滇重樓葉片和花萼的SPAD值與葉綠素含量的相關性分析

駱亮仲 李卓蔚 周濃 夏李 付旭娟 黃梅 郭冬琴

摘 要 為探究滇重樓葉片和花萼的SPAD值與葉綠素含量之間的相關性，以4種生長年限的滇重樓葉片和花萼為試驗材料，采用SPAD葉綠素儀和丙酮法測定葉片SPAD值和葉綠素含量。結果表明，滇重樓葉片、花萼的SPAD值和葉綠素含量各不相同，并且兩者受年際間環(huán)境影響較大。相關分析表明，SPAD值與葉綠素含量間呈極顯著相關（p＜0.01）。對不同生長年限的滇重樓葉片、花萼的SPAD值與葉綠素含量進行函數(shù)方程擬合，再對實測值與預測值進行方差分析，結果表明兩者間無顯著性差異，因此可通過將SPAD值代入方程估算滇重樓葉綠素含量。綜上所述，可以采用SPAD值代替?zhèn)鹘y(tǒng)的葉綠素含量，這為快速測定大田滇重樓葉片和花萼的葉綠素含量提供了新方法。

關鍵詞 滇重樓；葉綠素；不同生長年限；SPAD值；相關性分析

中圖分類號：R282.2 文獻標志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2023.03.035

滇重樓（Paris polyphylla var. yunnanensis）作為延齡草科重樓屬植物，是一種常見的名貴中藥材，根莖入藥，具有涼肝定驚、消腫止痛、清熱解毒的功效，是“熱毒清”“宮血寧”“季德勝蛇藥片”和“抗病毒顆?！钡犬a(chǎn)品的主要原材料[1]，常用于治療毒蛇咬傷、咽喉腫痛、跌打傷痛等病癥[2]。近些年來，由于中藥產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展，市面上對滇重樓的需求大幅提升，導致大量野生滇重樓被采挖空，野生滇重樓的產(chǎn)量已不能滿足人們的需求，因此，人工大規(guī)模種植高產(chǎn)優(yōu)質的滇重樓刻不容緩。

植物光合作用離不開葉綠素，葉綠素含量直接影響綠色植株的光合效率，進而影響植株的營養(yǎng)狀況和生長品質，是植物生長的一項重要指標[3]。目前對葉綠素含量的測定方法主要有SPAD直接測定法和傳統(tǒng)的丙酮浸提法，后者測定結果較精確，但測定時會損壞葉片，且操作復雜、耗時費力。而前者則可以在不破壞葉片完整性的情況下，快速準確地測定出植株葉綠素含量的相對值[4]，且不受外部環(huán)境的影響，因而此法逐漸被學者采用，已在荔枝、柞樹、煙草、蕹菜和江孜沙棘等[5-9]植物中廣泛應用。何麗斯等以高山杜鵑為試驗材料，發(fā)現(xiàn)葉片內SPAD值與葉綠素含量間存在顯著相關性，可以用SPAD值間接預測植株葉片的葉綠素含量，但大量數(shù)據(jù)顯示，不同植株或是同一植株的不同部位，其擬合的數(shù)學模型仍存在著很大的差異性[10]。目前，關于滇重樓葉片內SPAD值與葉綠素含量之間的關系尚未見報道，故本試驗以不同生長年限的滇重樓葉片和花萼為供試材料，探究其SPAD值與葉綠素含量之間的相關性，旨在為生產(chǎn)中利用SPAD葉綠素儀估測滇重樓葉片營養(yǎng)狀況提供參考依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?供試材料

新鮮的滇重樓葉片采自于貴州省安順市西秀區(qū)安順學院科研實驗基地，經(jīng)安順學院沈昱翔副教授鑒定為滇重樓。試驗于2021年9月15日10： 00—12： 00進行采樣，隨機選取不同生長年限的植株各10株，每個植株摘取1片長勢較好、無病蟲害的葉片和花萼，先用SPAD葉綠素儀測量3次，并記錄數(shù)據(jù)；再將其摘下，做好標記，閉光、低溫保存，采用丙酮法測定其葉綠素含量。

1.2 ?測定方法

1.2.1 ?SPAD直接測定法

采用葉綠素含量測定儀（CCM200型）測定葉片和花萼的頂部、中部、底部的SPAD值，測定時應注意避開葉片的損傷部位，以保證結果的準確性，求取平均值。

1.2.2 ?丙酮法測定

將上述測定的新鮮葉片和花萼表面擦凈，將其摘下并做好標記，低溫避光保存，除去葉中脈后剪碎。稱取0.1 g供試樣品放入研缽中，80%丙酮研磨成勻漿，離心機4 000 r·min-1離心15 min，將上清液用80%丙酮定容至20 mL待測。以80%丙酮為對照，采用紫外分光光度計測定波長645、663 nm處的OD值，代入公式計算其葉綠素a、b和總葉綠素含量[11-14]：

Ca=（12.72D663-2.59D645）v/（W×1 000） （1）

Cb=（22.88D645-4.68D645）v/（W×1 000） （2）

Ct=（8.02D663+20.29D645）v/（W×1 000） （3）

式中，Ca、Cb、Ct代表葉綠素a、葉綠素b、總葉綠素含量，mg·g-1；D663和D645代表對應波長下的吸光度值；v代表定容體積，mL；W代表稱樣重量，g。

1.3 ?數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2010、SPSS 22.0軟件處理試驗數(shù)據(jù)。

2 ?結果與分析

2.1 ?滇重樓葉片、花萼的SPAD值和葉綠素含量比較

比較不同生長年限滇重樓葉片、花萼的SPAD值和葉綠素含量，結果見圖1、圖2。由圖1可知，隨著種植年限的增加，滇重樓葉片SPAD值和葉綠素含量的變化趨勢幾乎不同，其中SPAD值表現(xiàn)為先增加后減少，而葉綠素a和總葉綠素含量表現(xiàn)為先增加后減少再增加，葉綠素b含量則表現(xiàn)為先減少后增加，其中，2年生的葉綠素b含量最高，4年生的SPAD值、葉綠素a和總葉綠素含量最高。由圖2可以看出，隨著種植年限的增加，滇重樓花萼的SPAD值與葉綠素含量都表現(xiàn)為先降低后增加，其中4年生的SPAD值、葉綠素b和總葉綠素含量最高，7年生的葉綠素a含量最高。通過比較兩圖可以看出，葉片SPAD值和葉綠素含量均顯著高于花萼。

2.2 ?滇重樓葉片、花萼的SPAD值與葉綠素a含量的相關性分析

由表1得知，不同生長年限滇重樓葉片、花萼的SPAD值與葉綠素a含量之間表現(xiàn)出極顯著相關性，所有函數(shù)模型的相關性均達0.4以上，其中以5年生（葉片）的函數(shù)相關性最大，相關系數(shù)高達0.958 4。根據(jù)相關系數(shù)大小，確定適用于二年生（葉片）、四年生（花萼）、四年生（葉片）、五年生（花萼）、五年生（葉片）、七年生（花萼 ）、七年生（葉片）的最優(yōu)函數(shù)方程分別為對數(shù)方程y=0.351 7ln（x）- 0.897 8（R?=0.713 2）、指數(shù)方程y=0.228 0e0.024 9x（R?=0.539 1）、對數(shù)方程y=0.294 4ln（x）- 0.644 1（R?=0.925 7）、指數(shù)方程y=0.163 2e0.036 5x（R?=0.879 3）、指數(shù)方程y=0.194 6e0.015 1x（R?=0.958 4）、線性方程y=0.013 4x+0.127 8（R?=0.607 4）、指數(shù)方程y=0.082 8e0.047 6x（R?=0.836 4）。

2.3 ?滇重樓葉片、花萼的SPAD值與葉綠素b含量的相關性分析

由表2可知，不同生長年限滇重樓葉片、花萼的SPAD值與葉綠素b含量之間呈極顯著相關，總體相關性均在0.5以上，其中5年生滇重樓葉片的SPAD值與葉綠素b含量的相關性最大，相關系數(shù)高達0.978 5。根據(jù)相關系數(shù)大小，確定適用于二年生（葉片）、四年生（花萼）、四年生（葉片）、五年生（花萼）、五年生（葉片）、七年生（花萼 ）、七年生（葉片）的最優(yōu)函數(shù)方程分別為對數(shù)方程y=1.178 1ln（x）- 0.498 6（R?=0.875 0）、指數(shù)方程y=1.895 0e0.023 0x（R?=0.806 1）、對數(shù)方程y=2.231 6ln（x）-4.625 0（R?=0.965 5）、線性方程y=0.059 0x+1.426 1（R?=0.916 8）、對數(shù)方程y=1.590 4ln（x）-2.838 5（R?=0.978 5）、對數(shù)方程y=2.860 0 ln（x）-5.680 0（R?=0.677 3）、線性方程y=0.131 6x-0.705 2（R?=0.893 5）。

2.4 ?滇重樓葉片、花萼的SPAD值與總葉綠素含量的相關性分析

采用4種函數(shù)對SPAD 值（x）和總葉綠素含量（y）的關系進行擬合，結果見表3。由表得知，不同生長年限滇重樓葉片、花萼的SPAD值與總葉綠素含量之間呈極顯著相關性，總體相關性均在0.6以上，其中5年生滇重樓葉片SPAD值與總葉綠素含量的相關性最大，相關系數(shù)高達0.978 8。根據(jù)相關系數(shù)大小，確定適用于二年生（葉片）、四年生（花萼）、四年生（葉片）、五年生（花萼）、五年生（葉片）、七年生（花萼 ）、七年生（葉片）的最優(yōu)函數(shù)方程分別為對數(shù)方程y=1.529 1ln（x）-1.394 9（R?=0.871 6）、指數(shù)方程y=2.124 7e0.023 2x（R?=0.839 6）、對數(shù)方程y=2.525 0ln（x）-5.267 2（R?=0.968 5）、線性方程y=0.068 8x+1.564 7（R?=0.920 7）、乘冪方程y=0.442 7x0.548 2（R?=0.978 8）、對數(shù)方程y=2.941 1ln（x）-5.503 8（R?=0.731 1）、線性方程y=0.150 7-0.922 4（R?=0.905 2）。分析比較表3、表4和表5可以得出，不同生長年限的滇重樓葉片、花萼的SPAD值與葉綠素含量的相關性大小總體都表現(xiàn)為：總葉綠素＞葉綠素b＞葉綠素a，且最大相關性均為5年生滇重樓的葉片。

2.5 ?滇重樓葉片SPAD值、葉綠素含量的實測值與預測值比較

滇重樓葉片SPAD值和葉綠素含量測定結果如表4所示，2年生葉片SPAD值變化范圍為18.433～67.433，葉綠素a、b和總葉綠素含量的變化范圍為0.121～0.563 mg·g-1、2.969～4.372 mg·g-1和3.089～4.933 mg·g-1；4年生葉片SPAD值變化范圍為28.533～73.233，葉綠素a、b和總葉綠素含量的變化范圍為0.324～0.630 mg·g-1、2.588～4.812 mg·g-1和2.910～5.440 mg·g-1；5年生葉片SPAD值變化范圍為22.967～65.233，葉綠素a、b和總葉綠素含量的變化范圍為0.275～0.529 mg·g-1、2.201～3.763 mg·g-1和2.475～4.291 mg·g-1；7年生葉片SPAD值變化范圍為23.133～41.600，葉綠素a、b和總葉綠素含量的變化范圍為0.240～0.635 mg·g-1、2.511～4.969 mg·g-1和2.750～5.602 mg·g-1。

將測得的不同生長年限滇重樓葉片的SPAD值代入線性回歸方程中，計算葉綠素的預測值，再對實測值與預測值進行統(tǒng)計學檢驗。由表5可知，p值均大于0.05，這說明不同生長年限滇重樓葉片的葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素實測值與預測值間差異不顯著，因此可采用線性回歸方程來預測滇重樓葉片葉綠素含量的絕對值。

2.6 ?滇重樓花萼葉綠素含量的實測值與預測值比較

由表6可知，4年生滇重樓花萼SPAD值變化范圍為10.067～20.267，葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素含量變化范圍為0.288～0.552 mg·g-1、2.482～4.032 mg·g-1和2.770～4.533 mg·g-1；5年生滇重樓花萼SPAD值變化范圍為4.533～20.567，葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素含量的變化范圍為0.202～0.366 mg·g-1、1.800～2.622 mg·g-1和2.001～2.979 mg·g-1；7年生滇重樓花萼SPAD值變化范圍為11.933～25.533，葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素含量的變化范圍為0.260～0.689 mg·g-1、0.771～3.726 mg·g-1和1.196～4.217 mg·g-1。

將測得的不同生長年限花萼的SPAD值代入線性回歸方程中，計算得出葉綠素的預測值，再對實測值與預測值進行統(tǒng)計學檢驗。由表7可知，p值均大于0.05，這說明不同生長年限滇重樓花萼的葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素實測值與預測值之間的差異不顯著，因此可采用線性回歸方程來預測滇重樓花萼葉綠素含量的絕對值。

由表4和表6可以看出，不同生長年限滇重樓葉片、花萼的SPAD值和葉綠素含量都各不相同，但葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素含量大體上都是隨著SPAD值的變化而變化，即SPAD值與葉綠素含量的變化趨勢保持一致。

3 ?小結與討論

SPAD葉綠素儀是通過測定綠葉在630、690 nm兩段波長處的吸光率來評估綠葉中葉綠素相對含量的一種手段[15]，在這兩段波長下葉綠素對光的吸收不同，因此可以對葉片傳輸光的數(shù)量進行計算，由此得出SPAD值。采用SPAD葉綠素儀對植株葉片的葉綠素含量進行估測，不僅可以省時省力，測定還不受溫度和氣候等外部環(huán)境因素的影響，在測定過程中也不會對葉片造成損傷[16]。因此，現(xiàn)如今許多科研工作者都開始采用這種簡單的測量方法來取代傳統(tǒng)的紫外分光光度計測量法，也收獲了不少成果，但用此法對滇重樓的研究還未見報道[17-18]。

本研究通過計算滇重樓葉片、花萼葉綠素的相對含量和絕對含量，發(fā)現(xiàn)不同生長年限滇重樓葉片和花萼的葉綠素含量各不相同，總體來看，葉片的葉綠素含量普遍高于花萼，這與高成杰等[19]的研究結果類似。但4年生的滇重樓，不管是葉片還是花萼，葉綠素含量均高于其他年生，可能是因為受到氣候、土壤、微環(huán)境及生長年限等條件的影響[19-21]，可能4年生滇重樓植株是一個轉折點，有待進一步從光合特性、生理生化等方面深入研究其機制。通過線性、指數(shù)、對數(shù)和乘冪四個回歸方程[22-24]對葉片、花萼的SPAD值和葉綠素含量進行擬合，發(fā)現(xiàn)上述4種函數(shù)方程的擬合變量因子均達到極顯著相關性，這說明SPAD值與葉綠素含量間呈極顯著正相關，這與對甘藍、油菜、甜瓜、紅楓等[21，25-26]的研究結果一致。通過對滇重樓葉片、花萼的實測值與預測值進行方差檢驗，發(fā)現(xiàn)實測值與預測值間差異不顯著，這與潘靜[27]和李田等[28]的研究結果一致，表明無論是滇重樓的葉片還是花萼均可采用SPAD值表示葉綠素含量，并且通過相應的回歸方程，可以求出葉綠素含量的絕對值。

本研究表明，可以采用SPAD葉綠素儀代替復雜繁瑣的傳統(tǒng)手段來測定滇重樓葉片和花萼的葉綠素含量，這為滇重樓葉綠素含量測定提供了便捷的手段，也為滇重樓的高效種植模式和田間栽培管理提供理論依據(jù)。

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（責任編輯：易 ?婧）