一起由金黃色葡萄球菌和蠟樣芽胞桿菌引起食物中毒的實驗室檢測分析

王 宇，國 霞，王 偉

（淄博市淄川區(qū)疾病預防控制中心，山東淄博 255100）

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一種重要的食源性致病菌且在自然界中廣泛存在[1]。研究表明，每年的細菌性食物中毒事件中，由金黃色葡萄球菌及其毒素引起的食物中毒事件約占25%，已經(jīng)成為我國引發(fā)細菌性食物中毒的主要致病因子之一[2]。蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus）是一種條件致病桿菌，易污染該菌的食物有米制品、乳類、熟肉、蔬菜及湯類等。被污染的食品外觀一般無異常且無異味，容易被忽略，該菌可產(chǎn)生腸毒素，通常食用含菌量大于105CFU·mL-1（CFU·g-1）的食品即可引起人嘔吐型或腹瀉型食物中毒[3]。

1 材料與方法

1.1 樣本來源

患者嘔吐物2 份（編號1#、2#）；面包包裝袋樣本2 份、面包屑1 份、吃剩雞腿樣本1 份、雞腿包裝袋2 份、檸檬水1 份和可樂雞米飯1 份，依次編號為3#～10#，以上采集樣品均放置在無菌采樣袋中。

1.2 儀器與試劑

GSP-9050 隔水式培養(yǎng)箱、JSH-250 生化培養(yǎng)箱、生物顯微鏡、生物安全柜、Baird-Parker（B-P）瓊脂平板、沙門菌屬顯色培養(yǎng)基、甘露醇卵黃多粘菌素瓊脂（MYP），均由青島海博生物科技公司提供；營養(yǎng)瓊脂均由北京陸橋公司提供；GP 生化鑒定卡；磷酸鹽緩沖液（PBS）；A、B、C、D、E 型金黃色葡萄球菌腸毒素實時熒光PCR 檢測試劑盒；Q5 型熒光定量擴增儀。

1.3 方法

1.3.1 檢驗方法

參照《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗》（GB 4789.10—2016）[5]對金黃色葡萄球菌進行檢驗；參照《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 蠟樣芽胞桿菌檢驗》（GB /T 4789.14—2014）[6]對蠟樣芽胞桿菌進行檢驗；參照《食品安全國家標準食品微生物學檢驗 沙門氏菌檢驗》（GB 4789.4—2016）[7]對沙門氏菌進行檢驗。

1.3.2 細菌培養(yǎng)

①將1#~10#樣本前處理后無菌操作分別接種到7.5%氯化鈉肉湯等相應的增菌液中增菌，后接種到對應的選擇培養(yǎng)基（36±1）℃在培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，觀察結果。②處理好的樣品勻液涂布于MYP 平板，置培養(yǎng)箱（30±1）℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落生長情況。增菌后的培養(yǎng)物接種到金黃色葡萄球菌B-P選擇平板、沙門氏菌顯色平板，于（36±1）℃培養(yǎng)24 h，觀察結果。

1.3.3 涂片鏡檢

挑取適量可疑典型菌落涂片后固定，用革蘭氏染色法染色后鏡檢。

1.3.4 生化實驗

挑取純培養(yǎng)的菌落分別進行相應的生化實驗驗證細菌種類。

1.3.5 PCR 檢測

5#樣本檢出的金黃色葡萄球菌用PCR 方法測定腸毒素，取適量單個菌落金黃色葡萄球菌至離心管（生理鹽水1 mL）中研磨，置離心機離心5 min（轉(zhuǎn)速12 000 r·min-1），倒掉上清液，留取沉淀；加入DNA 提取液50 μL，用加樣槍混勻沉淀使其懸浮，100 ℃溫浴5 min，置離心機離心5 min（轉(zhuǎn)速12 000 r·min-1），留上清液待測，使用Q5 熒光定量擴增儀，根據(jù)試劑盒說明書設定PCR 反應條件，F(xiàn)AM 通道采集熒光信號。

2 結果與分析

2.1 流行病學調(diào)查情況

2021 年6 月4 日，淄川區(qū)疾病預防控制中心接到某醫(yī)院急診科報告疑似食物中毒患者2名，根據(jù)《食品安全事故流行病學調(diào)查技術指南（2012 年版）》[4]趕赴現(xiàn)場展開流行病學處置工作，兩人為某校學生，于當日中午在學校宿舍共同進食芒果、網(wǎng)購包裝雞腿、網(wǎng)購面包、檸檬水和可樂雞米飯，均有頭暈、惡心、嘔吐、腹痛和精神不佳等癥狀；嘔吐約為3 次/h，1 例伴發(fā)熱，體溫37.6 ℃，平均潛伏期為3.6 h。

2.2 增菌培養(yǎng)與分離結果分析

培養(yǎng)的增菌液和分離的選擇平板基上可見5#、6#有可疑菌落生長，其他樣本所檢項目未檢出。5#在Baird-Parker 顯色平板上呈圓形、表面光滑、濕潤，直徑2 ～3 mm 的粉紅色菌落，見圖1，涂片染色后鏡檢可見革蘭氏陽性的藍色球菌，呈葡萄串狀，血漿凝固酶試驗陽性，檢測結果是金黃色葡萄球菌；6#在甘露醇卵黃多粘菌素瓊脂上培養(yǎng)后長出微粉色典型菌落，菌落周圍有沉淀環(huán)，見圖2，涂片染色顯微鏡下見藍色革蘭氏陽性的桿菌，菌體中央有芽孢，為橢圓形，不膨出于菌體，呈鏈狀排列，通過相應的生化實驗結果鑒定為蠟樣芽胞桿菌，見表1。5#通過PCR 檢測腸毒素類型為A 型，見表2。

表1 金黃色葡萄球菌和蠟樣芽胞桿菌生化結果

表2 金黃色葡萄球菌腸毒素A-E 分型結果

圖1 5#金黃色葡萄球菌 圖2 6#蠟樣芽胞桿菌

3 結論與討論

根據(jù)現(xiàn)場流行病學調(diào)查情況、中毒病例臨床癥狀判斷、實驗室微生物檢測結果綜合分析，證實本起事件為細菌性食物中毒，致病菌為金黃色葡萄球菌和蠟樣芽胞桿菌，是因網(wǎng)購食品儲藏不當所造成的。金黃色葡萄球菌的最適生長繁殖溫度為30 ～37 ℃。如果食品加工的任何環(huán)節(jié)被金黃色葡萄球菌污染，在合適的溫度下，金黃色葡萄球菌會在短時間內(nèi)大量繁殖并產(chǎn)生腸毒素，通過被污染的食物進入人體引起嚴重的食物中毒[8]。在常見的食源性致病菌中，蠟樣芽胞桿菌也是其中之一，該菌引起的食物中毒事件時有發(fā)生，嚴重危害人們的健康[9]。此事件發(fā)生在夏季，正值高溫季節(jié)，兩名學生患者食用開封后未冷藏保存的網(wǎng)購面包和雞腿，因細菌滋生導致食物中毒。建議衛(wèi)生部門針對社區(qū)、學校、企業(yè)、養(yǎng)老院和托幼機構等重點場所加強食品健康知識宣傳，提高預防食源性疾病的意識；監(jiān)管部門加強對食品生產(chǎn)和流通行業(yè)的督導力度，及時發(fā)現(xiàn)安全隱患，從源頭上減少食源性疾病的發(fā)生。

本文著重從實驗室檢測方面分析，采集的10 份樣品中，僅在5#和6#食物樣本中檢測到致病菌，而中毒病例的嘔吐物中未檢測出可疑的致病菌。多年來，在我國的食源性疾病暴發(fā)事件中，致病原因不明的急性胃腸炎占20%左右[10-11]，臨床癥狀的相似性導致事件的溯源難度變大，實驗室檢測尤為重要，實驗室檢驗水平與食源性疾病病因查明密切相關，在開展食物中毒流行病學調(diào)查處置時，要注意樣品采集和實驗室檢測的重要性，不斷提高檢驗能力。本次事件的實驗室檢測多采用傳統(tǒng)檢驗技術，但金黃色葡萄球菌腸毒素類型檢測運用了PCR 技術，這也說明基層疾控機構在檢驗技術方面有了一定發(fā)展。隨著分子生物學的發(fā)展，病原溯源已進入生物信息學時代，通過基因型、分子型或全基因組測序等方法獲得更準確的結果，對食源性病原體進行鑒定和事件溯源[12]，這就需要不斷學習更新專業(yè)技術水平，增強基層實驗室的標準化建設，提高食源性疾病致病因子的檢出水平，為食源性疾病的溯源提供更精準的技術支撐。