miR-125a-5p通過黏著斑通路對(duì)鋁染毒GC2-spd細(xì)胞凋亡的影響

黃艷新 陳文成 彭慧鑫 韋光吉 龐艷芳 元輝雄

【摘要】 目的 探討miR-125a-5p在鋁染毒小鼠精母細(xì)胞系（GC2-spd）模型中對(duì)黏著斑信號(hào)通路及GC2-spd細(xì)胞凋亡的影響。方法 建立鋁染毒GC2-spd細(xì)胞模型，分為對(duì)照組（CG），鋁染毒組（ALG），鋁染毒組＋miR-125a-5p inhibitor陰性對(duì)照組（ALG＋inhibitor NC）及鋁染毒組＋miR-125a-5p inhibitor 組（ALG＋inhibitor）；利用RT-qPCR檢測(cè)ALG與CG細(xì)胞中miR-125a-5p的表達(dá)情況；利用Western blot檢測(cè)CG組、ALG組、ALG＋inhibitor NC組及ALG＋inhibitor組Itga7、Pak4、Akt1、Bax及Caspase-9的表達(dá)情況；利用CCK8實(shí)驗(yàn)及流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組GC2-spd細(xì)胞的活性和凋亡率。結(jié)果 RT-qPCR 結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，ALG組細(xì)胞中miR-125a-5p的表達(dá)顯著升高；Western blot結(jié)果顯示，抑制miR-125a-5p的表達(dá)后，可顯著升高鋁染毒GC2-spd細(xì)胞中Itga7、Pak4和Akt1的表達(dá)，降低Bax及Caspase-9的表達(dá)；CCK8和流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，抑制miR-125a-5p的表達(dá)后，可顯著提高GC2-spd細(xì)胞的活性，降低細(xì)胞的凋亡率。結(jié)論 miR-125a-5p inhibitor可通過提高Itga7、Pak4和Akt1的表達(dá)，促進(jìn)黏著斑信號(hào)通路激活，抑制細(xì)胞凋亡，提高細(xì)胞的活性，從而抑制鋁染毒GC2-spd細(xì)胞的凋亡作用。

【關(guān)鍵詞】 miR-125a-5p；黏著斑通路；鋁染毒；小鼠精母細(xì)胞系細(xì)胞

中圖分類號(hào)：R114 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2023.05.003

【Abstract】 Objective To investigate the effect of miR-125a-5p on focal adhesion signaling pathway and apoptosis of GC2-spd cells in aluminum-exposed mouse spermatocyte cell line （GC2-spd） model.Methods Aluminum-exposed GC2-spd cell model was established， and cells were divided into control group （CG）， aluminum exposure group （ALG）， ALG + miR-125a-5p inhibitor negative control （ALG＋inhibitor NC） group， and ALG+miR-125a-5p inhibitor （ALG + inhibitor） group. The expressions of miR-125a-5p in the ALG and the CG were detected by RT-qPCR; the expressions of Itga7， Pak4， Akt1， Bax and Caspase-9 in the CG， the ALG， the ALG＋inhibitor NC group and the ALG + inhibitor group were detected by Western blot; and the activity and apoptosis rate of GC2-spd cells in each group were detected by CCK-8 assay and flow cytometry. Results RT-qPCR results showed that the expression of miR-125a-5p in ALG cells was significantly increased while compared with that of the normal control group; Western blot results showed that inhibiting the expression of miR-125a-5p could significantly increase the expressions of Itga7， Pak4 and Akt1， and decrease the expressions of Bax and Caspase-9 in aluminum-exposed GC2-spd cells; the results of CCK8 and flow cytometry experiments showed that inhibiting the expression of miR-125a-5p could significantly increase the activity of GC2-spd cells and reduce the apoptosis rate of cells.Conclusion miR-125a-5p inhibitor can promote the activation of focal adhesion pathway， inhibit cell apoptosis， and improve cell activity by increasing Itga7， Pak4 and Akt1， thereby inhibiting the apoptosis of GC2-spd cells exposed to aluminum.

【Key words】 miR-125a-5p; focal adhesion pathway; aluminum exposure; GC2-spd cells

據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全世界正常生育的夫婦中，就有10%～15%的夫婦面臨不孕不育問題，其中大約有50%的病例是由男性因素引起的［1］。導(dǎo)致男性不育的因素有很多，致病機(jī)制尚未完全明確，由于精子發(fā)生的過程受到很多遺傳和外界環(huán)境因素的影響，精液質(zhì)量低下可能與先天性發(fā)育異常、免疫、感染和內(nèi)分泌等多種因素有關(guān)，金屬元素暴露過量也是重要原因之一［2］。鋁是地殼中含量最豐富的金屬元素，由于其具有良好的理化性質(zhì)，在日常生活中的使用非常廣泛，人類主要通過職業(yè)性、醫(yī)源性和生活性接觸鋁［3］。有研究表明，睪丸中低濃度的鋁（3.35 μg/g）足以損害精子發(fā)生和精子質(zhì)量［4］。已有的鋁元素對(duì)雄性動(dòng)物生殖功能影響的研究主要集中在生殖毒性作用方面，這些毒性作用主要表現(xiàn)為精液質(zhì)量下降、精子活力降低、精子線粒體損傷，并可進(jìn)一步引發(fā)精子活力與存活率改變。但是對(duì)鋁的生殖毒性發(fā)生在基因水平的改變研究甚少。

黏著斑通路在維持細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)和功能中起著重要作用，其通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)蛋白磷酸化、pH值和鈣水平來調(diào)節(jié)細(xì)胞的存活、增殖、分化和遷移［5］。黏著斑通路中的蛋白包括整合素（integrin alpha-7，Itga7）、P21（RAC1）活化激酶4［P21（RAC1） activated kinase 4，Pak4］以及絲氨酸/蘇氨酸激酶1（serine-threonine protein kinase 1，Akt1）等，這些蛋白相互之間或與細(xì)胞骨架之間均可相連，也稱為整合素信號(hào)通路。有實(shí)驗(yàn)研究表明，黏著斑通路中的Pak4和ELK1的低表達(dá)，顯著增加豬顆粒細(xì)胞的凋亡［6］，Pak4的表達(dá)增加了凋亡蛋白Bad的磷酸化，并抑制了Caspase的激活，從而保護(hù)細(xì)胞免受凋亡［7］。miR-125a-5p參與雄性繁殖， miR-125a-5p敲低促進(jìn)細(xì)胞增殖，而miR-125a-5p過表達(dá)抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡［8］。miR-125a-5p是否通過黏著斑信號(hào)通路調(diào)控鋁染毒生精細(xì)胞凋亡還未見有報(bào)道。本研究以GC2-spd細(xì)胞為研究對(duì)象，建立鋁染毒細(xì)胞模型，檢測(cè)miR-125a-5p與黏著斑信號(hào)通路及細(xì)胞凋亡的關(guān)系，將為鋁暴露導(dǎo)致的男性生殖功能損傷的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

小鼠精母細(xì)胞系（GC2-spd）細(xì)胞株購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

1.2 主要試劑

六水合三氯化鋁（AlCl3·6H2O），購(gòu)于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；CCK-8細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒購(gòu)于日本同仁公司，Annexin V-FITC雙凋亡試劑盒購(gòu)于賽默飛生物有限公司；miRNA第一鏈cDNA（莖環(huán)法）逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、miR-125a-5p inhibitor、轉(zhuǎn)染試劑體LipofectamineTM 2000購(gòu)于上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；Itga7抗體購(gòu)于SANTA Cruz公司，Pak4抗體購(gòu)于CST公司，Akt1抗體購(gòu)于Invitrogen公司，Bax、Caspase-9及GAPDH抗體購(gòu)于Sigma公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

GC2細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中（含100 U/mL青霉素及0.1 mg/mL鏈霉素），置于37 ℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)2～3 d進(jìn)行傳代一次，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。

1.4 鋁染毒細(xì)胞模型的建立及實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分組

將培養(yǎng)瓶中的GC2-spd細(xì)胞以合適密度接種于六孔板中，正常培養(yǎng)（37 ℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)）24 h后，將GC2-spd細(xì)胞按以下模型進(jìn)行分組，對(duì)照組（CG）：GC2-spd細(xì)胞不作任何處理；鋁染毒組（ALG）：將培養(yǎng)24 h后六孔板中的GC2-spd細(xì)胞更換成含2 mmol/L濃度鋁的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h；鋁染毒組+miR-125a-5p inhibitor陰性對(duì)照組（ALG+inhibitor NC）：六孔板中的GC2-spd細(xì)胞培養(yǎng)24 h后轉(zhuǎn)染miR-125a-5p inhibitor NC，培養(yǎng)6 h后更換成含2 mmol/L濃度鋁的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h；鋁染毒組+miR-125a-5p inhibitor（ALG＋inhibitor）組：六孔板中的GC2-spd細(xì)胞培養(yǎng)24 h后轉(zhuǎn)染miR-125a-5p inhibitor，培養(yǎng)6 h后更換成含2 mmol/L濃度鋁的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.5 RT-qPCR檢測(cè)miR-125a-5p的表達(dá)

分別提取對(duì)照組與鋁染毒組GC2-spd細(xì)胞總RNA，按照miRNA第一鏈cDNA（莖環(huán)法）逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作說明將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA（miRNA125a-5p-RT GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCATCACAA，U6-F GCTTCGGCACATATACTAAAAT，U6-R CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT）。利用RT-qPCR檢測(cè)兩組細(xì)胞中miR-125a-5p的表達(dá)變化，以cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增（miR-125a-5p-F GCTCCTGAGACCCTAAC；miR-125a-5p-R GTGCAGGGTCCGAGGT），RT-qPCR 反應(yīng)條件：預(yù)變性94 ℃ 30 s，變性94 ℃ 5 s、退火56 ℃ 30 s、延伸72 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。以U6為內(nèi)參，數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析。

1.6 GC2-spd細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將培養(yǎng)瓶中的GC2-spd以1×105個(gè)/mL密度的細(xì)胞接種在六孔培養(yǎng)板上，培養(yǎng)24 h后用無菌的PBS洗滌，加入1.5 mL opti-MEM的培養(yǎng)基，同時(shí)將miRNA試劑各5 μL/孔與250 μL/孔o(hù)pti-MEM混勻，室溫靜置5 min，與5 μL/孔脂質(zhì)體（Lipofectamine2000）與250 μL/孔o(hù)pti-MEM混勻，室溫靜置 5 min，然后將上述兩種液體混合靜置20 min，將混合液加入6孔板中，每孔500 μL。培養(yǎng)6 h后換成含2 mmol/L濃度鋁的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，最后收集細(xì)胞進(jìn)行分析。

1.7 Western blot檢測(cè)細(xì)胞中Itga7、Pak4、Akt1、Bax及Caspase-9的表達(dá)變化

收集對(duì)照組、鋁染毒組、鋁染毒組＋miR-125a-5p inhibitor 陰性對(duì)照組及鋁染毒組+miR-125a-5p inhibitor組的細(xì)胞，利用RIPA裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白，用BCA法檢測(cè)總蛋白的濃度。常規(guī)SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，Itga7抗體（1∶500）、Pak4抗體（1∶500）、Akt1抗體（1∶500）、Caspase-9 抗體（1∶1000）及β-Actin 抗體（1∶10 000）4 ℃孵育過夜，熒光Ⅱ抗（1∶1000）室溫孵育2 h后，Odyssey曝光，用Termo Fisher Science的ECL化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)檢測(cè)蛋白質(zhì)信號(hào)，用Image J軟件分析蛋白質(zhì)條帶的灰度值。

1.8 細(xì)胞活力的檢測(cè)

將GC2-spd細(xì)胞按照5×103的密度接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h后按照上述方法將細(xì)胞分為4組，再繼續(xù)培養(yǎng)24 h后檢測(cè)各組活性，每孔加入10 μL CCK8溶液，正常培養(yǎng)條件下繼續(xù)孵育4 h，酶標(biāo)儀450 nm處測(cè)OD值。

1.9 GC2-spd細(xì)胞凋亡的檢測(cè)

將GC2-spd細(xì)胞以1×105個(gè)/mL密度接種于六孔板，培養(yǎng)24 h后按照上述分組處理，細(xì)胞培養(yǎng)完成后按照Annexin V-FITC和PI凋亡試劑盒操作說明對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理，用流式分析儀分析細(xì)胞凋亡情況。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布和方差齊性的兩樣本數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)，否則采用t檢驗(yàn)。多樣本數(shù)據(jù)比較采用單因素方差（one-way ANOVA）分析，進(jìn)行組間兩兩比較時(shí)，方差齊者采用SNK檢驗(yàn)，方差不齊者采用Games-Howell檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05，雙側(cè)檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 對(duì)照組與鋁染毒組GC2-spd細(xì)胞中miR-125a-5p的表達(dá)變化

利用RT-qPCR檢測(cè)兩組細(xì)胞中miR-125a-5p的表達(dá)情況，結(jié)果如圖1所示，與對(duì)照組比較，鋁染毒組GC2-spd細(xì)胞中miR-125a-5p的表達(dá)顯著升高（P<0.01）。

2.2 Itga7、Pak4、Akt1、Bax及Caspase-9在各組細(xì)胞中的表達(dá)情況

利用Western blot檢測(cè)對(duì)照組、鋁染毒組、鋁染毒組+miR-125a-5p inhibitor NC組及鋁染毒組+miR-125a-5p inhibitor組Itga7、Pak4、Akt1、Bax及Caspase-9蛋白的表達(dá)情況，圖2A是各組細(xì)胞中各蛋白表達(dá)量的Western blot圖，圖2B-F是各組細(xì)胞蛋白表達(dá)量的灰度值分析。從圖2B-F我們可以看出，鋁染毒組細(xì)胞中的Itga7、Pak4、Akt1蛋白的表達(dá)量低于對(duì)照組（P<0.05），而Bax及Caspase-9蛋白的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組（P<0.01）；轉(zhuǎn)染miR-125a-5p inhibitor后，GC2-spd細(xì)胞中的Itga7、Pak4、Akt1蛋白的表達(dá)量高于鋁染毒組（P<0.05），而Bax和Caspase-9蛋白的表達(dá)量低于鋁染毒組（P<0.05）。表明鋁染毒通過miR-125a-5p負(fù)向調(diào)節(jié)黏著斑信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而影響生精細(xì)胞的增殖。

2.3 CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組GC2-spd細(xì)胞的活性

CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，鋁染毒組細(xì)胞的活性顯著降低（P<0.01）；而轉(zhuǎn)染miR-125a-5p inhibitor后，細(xì)胞的活性顯著升高（P<0.05）。見圖3。這表明在鋁染毒的情況下，抑制miR-125a-5p后，細(xì)胞凋亡減少，活力增高。

2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組GC2-spd細(xì)胞凋亡率的變化

流式雙熒光凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，鋁染毒組細(xì)胞的凋亡率顯著增加（P<0.01）；而轉(zhuǎn)染miR-125a-5p inhibitor后，細(xì)胞的凋亡率顯著降低。見圖4。這表明在鋁染毒的情況下，抑制miR-125a-5p后，細(xì)胞凋亡減少（P<0.01）。

3 討 論

精子的發(fā)生是睪丸生精小管內(nèi)的精原干細(xì)胞經(jīng)歷有絲分裂和減數(shù)分裂并經(jīng)過初級(jí)精母細(xì)胞、次級(jí)精母細(xì)胞和精細(xì)胞發(fā)展演變而成的，在產(chǎn)精的過程中，細(xì)微的內(nèi)部或者外部環(huán)境的變化都會(huì)引起精子質(zhì)量的變化。生精細(xì)胞在精子的發(fā)生過程中起著重要作用，而外部環(huán)境在生精細(xì)胞分化發(fā)育階段尤為關(guān)鍵。金屬過量暴露是外部環(huán)境因素影響男性不育的原因之一，有研究顯示，金屬過量暴露會(huì)導(dǎo)致生精細(xì)胞凋亡信號(hào)通路的激活［9］，人們可能直接或間接地通過工業(yè)接觸、受污染的食物或水接觸到這些金屬。鋁是一種對(duì)男性生殖系統(tǒng)有不利影響的金屬元素之一，長(zhǎng)期暴露于較高劑量的鋁會(huì)對(duì)精子的活力、存活率、計(jì)數(shù)和形態(tài)產(chǎn)生有害影響［10］。睪丸中鋁的積累會(huì)導(dǎo)致精子細(xì)胞壞死，并通過多種機(jī)制觸發(fā)其他生殖毒性，例如氧化應(yīng)激、生精細(xì)胞凋亡等，最終使精子濃度降低和精子活力下降，但是具體的分子機(jī)制不明［11］。miRNAs作為重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在睪丸生精過程中發(fā)揮重要作用，特別是在生精細(xì)胞的增殖、分化和凋亡中起了關(guān)鍵性的作用。miR-125a-5p在腫瘤細(xì)胞中研究比較多，在細(xì)胞的增殖分化與凋亡中發(fā)揮重要作用，有多篇文獻(xiàn)報(bào)道，miR-125a-5p的靶基因是抗凋亡基因Bcl-2，miR-125a-5p與 Bcl-2 3′UTR結(jié)合，使Bcl-2表達(dá)量顯著降低，Bax、細(xì)胞色素C的釋放和Caspase-3表達(dá)量顯著升高，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［12］；miR-125a-5p還可通過作用于PI3K/Akt通路，調(diào)控Akt、Bax、Bcl-2、PI3K蛋白表達(dá)量，抑制肝癌細(xì)胞增殖，同時(shí)促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡［13］；在垂體瘤細(xì)胞中，miR-125a-5p表達(dá)降低，miR-125a-5p過表達(dá)抑制垂體瘤AtT20細(xì)胞增殖能力并促進(jìn)細(xì)胞凋亡［14］。這些研究都表明miR-125a-5p具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。在腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）作用下，睪丸間質(zhì)細(xì)胞中miR-125a-5p的表達(dá)具有明顯的差異［15］。還有研究發(fā)現(xiàn)miR-125a-5p在晚發(fā)性性腺功能減退癥患者中表達(dá)下調(diào)［16］。這些研究結(jié)果表明miR-125a-5p可能與男性生殖有關(guān)。LIANG等人［17］研究發(fā)現(xiàn)miR-125a-5p能夠抑制GC2細(xì)胞中線粒體功能，減少細(xì)胞ATP產(chǎn)生，并增加細(xì)胞活性氧和DNA損傷水平，參與精子衰老的過程；TENG等人［18］還在研究睪丸支持細(xì)胞（Sertoli）中發(fā)現(xiàn)，miR-125a-5p通過PI3K/Akt通路來調(diào)控Sertoli的增殖和凋亡，miR-125a-5p基因敲除促進(jìn)Sertoli細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡，而過表達(dá)則抑制Sertoli細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。這些研究結(jié)果表明miR-125a-5p升高可能預(yù)示男性生殖細(xì)胞發(fā)展的不良結(jié)局。本研究結(jié)果與前人的報(bào)道是一致的，我們通過建立鋁染毒GC2-spd細(xì)胞模型，檢測(cè)miR-125a-5p在GC2-spd細(xì)胞中的表達(dá)變化，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，鋁染毒細(xì)胞中的miR-125a-5p表達(dá)顯著升高，GC2-spd細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受到抑制，細(xì)胞凋亡明顯，而轉(zhuǎn)染miR-125a-5p inhibitor后，細(xì)胞的凋亡率明顯減少。我們的結(jié)果表明鋁染毒可促進(jìn)生精細(xì)胞凋亡，miR-125a-5p可能在其中發(fā)揮重要的作用。

黏著斑是細(xì)胞骨架的重要結(jié)構(gòu)，由細(xì)胞膜上的整合素和細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞骨架蛋白組成，可以通過協(xié)助跨膜信號(hào)的傳導(dǎo)來驅(qū)動(dòng)細(xì)胞骨架的組裝與解聚，從而控制細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、擴(kuò)散、黏附、遷移以及凋亡等行為［19］。黏著斑通路中的Itga7、Pak4及Akt1等蛋白在細(xì)胞骨架之間都可以相連，并參與了精子細(xì)胞的形成和分化［20］。Itga7屬于整合素家族的黏附分子，在多個(gè)細(xì)胞過程中的細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)相互作用中發(fā)揮作用［21］。Itga7在癌細(xì)胞中表達(dá)增高，具有促進(jìn)癌細(xì)胞增殖的作用［22］。Pak4屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶，對(duì)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、存活、細(xì)胞周期和增殖至關(guān)重要，有研究表明，抑制Pak4通過誘導(dǎo)異常的微絲和微管的動(dòng)力學(xué)導(dǎo)致減數(shù)分裂停滯，從而影響生殖細(xì)胞的增殖［23］。Akt信號(hào)通路在調(diào)控生精細(xì)胞增殖、分化和精子發(fā)生過程中具有重要的作用，大鼠睪丸生精受損、生精細(xì)胞增殖分化減弱與Akt表達(dá)受到抑制有關(guān)［24］。在我們的研究當(dāng)中，作為黏著斑通路中的關(guān)鍵蛋白Itga7、Pak4及Akt1在鋁染毒后的GC2-spd細(xì)胞中被顯著下調(diào)，抑制miR-125a-5p的表達(dá)后，鋁染毒的GC2-spd細(xì)胞中Itga7、Pak4及Akt1顯著提高，凋亡相關(guān)蛋白Caspase-9和Bax顯著下降；CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與鋁染毒組相比較，抑制miR-125a-5p的表達(dá)后，GC2-spd細(xì)胞的活性顯著升高；流式雙熒光檢測(cè)細(xì)胞凋亡率也印證了我們的結(jié)果，抑制miR-125a-5p的表達(dá)后鋁染毒的GC2-spd細(xì)胞凋亡率明顯下降。我們的結(jié)果表明鋁染毒后通過上調(diào)miR-125a-5p抑制黏著斑通路，使通路中的相關(guān)蛋白表達(dá)降低而凋亡蛋白表達(dá)增高，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。然而，miR-125a-5p是否與黏著斑通路中的某些蛋白具有相互作用還有待進(jìn)一步研究，此前有多篇文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iR-125a-5p與抗凋亡蛋白BCL-2的關(guān)系，有沒有可能miR-125a-5p直接調(diào)控BCL-2促進(jìn)生精細(xì)胞凋亡，或者是miR-125a-5p引起GC2線粒體損傷，通過線粒體途徑促進(jìn)生精細(xì)胞凋亡，或者miR-125a-5p是否與黏著斑通路中的某些蛋白具有靶向的相互作用，這些都有待進(jìn)一步的研究。

綜上所述，鋁染毒促進(jìn)GC2-spd細(xì)胞凋亡增加，使GC2-spd細(xì)胞中miR-125a-5p表達(dá)上調(diào)，抑制miR-125a-5p的表達(dá)，激活黏著斑信號(hào)通路，促進(jìn)GC2-spd細(xì)胞增殖，減少細(xì)胞凋亡，提高細(xì)胞的活性，從而抑制鋁染毒GC2-spd細(xì)胞的凋亡作用。總之，鋁染毒有可能通過上調(diào)miR-125a-5p負(fù)性調(diào)控黏著斑信號(hào)通路，影響生精細(xì)胞的增殖與凋亡。

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2022-10-29 修回日期：2022-12-22）

（編輯：王琳葵 潘明志）

基金項(xiàng)目：廣西自然科學(xué)基金（2020GXNSFAA297257）；廣西高校中青年教師科研基礎(chǔ)能力提升項(xiàng)目（2020KY13017）；廣西壯族自治區(qū)中醫(yī)藥管理局自籌經(jīng)費(fèi)科研課題（GZZC2020248）；廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生健康委員會(huì)自籌經(jīng)費(fèi)科研課題（Z20201416）

作者簡(jiǎn)介：黃艷新，女，主管技師，醫(yī)學(xué)學(xué)士，在讀碩士研究生，研究方向：生殖免疫的臨床及基礎(chǔ)研究。E-mail：44842478@qq.com

通信作者：陳文成。E-mail：cwcch3268@163.com