高效液相色譜測定食品中固綠的前處理方法對比研究

許蕤竹

（上海華測品標(biāo)檢測技術(shù)有限公司，上海 201114）

人工合成色素在生產(chǎn)過程中可能帶入有害物質(zhì)，其本身過量使用也會對人體造成損害。《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB 2760—2014）中對允許在食品中添加的人工合成色素的種類和限量有著明確的規(guī)定。

固綠是人工合成色素的一種，是一種酸性染料，能溶于水和酒精。固綠在中國澳門、日本、美國、加拿大等地區(qū)允許作為食品添加劑使用[1]，但在中國大陸不允許使用。國內(nèi)有過進(jìn)口食品中檢出固綠的報告，但目前國標(biāo)中并沒有針對固綠的檢測方法。國內(nèi)外用于測定合成色素的儀器方法主要有高效液相色譜法、高效液相色譜-質(zhì)譜法等[2]，前處理方法有直接提取法、液-液萃取法、聚酰胺粉吸附法、固相萃取法等多種。本實驗采用高效液相色譜法測定食品中固綠的含量，為選擇出更合適的前處理方法，對比分析了不同前處理方法在檢測不同基質(zhì)樣品時的優(yōu)缺點，進(jìn)而探索出更合適的檢測食品中固綠的方法，以達(dá)到高效、靈敏、省時和省材的目的。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

1260 高效液相色譜儀，配自動進(jìn)樣器和DAD檢測器，美國安捷倫；CS501 恒溫水浴鍋，上海博迅；G3 垂熔漏斗，上海暢輝；CP413 分析天平：感量0.001 g，奧豪斯；AL204 分析天平：感量0.000 1 g，梅特勒；Vortex 3 渦旋混勻器，美國SI；KQ-100DB 超聲波清洗儀，上海圣科。

1.2 材料與試劑

固綠標(biāo)準(zhǔn)品（CAS：2353-45-9），德國Dr. E；實驗室用水為GB/T 6682 規(guī)定的一級水；正己烷（C6H14），分析純，國藥公司；三正辛胺-正丁醇溶液（5%），阿拉丁；乙醇-氨水-水混合溶液，7∶2∶1（體積比），上海安譜公司；甲醇（CH3OH），色譜純，上海安譜公司；鹽酸（HCL），分析純，國藥公司；聚酰胺粉（尼龍6）：過200 μm（目）篩，國藥公司；WAX固相萃取柱，150 mg/6 mL，艾杰爾公司；0.45 μm水相微孔濾膜，上海安譜公司。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

（1）標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液。準(zhǔn)確稱取按照其純度折算為100%質(zhì)量的固綠標(biāo)準(zhǔn)品0.1 g（精確至0.000 1 g），置于100 mL 容量瓶中，用pH 值為6 的水定容，配制成1.00 mg·mL-1的水溶液。

（2）標(biāo)準(zhǔn)使用溶液。臨用時，移取適量標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液，加水稀釋至20 倍，用0.45 μm 微孔濾膜過濾，配制成50 μg·mL-1的水溶液。

（3）標(biāo)準(zhǔn)曲線配制。精密量取適量標(biāo)準(zhǔn)使用溶液，用水稀釋，配制成濃度為5 mg·L-1、10 mg·L-1、20 mg·L-1、30 mg·L-1和50 mg·L-1系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，供高效液相色譜儀測定。以色譜峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4 前處理方法

（1）直接提取法[3]。稱取樣品10 ～20 g（精確至0.001 g），加入60 ℃的熱水，用檸檬酸溶液調(diào)節(jié)pH 值至6，用水定容至50 mL，用超聲波清洗儀超聲提取20 min，6 000 r·min-1離心10 min，上清液過0.45 μm 水相濾膜，收集至進(jìn)樣小瓶中，進(jìn)高效液相色譜儀測定。

（2）液-液萃取法。稱取樣品10 ～20 g（精確至0.001 g）至分液漏斗中，加入2 mL 鹽酸、15 mL 三正辛胺-正丁醇溶液（5%），振搖分液漏斗提取，收集有機相，多次重復(fù)提取，直到有機相無色；合并有機相，用飽和硫酸鈉溶液洗3 次，將有機相放蒸發(fā)皿中，水浴濃縮至10 mL，再轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，加入10 mL正己烷，加氨水溶液萃取3 次；合并氨水層，再用正己烷洗2 次，氨水層加入乙酸調(diào)成中性，水浴蒸發(fā)至近干，加水定容到5 mL。用0.45 μm 水相濾膜過濾，收集至進(jìn)樣小瓶中，進(jìn)高效液相色譜儀測定。

（3）聚酰胺粉吸附法。稱取樣品10 ～20 g（精確至0.001 g），加入60 ℃的熱水，用檸檬酸溶液調(diào)節(jié)pH 至6，取1 g 聚酰胺粉加少量水調(diào)成糊狀，倒入樣品溶液中，攪拌后用G3 垂熔漏斗抽濾，用pH 為4的60 ℃的水洗滌4 次；用甲醇-甲酸混合溶液洗滌4 次，然后用水洗至中性，加乙醇-氨水-水混合溶液（7 ∶2 ∶1，體積比）解吸，直到色素被完全解吸，解吸液中加乙酸中和，水浴蒸發(fā)至近干，加水定容到5 mL。用0.45 μm 水相濾膜過濾，收集至進(jìn)樣小瓶中，進(jìn)高效液相色譜儀測定。

（4）固相萃取法[4]。稱取樣品10 ～20 g（精確至0.001 g），用乙醇-氨水（70 ∶30，體積比）混合溶液定容，用超聲波清洗儀超聲提取20 min，6 000 r·min-1離心10 min，精確移取上清液20 mL 至蒸發(fā)皿中，水浴濃縮至5 mL左右，加入20 mL水稀釋；用5 mL 水反復(fù)沖洗蒸發(fā)皿，合并溶液后調(diào)節(jié)pH 至5，將溶液控制在1 mL·min-1左右的流速通過WAX 固相萃取柱，當(dāng)溶液完全流出后，再用5 mL 含有0.05%甲酸的甲醇溶液淋洗WAX 固相萃取柱，最后用20 mL 含有4%氨水的甲醇洗脫，收集洗脫液，水浴蒸發(fā)至近干，加水定容到5 mL。用0.45 μm 水相濾膜過濾，收集至進(jìn)樣小瓶中，進(jìn)高效液相色譜儀測定。

1.5 儀器條件

色譜柱：C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫：35 ℃；DAD 檢測器波長：635 nm[5]。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫表

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器條件的優(yōu)化

C8色譜柱和C18色譜柱都是常用的反向色譜柱，本試驗一開始為了縮短儀器分析時間，選擇C8色譜柱進(jìn)行分析，固綠目標(biāo)峰保留時間為5.476 min。但發(fā)現(xiàn)在分析復(fù)雜基質(zhì)時，因干擾物質(zhì)較多，C8色譜柱不能提供合適的分離度，故后續(xù)試驗更換了C18色譜柱，并通過多次調(diào)整流動相的梯度洗脫程序，使得固綠目標(biāo)峰保留時間為10.154 min，目標(biāo)峰附近的雜峰明顯減少，達(dá)到了很好的分離效果。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性和檢出限

固綠標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍在5 ～50 mg·L-1，曲線方程為y=23.541 8x-3.624 7，相關(guān)系數(shù)0.999 85。選擇空白基質(zhì)加標(biāo)試驗，根據(jù)3 倍信噪比計算出方法檢出限。直接提取法檢出限為1 mg·kg-1，液-液萃取法檢出限為2 mg·kg-1，聚酰胺粉吸附法檢出限為0.5 mg·kg-1，固相萃取法檢出限為0.3 mg·kg-1。

2.3 不同前處理方法對檢測結(jié)果準(zhǔn)確度和精密度的影響

分別用4 種不同的前處理方法對果汁、配制酒、糖果和蜜餞等4 種不同基質(zhì)樣品進(jìn)行處理，做低（2 mg·kg-1）、中（5 mg·kg-1）、高（20 mg·kg-1）3 種濃度加標(biāo)試驗，每個添加水平重復(fù)6 次。通過加標(biāo)回收率來驗證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度，結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差來驗證方法的精密度，實驗結(jié)果見表2 和表3。

表2 果汁和配制酒試驗數(shù)據(jù) （單位：%）

表3 糖果和蜜餞試驗數(shù)據(jù) （單位：%）

2.4 直接提取法

直接提取法操作簡單、快捷，實驗時間短，所需試劑耗材成本低，可快速處理大量樣品。對于簡單基質(zhì)如果汁和配制酒，加標(biāo)回收率在72.7%～105.4%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在3.54%～9.69%，有較好的準(zhǔn)確度和精密度，滿足測試需求。但在處理較復(fù)雜的基質(zhì)如糖果和蜜餞時，不能很好地去除干擾，數(shù)據(jù)波動較大，加標(biāo)回收率在67.2%～113.5%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在7.13%～16.78%，精密度不能滿足測試要求，色譜圖雜峰多影響定量結(jié)果。

2.5 液-液萃取法

液-液萃取法所用試劑較多，對實驗人員的操作水平有一定的要求。加標(biāo)回收率在58.3%～82.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.15%～10.22%，相對于其他3 個方法而言，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確度和精密度均不具有優(yōu)勢，檢出限也是最高的，不予推薦。

2.6 聚酰胺粉吸附法與固相萃取法

聚酰胺粉吸附法的加標(biāo)回收率在75.7% ～99.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.40%～8.54%。固相萃取法的加標(biāo)回收率在73.9%～106.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在3.58%～8.65%。這兩個方法所得到的結(jié)果準(zhǔn)確度和精密度基本一致，均能達(dá)到測試需求。特別在處理復(fù)雜基質(zhì)如糖果和蜜餞時，數(shù)據(jù)明顯優(yōu)于直接提取法和液-液萃取法，檢出限也能做到更低。相比較而言，聚酰胺粉法比固相萃取法操作簡單，且有明顯的價格優(yōu)勢，故在處理復(fù)雜基質(zhì)時優(yōu)選聚酰胺粉吸附法。

3 結(jié)論

本研究利用高效液相色譜法對食品中固綠進(jìn)行檢測，對比了不同前處理方法的優(yōu)缺點，分析大量實驗數(shù)據(jù)，并從方法難易程度、測試效率、測試成本、數(shù)據(jù)準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性等多個維度綜合考慮，得出以下結(jié)論。在處理相對干凈的液體基質(zhì)時優(yōu)先選擇直接提取法，該方法快速高效，成本低，數(shù)據(jù)可靠；在處理復(fù)雜基質(zhì)時，聚酰胺粉吸附法有著明顯的優(yōu)勢，操作簡便，成本相對較低，檢出限低，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確。