種植的‘瑞光5號桃樹植株。

1.2?病原菌的分離純化

采集田間桃樹發病新梢，在新葉病健交界處剪取5?mm×5?mm的小塊組織，用75%乙醇表面消毒30?s，無菌水清洗3次，在滅菌濾紙上晾干后放置于PDA平板上，25℃恒溫培養箱中培養3～5?d，待菌落長出后挑取菌落邊緣菌絲純化后進行單孢分離。

1.3?病原菌的形態學觀察

純化菌株在PDA和PCA平板上培養5?d后觀察記錄菌落形態，待產孢后在顯微鏡下觀察分生孢子、分生孢子梗、分生孢子鏈的形態特征，測量并記錄分生孢子的大小，每株菌測量30個。為了更清晰地觀察病原菌的產孢表型，利用濾紙培養法：濾紙剪成比載玻片小的長方形，中心留1?cm×2?cm的小孔，濾紙鋪在載玻片上，挑取PCA培養基上培養的適量菌絲均勻涂抹在濾紙小孔周邊，加適量無菌水保濕，置于25℃恒溫培養箱中培養5～7?d，中途隔1?d加無菌水保濕，玻片置于體視顯微鏡下觀察產孢表型［6］。

1.4?病原菌的分子生物學鑒定

分離到的菌株在PDA平板上培養7?d后，用滅菌牙簽將菌絲刮下，放在1.5?mL的離心管中，采用快速DNA提取試劑盒［生工生物工程（上海）股份有限公司］提取DNA。以基因組DNA為模板，分別使用rDNA內轉錄間隔區（internal?transcribed?spacer，ITS）通用引物ITS4（5′TCCTCCGCTTATTGATATGC3′）/ITS5（5′GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG3′）［7］、鏈格孢屬主要過敏原Alt?a1基因引物AltF（5′ATGCAGTTCACCACCATCGC3′）/AltR（5′ACGAGGGTGAYGTAGGCGTC3′）［8］和甘油醛3磷酸脫氫酶gpd基因引物?gpd1（5′CAACGGCTTCGGTCGCATTG3′）/gpd2（5′GCCAAGGAGTTGGTTGTGC3′）［9］進行PCR擴增，引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR產物由北京博邁德基因技術有限公司測序，測序結果拼接后提交GenBank進行比對，并在GenBank?中下載相關參考序列，利用MAFFT?7?軟件對所有序列進行比對，利用BioEdit?7.0.9.0軟件按照ITS、Alt?a1和gpd的順序進行多基因序列整合后，載入RAxML軟件中，用最大似然法（maximum?likelihood?method，?ML）構建系統發育樹并進行系統發育分析。

1.5?致病性測定

選取3個代表性菌株于PDA平板上25℃培養5?d后打取直徑5?mm的菌餅待用。葉片離體接種：選取健康完整的‘瑞光5號成熟桃樹葉片，用75%乙醇表面消毒30?s，無菌水清洗3次，在滅菌濾紙上晾干備用。分別進行有傷和無傷接種。在葉背主葉脈旁側接種菌餅，菌絲面朝下，有傷接種用無菌昆蟲針刺傷。每個處理5片葉，重復3次，以接種無菌PDA塊作為對照。枝條、果實離體接種：選取‘北京14號一年生枝條和幼果期桃果實，采用與葉片同樣的消毒方法，枝條用直徑5mm的打孔器，果實用無菌昆蟲針刺傷后進行有傷接種，每個處理3個枝條和3個果實，重復3次。接種后的葉片、枝條和果實置于接種盒中保濕，在L∥D=12?h∥12?h，溫度25℃，相對濕度80%～90%的條件下培養。

活體接種：在溫室種植的‘瑞光5號桃樹植株上進行，將直徑5?mm的菌餅菌絲朝下接種于新梢生長點處，以無菌PDA培養基為對照，每個處理3個新梢，重復3次。接種后置于25℃恒溫，相對濕度80%條件下培養。觀察記錄發病情況，發病后對病組織再次進行分離鑒定，與原始分離株相比較，完成柯赫氏法則驗證。

2?結果與分析

2.1?病害田間癥狀及發病情況

該病害發病部位主要在當年新生枝條的嫩梢頂端，5月開始發現發病枝條，發病初期嫩梢生長點處及周圍新葉出現褐色壞死點，隨著病情發展，壞死區域逐漸擴大，最終嫩梢頂端出現枯萎干枯，影響次年結果枝的生長發育（圖1）。7月調查結果顯示，3個果園平均病梢率達到14%，發生較重的果園可達20%。

2.2?病原菌的形態特征

根據分離獲得菌株菌落特征，從中選取12個代表性菌株進行形態特征觀察，培養初期，菌絲為白色，后期菌落呈灰黑色或墨綠色絨狀，背面深橄欖綠或黑色，菌絲發達致密，菌落邊緣比較整齊。顯微鏡下，分生孢子梗呈淺褐色，分生孢子淺褐色或褐色，長橢圓形、卵形、棍棒狀或倒梨形，多數有喙，并具有1～5個橫隔膜和0～3個縱斜隔膜，大小為（10.1～33.2）μm×（5.6～15.0）μm;分生孢子著生于分生孢子梗頂端或側面，呈鏈式生長;在PCA?培養基上培養7?d可以形成超過10個孢子連成的分生孢子鏈，有分枝，呈樹枝狀;具有典型鏈格孢屬Alternaria分生孢子的形態特征（圖2）。

2.3?病原菌的分子鑒定與系統發育分析

提取12個代表性菌株的菌絲DNA，對rDNAITS、Alt?a?1和gpd基因序列進行了PCR擴增，將rDNAITS測序結果在NCBI?（https：∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast）進行BLAST?比對，結果表明，與Alternaria屬的相似性為98%～100%。將12個菌株的rDNAITS、Alt?a?1和?gpd基因序列提交至GenBank，獲得36條序列登錄號。基于rDNAITS、Alt?a?1和gpd序列構建了系統發育樹（圖3），12個菌株與鏈格孢Alternaria?alternata聚到同一分支，自舉值達到92%。結合形態學特征和分子生物學特征，最終確定引起桃樹新葉壞死癥狀的病原菌為鏈格孢Alternaria?alternata。

2.4?致病性測定與柯赫氏法則驗證

選取3個代表性菌株PP190107、PP190201、PP190203進行致病性測定，接種后第7天除對照未發病外，所有離體葉片有傷接種全部發病，其中菌株PP190107致病力最強，無傷接種病斑大小與有傷接種接近（圖4a），活體接種PP190107?11?d后出現了與田間相同的新葉壞死癥狀（圖4c）。有傷接種離體枝條和果實后也全部發病，以菌株PP190107致病力最強，接種枝條和果實均出現了明顯病斑（圖4e、4g），果實癥狀和桃黑斑病相似。

對上述發病組織進行組織分離，獲得的病原菌與原接種菌株一致，依據柯赫氏法則證明接種菌株即為引起桃樹新葉壞死癥狀的病原菌。

3?結論與討論

本研究通過對北京地區引起桃樹新葉壞死新癥狀的病原進行分離、鑒定、致病性測定以及柯赫氏法則驗證，確定了該癥狀由病原真菌引起，結合形態特征觀察和多基因系統進化樹分析將病原菌鑒定為鏈格孢A.alternata。這是首次發現鏈格孢A.alternata能引起新葉壞死癥狀。

對于鏈格孢屬Alternaria的鑒定，國內外對該類群屬種的分類主要依據為形態特征。與其他真菌相比，鏈格孢屬級形態特征明顯，鑒定到屬較為容易，而種級特征變化較小，從形態上鑒定到種較為困難。隨著分子生物學技術的發展，真菌不同屬種上的分子水平差異也逐漸被發現，并加以利用。越來越多的學者將聯合多基因系統發育分析的方法運用到真菌種級別的準確鑒定中。

研究人員在鑒定鏈格孢屬真菌時，根據不同基因序列在鏈格孢屬的種間差異，開發出用于種級鑒定的引物和引物組合，其中Alt?a?1和gpd基因的保守性較高，且在鏈格孢屬不同種間遺傳信息差異大，可以將鏈格孢屬真菌準確鑒定到種［8，10］。研究人員利用不同的基因組合對鏈格孢屬種級分類進行了研究，劉俏等［11］利用rDNAITS、EF1α和Alt?a?1基因序列對病原菌進行了分類鑒定，王啟宇等［12］利用rDNAITS、EF1α和βtubulin基因序列將病原菌進行種級鑒定，TAO等［13］和王彩霞等［14］利用Alt?a?1和?gpd基因序列對鏈格孢屬真菌進行了種級分類。本文選擇ITS、Alt?a?1和?gpd等3個基因序列構建了系統發育樹，結果顯示能很好地將A.alternata與其他種進行區分，說明這3個基因在一定程度上可以反映出種間的進化程度和親緣關系的遠近。

Alternaria是一類重要的植物病原菌，該屬是世界范圍內引起桃樹葉斑病以及果實黑斑病的病原菌，張志銘等［15］、Inoue等［16］、Abata等［17］和Alam等［18］報道了A.alternata是引起桃樹黑斑病的病原菌，迄今為止尚未有A.alternata引起桃樹新葉壞死癥狀的相關報道，本研究結果提示鏈格孢A.alternata在桃樹上能夠引起更加復雜多樣的癥狀。分離獲得的3個A.alternata菌株在致病性測定中表現出明顯差異，其中菌株PP190107具有強致病力，提示不同A.alternata菌株在桃樹上具有致病力分化情況。本研究為進一步認識鏈格孢屬真菌的致病多樣性以及桃樹新葉壞死新癥狀的防治提供了理論依據和新的思路。

參考文獻

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