福建三明地區柑橘病毒類病原種類的鑒定及檢測

張潔 王新 馬崇歡 李丁山 劉國坤 丁新倫 吳祖建

摘要

為了明確福建省三明地區柑橘病毒類病原（病毒和類病毒）種類，利用RTPCR技術對其進行了鑒定和檢測，并對其檢出率進行了分析。結果表明，從207份柑橘葉片樣品中檢出柑橘衰退病毒（citrus?tristeza?virus，?CTV）、柑橘黃化脈明病毒（citrus?yellow?vein?clearing?virus，?CYVCV）、柑橘葉斑駁病毒（citrus?leaf?blotch?virus，?CLBV）和蚜蟲致死麻痹病毒（aphid?lethal?paralysis?virus，?ALPV）等4種病毒以及柑橘曲葉類病毒（citrus?bent?leaf?viroid，?CBLVd）、啤酒花矮化類病毒（hop?stunt?viroid，?HSVd）、柑橘矮化類病毒（citrus?dwarfing?viroid，?CDVd）、柑橘類病毒Ⅴ?（citrus?viroid?Ⅴ，?CVd?Ⅴ）和柑橘類病毒Ⅵ?（citrus?viroid?Ⅵ，?CVd?Ⅵ）等5種類病毒。其中，CTV、CYVCV、CLBV和ALPV的檢出率分別是71.01%、66.67%、0.97%和6.28%，CBLVd、HSVd、CDVd、CVd?Ⅴ和CVd?Ⅵ的檢出率分別是7.25%、28.50%、13.04%、9.18%和6.76%。同時發現，CTV和CYVCV復合侵染的檢出率為54.59%，而品種‘大分1號的病毒檢出率相對較低。本研究首次在柑橘葉片中檢測到ALPV。

關鍵詞

柑橘;?病毒;?類病毒;?檢出率

中圖分類號：

S?436.661.1

文獻標識碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2022129

Identification?and?detection?of?citrus?viruses?and?viroids?in?Sanming?area，?Fujian?province，?China

ZHANG?Jie#，?WANG?Xin#，?MA?Chonghuan，?LI?Dingshan，?LIU?Guokun，?DING?Xinlun*，?WU?Zujian

（Institute?of?Plant?Virology，?Fujian?Agriculture?and?Forestry?University，?State?Key?Laboratory?of?Ecological?Pest

Control?for?Fujian?and?Taiwan?Crops，?Fuzhou?350002，?China）

Abstract

Virus?and?viroid?species?were?identified?and?detected?by?RTPCR?on?citrus?in?Sanming，?Fujian，?and?the?detection?rates?were?analyzed.?The?results?showed?that?citrus?tristeza?virus?（CTV），?citrus?yellow?vein?clearing?virus?（CYVCV），?citrus?leaf?blotch?virus?（CLBV）?and?aphid?lethal?paralysis?virus?（ALPV），?as?well?as?citrus?bent?leaf?viroid?（CBLVd），?hop?stunt?viroid?（HSVd），?citrus?dwarfing?viroid?（CDVd），?citrus?viroid?Ⅴ?（CVd?Ⅴ）?and?citrus?viroid?Ⅵ?（CVd?Ⅵ）?were?identified?from?207?samples.?Among?them，?the?detection?rates?of?CTV，?CYVCV，?CLBV?and?ALPV?were?71.01%，?66.67%，?0.97%?and?6.28%，?respectively，?and?those?of?CBLVd，?HSVd，?CDVd，?CVd?Ⅴ?and?CVd?Ⅵ?were?7.25%，?28.50%，?13.04%，?9.18%?and?6.76%，?respectively.?Moreover，?the?detection?rate?of?CTV?and?CYVCV?mixed?infection?was?54.59%，?and?the?virus?detection?rate?on?‘Dafen?No.1?was?relatively?low.?In?this?study，?ALPV?was?detected?on?citrus?for?the?first?time.

Key?words

citrus;?virus;?viroid;?detection?rate

柑橘屬于蕓香科Rutaceae植物，在世界農產品生產中占有重要地位。柑橘香氣怡人，味道甜美，營養豐富，深受消費者的喜愛，再加上柑橘易于栽培、產量可觀、種植效益優異等諸多優點，使之成為我國栽培面積廣、產量高的果樹之一。然而柑橘病毒類病害不斷出現［1］，我國已報道的柑橘病毒主要有柑橘衰退病毒（citrus?tristeza?virus，?CTV）［2］、溫州蜜柑萎縮病毒（satsuma?dwarf?virus，?SDV）［3］、柑橘碎葉病毒（citrus?tatter?leaf?virus，?CTLV）［4］、柑橘黃化脈明病毒（citrus?yellow?vein?clearing?virus，?CYVCV）［5］、柑橘葉斑駁病毒（citrus?leaf?blotch?virus，?CLBV）［6］、柑橘鱗皮病毒（citrus?psorosis?virus，?CPsV）［7］、柑橘脈突病毒（citrus?vein?enation?virus，?CVEV）［8］和柑橘褪綠矮縮病毒（citrus?chlorotic?dwarfassociated?virus，?CCDaV）［9］等8種;已報道的類病毒主要有柑橘裂皮類病毒（citrus?exocortis?viroid，?CEVd）、柑橘樹皮裂紋類病毒（citrus?bark?cracking?viroid，?CBCVd）、柑橘曲葉類病毒（citrus?bent?leaf?viroid，?CBLVd）、啤酒花矮化類病毒（hop?stunt?viroid，?HSVd）、柑橘矮化類病毒（citrus?dwarfing?viroid，?CDVd）、柑橘類病毒Ⅴ（citrus?viroid?Ⅴ，?CVd?Ⅴ）和柑橘類病毒Ⅵ?（citrus?viroid?Ⅵ，?CVd?Ⅵ）［10］等7種。其中CYVCV引起的柑橘黃脈病是我國一種新發病害，自從2009年在云南瑞麗發現以來［5］，幾乎遍布所有柑橘產區［11］。另外，柑橘黃化斑駁相關病毒（citrus?yellow?mottleassociated?virus，?CiYMaV）?2020年首次在巴基斯坦的柑橘上報道［12］，與CYVCV同屬于甲型線性病毒科Alphaflexiviridae印度柑橘病毒屬Mandarivirus，我國柑橘上尚未發現該病毒［12］。而蚜蟲致死麻痹病毒（aphid?lethal?paralysis?virus，?ALPV）首次從南非的禾谷縊管蚜Rhopalosiphum?padi中分離，屬于雙順反子病毒科Dicistroviridae蟋蟀麻痹病毒屬Cripavirus［1314］。近年來，隨著大規模測序技術的發展，ALPV在多種植物中被檢測到［1516］。

福建省三明市擁有悠久的柑橘種植歷史，目前該地區的柑橘種植面積和年產量均位列福建省前茅，是福建省重要的柑橘生產地區。近幾年，該地區多處柑橘果園出現了黃化、樹勢減弱等疑似病毒病癥狀，對當地柑橘產業造成了嚴重威脅。本研究利用RTPCR技術對該地區柑橘的多種病毒和類病毒進行了檢測分析。

1?材料與方法

1.1?材料

柑橘葉片樣品采集于福建省三明市莘口鎮及其周邊地區。采用隨機取樣法，不同地塊及不同品種等共采集207份樣品，主要為溫州蜜柑的不同品種（含‘大分1號20份、‘大浦28份、‘宮川17份、‘肥之署9份、‘市文8份、‘宮本6份、‘由良4份、‘大分4號3份、‘山川3份以及未知品種92份）和少量其他柑橘類品種（17份）。樣品及時放入液氮速凍并置于超低溫冰箱中保存備用。

1.2?方法

1.2.1?總RNA的提取

參照姜娟等［17］的方法并加以改進，使用TaKaRa?RNAiso?Plus［寶日醫生物技術（北京）有限公司］進行總RNA的提取。步驟簡述如下：取30?mg柑橘葉片用液氮研磨;加入1?mL?RNAiso?Reagent，振蕩混勻后室溫靜置，12?000?r/min離心5?min，取上清液加入200?μL氯仿，振蕩混勻后室溫靜置，12?000?r/min離心15?min;取上清液加入等體積異丙醇，-20℃靜置，12?000?r/min離心10?min，棄上清液并保留沉淀，加入75%乙醇洗滌沉淀，隨后加入20?μL?RNaseFree?ddH2O溶解，即得總RNA，置于超低溫冰箱中保存。

1.2.2?RTPCR

使用GenStar?StarScript?Ⅱ?Firststrand?cDNA?Synthesis?Mix（北京康潤誠業生物科技有限公司）進行第一鏈cDNA的合成，反應體系為：總RNA?1?μg，2×RT?Reaction?Mix（with?Primer）10?μL，StarScript?Ⅱ?RT?Mix?1?μL，DEPCddH2O補足至20?μL。反應程序為：42℃?30?min，85℃?5?min，4℃保存，得到的第一鏈cDNA置于-20℃冰箱中保存。

使用Phanta?Max?SuperFidelity?DNA?聚合酶（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）進行PCR反應（引物序列見表1），反應體系為：2×Phanta?Max?Buffer?25?μL，dNTP?Mix?（10?mmol/L）?1?μL，上、下游引物（10?μmol/L）各2?μL，Phanta?Max?SuperFidelity?DNA?Polymerase?1?μL，第一鏈cDNA?4?μL，ddH2O?15?μL。反應程序為：95℃預變性3?min;95℃?15?s，退火溫度?15?s，72℃?30?s/kb，30個循環;72℃?5?min;16℃保存。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后，目的條帶使用HiPure?Gel?Pure?DNA?Mini試劑盒（廣州美基生物科技有限公司）進行產物回收。

1.2.3?克隆載體連接

使用Zero?Background?pTOPOTA?Simple克隆試劑盒（北京艾德萊生物科技有限公司）進行TA克隆：純化的DNA片段40?ng，pTOPOTA?Simple?Vector?1?μL，10×Enhancer?1?μL，ddH2O補足至10?μL，室溫靜置5?min，得到的連接產物使用TRANS?Trans1T1?Phage?Resistant化學感受態細胞（北京全式金生物技術有限公司）進行大腸桿菌轉化。PCR篩選的陽性克隆菌株由鉑尚生物技術（上海）有限公司進行測序。

2?結果與分析

2.1?柑橘病毒類病原的檢測

本研究利用特異性引物（表1）對柑橘上常見的病毒和類病毒分別進行RTPCR擴增，結果如圖1所示，有4種病毒和5種類病毒擴增得到特異性條帶，分別是CYVCV（614?bp）、CTV（553?bp）、CLBV（425?bp）、ALPV（1?388?bp）、HSVd（316?bp）、CDVd（297?bp）、CBLVd（233?bp）、CVd?Ⅵ（236?bp）和CVd?Ⅴ（190?bp），經由測序分析后確認為目的病毒或類病毒片段。而對CiYMaV、CTLV、CPsV、SDV、CBCVd?和CEVd的RTPCR檢測均未得到特異性條帶（圖片未示出）。

2.2?柑橘病毒類病原的檢出率分析

為了明確三明地區柑橘病毒和類病毒的侵染情況，對采集的207份樣品進行RTPCR擴增，并對其檢出率進行計算。結果顯示，

CTV和CYVCV兩種病毒的檢出率較高，分別達71.01%和66.67%;HSVd和CDVd兩種類病毒的檢出率分別為28.50%和13.04%;其他病原的檢出率由高到低分別是CVd?Ⅴ?9.18%、CBLVd?7.25%、CVd?Ⅵ?6.76%、ALPV?6.28%和CLBV?0.97%（圖2）。

2.3?柑橘病毒類病原的復合侵染分析

為了明確病毒和類病毒復合侵染情況，對所有樣品單獨和復合侵染的檢出率進行統計。結果顯示，全部207份樣品中，檢出病毒（含所有病毒）的樣品有172份，檢出類病毒（含所有類病毒）的樣品有103份，檢出率分別為83.09%、49.76%。而復合侵染最多的組合是CTV+CYVCV，具有這種復合侵染組合的樣品數為46份，檢出率為22.22%;另外CTV+CYVCV+HSVd復合侵染組合的樣品數為22份，檢出率為10.63%;另有2份樣品同時被6種病毒或類病毒復合侵染，分別是CTV+CYVCV+ALPV+CLBV+HSVd+CDVd和CTV+CYVCV+HSVd+CDVd+CBLVd+CVd?Ⅵ;所有含有CTV和CYVCV的樣品數為113份，檢出率為54.59%（圖3）。

2.4?不同溫州蜜柑品種中病毒類病原的檢出特征分析

為了分析該地區主要種植的溫州蜜柑品種與已檢出病毒類病原檢出率之間的相關性，選擇樣品大于6份的品種進行分析。結果顯示，‘大分1號的病毒檢出率最低，為25.00%;‘宮川‘宮本和‘市文的病毒檢出率高達100%;類病毒的檢出率與病毒檢出率之間無明顯關系，但‘宮本和‘肥之署的2種病原檢出率均較高（表2）。

3?結論與討論

本研究對福建三明地區柑橘病毒類病原進行了鑒定，結果表明該地區柑橘病毒病發病率較高，尤其是CTV和CYVCV;病原物種類多，有4種病毒和5種類病毒，并且復合侵染嚴重，其中CTV和CYVCV的復合侵染較高。CYVCV幾乎遍布我國所有柑橘產區［11］。CTV引起的柑橘衰退病對全世界的柑橘產業都造成嚴重損失［23］，在我國柑橘產區也均有不同程度的發生［22，2426］。CTV和CYVCV復合侵染的情況已被多次報道［2729］，但二者復合侵染對柑橘產業的影響有待進一步研究。而與CYVCV同屬于印度柑橘病毒屬的CiYMaV在本地區未檢測到，與前人的研究結果一致［12］。

本實驗室前期通過高通量測序發現柑橘樣品中可能存在ALPV，本研究通過RTPCR技術驗證了ALPV的存在。研究表明，雙順反子病毒科的病毒，比如ALPV和禾谷縊管蚜病毒（rhopalosiphum?padi?virus，?RhPV），可利用非寄主植物（不能復制）作為“載體”從而侵染新昆蟲寄主（可復制），而植物與該類病毒互惠共生的關系，或可被植物用來作為天然的生物農藥［30］。ALPV已在玉米［16］、黃瓜［15］、菜豆［31］等植物中發現，本研究首次在柑橘上檢測到該病毒，而ALPV與柑橘的關系有待進一步研究。

本研究結果發現‘大分1號的病毒檢出率較低，‘宮本‘宮川和‘肥之署的檢出率較高，這與胡啟鑌的結果［32］一致，與之略有差異的是本研究中‘市文的病毒檢出率為100%，或許與該樣品數量較少并且檢測病毒不只包括CYVCV有關。綜上，實際生產過程中，柑橘種植戶或可因地制宜合理引種‘大分1號。

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（責任編輯：田?喆）