不同干燥方法對桑葉主要成分和蘆丁含量的影響

林偉雄，鄧李紅，鐘志奎，陳仕妍，楊贊，羅毓，張正*，吳曉英（1. 廣東一方制藥有限公司，廣東 佛山 528244；2. 廣東省中藥配方顆粒企業重點實驗室，廣東 佛山 528244）

桑葉為桑科植物桑Morus albaL.的干燥葉，性味甘、苦、寒，歸肺、肝經，具有疏散風熱、清肝明目、清肺潤燥的功效，主要用于治療風熱感冒、頭暈頭痛、肺熱燥咳、目赤昏花等癥[1]。桑葉資源分布廣泛，主產于廣東、廣西、安徽、重慶、云南等地[2]，具有降血糖、調血脂、抗病毒、抗氧化等藥理作用[3-6]，含有黃酮類、酚酸類、生物堿類等主要化學成分[2，7-9]。桑葉作為傳統大宗中藥材，臨床應用十分廣泛，采收加工方法也豐富多樣[10]。歷代本草記載，民國以前桑葉加工方法以陰干、炙干為主，陰干、炙干法首次明確記載于宋《本草圖經》[11]；民國至今桑葉加工方法則由陰干、炙干轉變為曬干，曬干法最早見于清《本經疏證》[12]，被后續本草沿用至今。本研究在測定桑葉指標成分蘆丁含量[1]的基礎上，建立桑葉藥材高效液相色譜特征圖譜，通過單因素方差分析和熵權TOPSIS法等對蘆丁含量及特征圖譜的多指標變量進行統計分析，探究陰干、曬干、烘干3種加工干燥方法對桑葉化學成分的影響，建立科學合理的桑葉加工干燥方法評價體系。

1 材料

1.1 儀器

ARC型高效液相色譜儀（美國沃特世公司）；ME204E型、XP26型分析天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）；MiliQ Direct 8型超純水機（德國默克有限公司）；KQ-500DE型數控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；111B型二兩裝高速中藥粉碎機（浙江瑞安市永歷制藥機械有限公司）。

1.2 試藥

新綠原酸（批號：DSTDX001503，純度：99.58%）、隱綠原酸（批號：DST220104-035，純度：99.30%）、蘆丁（批號：DST210520-017，純度：99.19%）（成都樂美天醫藥科技有限公司）；液相用水為超純水，甲醇、磷酸為色譜純，其余試劑為分析純。

15批桑葉藥材（編號1～15）經廣東一方制藥有限公司孫冬梅教授鑒定為桑科植物桑Morus albaL.的干燥葉，來源信息詳見表1。15批桑葉藥材，每批均分3份，分別平鋪于托盤中，一份于室內陰涼干燥通風處放置陰干，得桑葉陰干飲片（編號Y1～Y15）；一份于室外陽光直射處放置曬干，得桑葉曬干飲片（編號S1～S15）；一份于烘箱內設置55℃烘干，得桑葉烘干飲片（編號H1～H15）。3種干燥方法均是以藥典標準水分不超過15%評價為干，并測定各批次藥材水分在10%～12%。干燥過程中盡可能確保每種方法不同編號的樣品處理一致。

表1 15批桑葉藥材來源信息Tab 1 Source information of 15 batches of mulberry leaf

2 特征圖譜的建立及分析

2.1 色譜條件

Waters XBridge C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以甲醇為流動相A，0.1%磷酸溶液為流動相B，梯度洗脫（0～5 min，15%A；5～20 min，15%～30%A；20～40 min，30%～60%A；40～42 min，60%～15%A；42～47 min，15%A）；檢測波長358 nm；流速1.0 mL·min－1；柱溫30℃；進樣體積10 μL。

2.2 對照品溶液的制備

取新綠原酸、隱綠原酸和蘆丁對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含新綠原酸39.04 μg、隱綠原酸24.83 μg和蘆丁22.42 μg的混合對照品溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備

取陰干、曬干和烘干桑葉樣品粉末（過三號篩）約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇10 mL，稱定重量，超聲處理（功率200 W，頻率40 kHz）45 min，取出冷卻，再稱定重量，用50%甲醇補量，搖勻，經0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.4 方法學考察

2.4.2 重復性考察 取桑葉供試品粉末約0.5 g，精密稱定，平行制備6份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，以6號峰蘆丁為參照峰（S），計算得到各特征峰RRT和RPA的RSD均小于3.0%，提示該方法重復性良好。

2.4.3 穩定性考察 取桑葉供試品粉末約0.5 g，精密稱定，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，分別在樣品制備后0、2、4、8、12、24 h按照“2.1”項下色譜條件測定，以6號峰蘆丁為參照峰（S），計算得到各特征峰RRT和RPA的RSD均小于3.0%，提示供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.5 HPLC特征圖譜的建立及相似度評價

取15批陰干、曬干及烘干桑葉樣品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，采集15批不同干燥方法桑葉色譜圖，將其導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）》軟件中進行色譜圖匹配，分別以Y1、S1、H1圖譜作參照圖譜，設置時間窗寬度為0.1 min，經多點校正、全譜峰匹配、中位數法分別生成陰干、曬干及烘干桑葉的共有特征圖譜及相應的對照特征圖譜，詳見圖1。15批陰干、曬干及烘干桑葉共有特征圖譜中均標定了共有峰7個，通過對照品比對，指認了1號峰為新綠原酸、3號峰為隱綠原酸、6號峰為蘆丁，詳見圖2。計算15批陰干、曬干及烘干桑葉樣品特征圖譜與各自生成的共有對照特征圖譜的相似度，同批次陰干、曬干及烘干樣品間的相似度，結果見表2。結果顯示相同干燥方法下的不同批次桑葉樣品以及不同干燥方法下的同批次桑葉樣品間相似度均大于0.95，表明不同批次及不同干燥方法的同批次桑葉樣品間的質量一致性較好。

圖1 不同干燥方法桑葉共有特征圖譜及對照圖譜（R）Fig 1 Common characteristic chromatogram and reference characteristic chromatogram（R）by different drying methods of mulberry leaves

圖2 混合對照品溶液的HPLC圖Fig 2 HPLC chromatogram of mixed reference substances

表2 不同干燥方法桑葉特征圖譜的相似度結果Tab 2 Similarity of the characteristic chromatogram of mulberry leaves by different drying methods

2.6 方差分析

采用SPSS 20.0軟件對15批陰干、曬干及烘干桑葉共有特征峰的單位峰面積進行單因素方差分析。結果顯示，共有峰1～7單位峰面積在陰干、曬干、烘干三者之間差異無統計學意義（P＞0.05），表明不同干燥方法對桑葉化學成分影響較小，但整體上曬干桑葉的峰面積含量優于陰干與烘干桑葉，另烘干桑葉峰1～3的峰面積含量略高于曬干桑葉，而峰4～7的峰面積含量較曬干桑葉則略有下降，提示峰4～7或為熱敏成分。15批陰干、曬干及烘干桑葉特征圖譜共有峰單位峰面積的方差分析結果見表3。

表3 不同干燥方法桑葉特征圖譜共有峰單位峰面積方差分析結果( ±s，n＝15)Tab 3 Variance analysis of common peak area of mulberry leaves by different drying methods ( ±s，n＝15)

表3 不同干燥方法桑葉特征圖譜共有峰單位峰面積方差分析結果( ±s，n＝15)Tab 3 Variance analysis of common peak area of mulberry leaves by different drying methods ( ±s，n＝15)

有峰陰干曬干烘干共1 72 501.33±20 315.8076 520.73±24 010.4880 433.20±38 269.91 2 606 934.07±267 044.42646 428.67±253 508.71704 639.40±251 904.10 3 113 813.67±36 594.97123 350.87±44 798.79137 525.93±69 814.66 4 98 114.80±36 159.27102 490.07±40 642.0889 928.13±31 809.23 5 70 214.53±44 972.9881 893.80±54 804.2659 611.60±29 304.11 6 1 015 570.33±409 264.171 180 612.73±426 067.121 116 798.53±376 830.34 7 502 579.27±279 744.76558 532.73±294 685.32495 255.93±203 671.35

2.7 熵權TOPSIS法分析

2.7.1 建立初始決策矩陣 假設樣本有m個，指標有n個。各樣本（1，2，3…，m）在各指標（1，2，3…，n）下的測量值為Xij，按如下公式計算初始決策矩陣V。

2.7.2 建立標準化決策矩陣 以15批不同干燥方法桑葉特征圖譜7個共有特征峰的單位峰面積為高優指標，按如下公式對原始數據進行高優指標同向化處理，計算指標越大越優型Rij，然后進行數據歸一化處理。

2.7.3 確定各指標權重 按如下公式計算各評價指標的熵值Ej和權重wj，得到熵值Ej＝（0.9486、0.9437、0.9201、0.9488、0.9100、0.9547、0.9289）；權重wj＝（0.1156、0.1265、0.1795、0.1150、0.2021、0.1017、0.1597）。

2.7.4 建立加權決策矩陣 加權決策矩陣計算公式如下，確定最優向量Z＋＝（Z1＋，Z2＋，…，Zn＋），其中Zj＋＝max（Z1j，Z2j，…，Znj）；最劣向量Z－＝（Z1－，Z2－，…，Zn－），其中Zj－＝min（Z1j，Z2j，…，Znj）。得到Zj＋＝（0.1156、0.1265、0.1795、0.1150、0.2021、0.1017、0.1597）；Zj－均為0。

高校檔案館要想在學校的發展實現自身的價值，就要改變以前封閉的管理體系, 打破部門與部門、學校與學校之間的屏障,在校內和校外兩個方向尋求合作, 實現檔案信息的流動與共享，不僅將檔案信息資源從形成到歸檔環節進行管理,更要向外延伸兼顧社會需求。

2.7.5 貼近度的計算及評價 按如下計算各批次不同干燥方法桑葉樣品中最優向量Z＋和最劣向量Z－的距離D，和各批次不同干燥方法桑葉樣品與最佳方案的歐氏貼近度Ci，并進行排名，Ci越大表明越接近最佳方案，結果見表4和圖3。

圖3 15批不同干燥方法桑葉樣品Ci值折線圖Fig 3 Ci value fold line diagram of 15 batches of different drying methods of mulberry leaves

表4 15批不同干燥方法桑葉樣品質量評價排序Tab 4 Quality evaluation ranking of 15 batches of mulberry leaf samples by different drying methods

結果顯示除桑葉藥材編號為4、12的同批次陰干、曬干、烘干桑葉樣品Ci值幾乎重疊外（見圖3），其余同批次不同干燥方法制備的桑葉樣品Ci值存在差異，且個別批次浮動較大，表明不同干燥方法制備的桑葉樣品多數存在一定差異。同批次樣品中，最低Ci值曬干桑葉僅占1批，烘干桑葉占6批，陰干桑葉占8批；最高Ci值曬干桑葉占7批，烘干桑葉占6批，陰干桑葉占2批；可知同批次制備的曬干桑葉Ci值整體優于陰干和烘干桑葉，且同批次制備的烘干桑葉最高及最低Ci值浮動較大，同批次制備的陰干桑葉樣品Ci值則整體偏低。

3 蘆丁的含量測定

3.1 色譜條件

Agilent ZORBAX SB-C18 色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），以甲醇為流動相A，0.5%磷酸為流動相B，梯度洗脫（0～5 min，30%A；5～10 min，30%～35%A；10～15 min，35%～40%A；15～18 min，40%～50%A；18～19 min，50%～30%A；19～30 min，30%A）；檢測波長358 nm；流速0.8 mL·min－1；柱溫30℃；進樣體積10 μL。

3.2 對照品溶液的制備

取蘆丁對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含0.1 mg蘆丁的溶液，即得。

3.3 供試品溶液的制備

取陰干、曬干、烘干桑葉樣品粉末（過三號篩）約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，搖勻，密塞，稱定重量，加熱回流1.0 h，冷卻，再稱定重量，用70%甲醇補重，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

3.4 專屬性考察

取上述供試品溶液、對照品溶液和陰性對照溶液（70%甲醇）各適量，按“3.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果桑葉供試品及對照品色譜圖的基線均平穩，蘆丁色譜峰分離度、對稱性良好，供試品中蘆丁色譜峰與對照品色譜峰的保留時間基本相同，且陰性對照無干擾，見圖4。

圖4 桑葉專屬性考察的高效液相色譜圖Fig 4 HPLC chromatogram of the virginity exclusive investigation of mulberry leaf

3.5 線性關系考察

取蘆丁對照品適量，精密稱定，加甲醇制成含蘆丁199.54 μg·mL－1的對照品儲備液，分別取蘆丁對照品儲備液0.2、0.4、1、2、5、10 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，得每1 mL含3.99、7.98、19.95、39.91、99.77、199.54 μg蘆丁的系列對照品溶液，按“3.1”項下色譜條件檢測樣品。橫坐標為進樣質量濃度（μg·mL－1，X），縱坐標為峰面積值（Y），進行線性回歸，得回歸方程，Y＝2.313×104X＋2.330×104，R2＝0.9992，結果表明蘆丁在質量濃度3.99～199.54 μg·mL－1與峰面積值呈良好的線性關系。

3.6 精密度考察

取桑葉樣品粉末約0.5 g，精密稱定，按“3.3”項下方法制備供試品溶液，按“3.1”項下色譜條件重復檢測6次，記錄峰面積。結果蘆丁峰面積的RSD為0.99%，提示儀器精密度良好。

3.7 重復性考察

取桑葉樣品粉末約0.5 g，精密稱定，平行制備6份，按“3.3”項下方法制備供試品溶液，按“3.1”項下色譜條件檢測，記錄峰面積。結果蘆丁峰面積的RSD為0.64%，提示該方法重復性良好。

3.8 穩定性考察

取桑葉樣品粉末約0.5 g，精密稱定，按“3.3”項下方法制備供試品溶液，分別在樣品制備后0、2、4、8、12、24 h，按“3.1”項下色譜條件檢測，記錄峰面積。結果蘆丁峰面積的RSD為0.20%，提示供試品溶液在24 h內穩定。

3.9 加樣回收率考察

取含量已知的桑葉樣品0.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，按樣品中蘆丁含量的50%、100%和150%分別加入相應的對照品，設計3組實驗，每組平行3份。按“3.3”項下方法制備供試品溶液，在“3.1”項色譜條件下檢測樣品，計算得低、中、高濃度水平下蘆丁平均加樣回收率分別為102.88%、103.56%、100.17%，RSD分別為0.68%、0.42%、0.38%，表明方法準確度良好。

3.10 樣品測定

取15批陰干、曬干和烘干桑葉樣品粉末約0.5 g，精密稱定，按“3.3”項下方法制備供試品溶液，按照“3.1”項色譜條件測定，結果見表5，同批次樣品中，最低蘆丁含量陰干桑葉占8批，烘干桑葉占7批；最高蘆丁含量曬干桑葉占13批，烘干與陰干桑葉各占1批；可知曬干制備的桑葉樣品蘆丁含量整體優于陰干和烘干桑葉。

表5 15批不同干燥方法桑葉蘆丁含量結果(%)Tab 5 Rutin content of 15 batches of mulberry leaves by different drying methods (%)

4 討論

本研究通過圖譜相似度、方差分析、熵權TOPSIS法對比分析了陰干、曬干、烘干3種干燥方法對桑葉特征圖譜共有峰的影響。特征圖譜相似度結果表明3種干燥方法制備的桑葉樣品相似度均大于0.95，方差分析結果也顯示7個共有峰的單位峰面積間差異無統計學意義，表明不同干燥方法桑葉樣品間一致性較好，即不同干燥方法對桑葉化學成分影響較小。熵權TOPSIS法通過數據本身的離散性進一步確定了桑葉樣品中7個共有峰的權重，根據Ci值對不同干燥方法的桑葉樣品進行排序[13]，結果表明不同干燥方法制備的桑葉樣品Ci值存在一定差異，曬干桑葉的Ci值整體優于陰干和烘干桑葉，烘干桑葉的Ci值浮動較大，陰干桑葉的Ci值則整體偏低，提示不同干燥方法制備的桑葉樣品間化學成分含量差異雖無統計學意義，但曬干桑葉樣品質量整體穩定且優于陰干、烘干桑葉樣品。另通過測定不同干燥方法的桑葉樣品中蘆丁含量的結果可知，曬干桑葉樣品蘆丁含量整體優于陰干和烘干桑葉樣品，與熵權TOPSIS法分析結論一致。該方法穩定性及重復性較好，且操作簡單，可為桑葉干燥工藝參數進一步研究提供科學合理的評價方法，也可為桑葉資源進一步開發利用提供依據。

5 展望

為保證藥食兩用桑葉藥材的質量和品質，可考慮進一步加強桑葉干燥方法的規范化研究，同時考慮到桑葉中主要含蘆丁、綠原酸等具有熱敏、易氧化特性的有效成分[2]，在干燥方法選擇上應盡量遵循低溫、快速原則[14]。傳統干燥方法中，陰干干燥方法雖遵循了低溫原則，但在長時間陰干過程中，桑葉容易腐爛、變質，失去藥用價值和經濟價值；現代干燥技術烘干的干燥進程雖快，但也會加速桑葉有效成分的氧化、水解等反應。這可能是本次研究結果中陰干、烘干桑葉樣品質量穩定性不如曬干桑葉的主要原因，在桑葉大生產干燥應用中其不穩定性極可能會進一步放大[15-16]，進而造成市場上流通的桑葉質量參差不齊，故在保證桑葉干燥品質的基礎上，建議對陰干、曬干、烘干等干燥方法的工藝參數進行更精細的研究，以確保采收加工的桑葉藥材質量穩定且均一，從而使桑葉得到更有效的利用。