乳酸菌飲料活菌數(shù)符合度鑒定及溫度對乳酸菌的影響

曹曉玉，王緒晶

（1.岳陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物環(huán)境工程學(xué)院，湖南岳陽 414000；2.浙鰲高級中學(xué)，浙江溫州 325400）

隨著人們對食品營養(yǎng)和功能性的需求越來越大，飲食習(xí)慣逐漸轉(zhuǎn)向符合人們需求的食品——發(fā)酵食品。發(fā)酵食品主要包括由益生菌如乳桿菌屬、雙歧桿菌屬和革蘭氏陽性球菌等所發(fā)酵而成的食品[1]。大量研究表明，乳酸菌不僅能改善食品的風(fēng)味，還具有調(diào)節(jié)機(jī)體胃腸道正常菌群[2]、保持微生態(tài)平衡[3]、降低血清膽固醇[4]等保健功能，被廣泛應(yīng)用于輕工業(yè)、乳制品、醫(yī)藥及飼料等行業(yè)中。

活性乳酸菌飲料作為一種含活乳酸菌的發(fā)酵乳飲料，因其可被益生菌當(dāng)作優(yōu)良載體，受到了消費(fèi)者的喜愛。同時(shí)，如何保證乳酸菌飲料中活菌數(shù)含量成為相關(guān)人員的重點(diǎn)研究方向。孟令帥等[5]研究表明，酸奶在貨架期內(nèi)，pH 值下降，酸度上升，乳酸菌活菌數(shù)呈下降趨勢，酸奶的整體感官評價(jià)下降。張巖等[6]研究發(fā)現(xiàn)在4 ℃條件下貯藏時(shí)，乳酸菌生長情況以及酸乳品質(zhì)最佳，可有效延長酸乳貨架期。本文從食品安全角度出發(fā)，以市售的4 種活性乳酸菌飲料為研究對象，測定其中的乳酸菌活菌數(shù)量，判斷其在保質(zhì)期內(nèi)是否符合宣傳內(nèi)容，是否達(dá)到國家乳制品食品衛(wèi)生安全標(biāo)準(zhǔn)。此外，通過比較冷藏溫度和室溫保存溫度對乳酸菌活菌數(shù)的影響，評價(jià)不同品牌活性乳酸菌飲料的貯藏性差異以及為該類產(chǎn)品的貯藏及消費(fèi)提供建議。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

乳酸菌飲料A、B、C 和D，市售。

蛋白胨、牛肉膏、酵母菌粉、醋酸鈉（乙酸鈉）、磷酸氫二鉀、檸檬酸銨、硫酸鎂、硫酸錳、瓊脂、吐溫-80 和葡萄糖。

潔凈工作臺（SW-CJ-2FD）、高壓蒸汽滅菌鍋（KG-SX-500）、恒溫水浴培養(yǎng)箱（GHX-927OB）、冰箱（BCD-621WDCAU1）、數(shù)顯pH 計(jì)（梅特勒-托利多儀器有限公司）、天平、移液槍、平板、1.5 mL EP 管、無菌水、封口膜、250 mL 錐形瓶、1 L 燒杯、玻璃棒、1 L 量筒。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制

本實(shí)驗(yàn)主要采用乳酸菌專用培養(yǎng)基MRS，成分為蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、酵母菌粉5 g、醋酸鈉（乙酸鈉）5 g、磷酸氫二鉀2 g、檸檬酸銨2 g、硫酸鎂0.2 g、硫酸錳0.2 g、瓊脂20 g、吐溫-80 1 mL、葡萄糖20 g，加水定容至1 000 mL 后，用冰乙酸調(diào)pH 值至6.2 ～6.6。因葡萄糖與蛋白胨發(fā)生反應(yīng)，應(yīng)先將葡萄糖配制成母液，分別滅菌后再按照比例加入。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)操作方法

實(shí)驗(yàn)分別取不同品牌的活性乳酸菌飲料1 mL 進(jìn)行梯度稀釋，稀釋倍數(shù)為100~108，每個(gè)稀釋梯度做3 個(gè)平行，并將每個(gè)稀釋梯度的3 個(gè)平行樣涂布于已滅菌的MRS 固體培養(yǎng)皿上，在4 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每24 h 觀察一次菌落生長情況。

1.2.3 保藏溫度為4 ℃時(shí)，不同品牌MRS 培養(yǎng)基中乳酸菌數(shù)目的測定

（1）乳酸菌的梯度稀釋。在無菌操作臺內(nèi)，移液槍吸取1 mL 樣品于1.5 mL 離心管中，此管為原液管。取8 個(gè)1.5 mL 離心管分別加入900 μL 無菌水，依次編號1、2、3、4、5、6、7、8 號管。從原液管中吸取100 μL 液體于1 號管，再從1 號吸取100 μL 液體置于2 號管，依次重復(fù)操作至8 號管，最終稀釋為101~108倍。

（2）涂布。在無菌操作臺內(nèi)灼燒涂布棒，并冷卻至室溫。取一品牌不同梯度稀釋菌液樣品各100 μL，均勻涂布在已滅菌的MRS 固體培養(yǎng)基后并編號。設(shè)置平行對照組，其余3 個(gè)品牌操作相同。

（3）培養(yǎng)。將涂布完的培養(yǎng)基封口后倒置在恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，4 ℃培養(yǎng)72 h 后分別計(jì)數(shù)。

1.2.4 保藏溫度為20 ℃時(shí)，不同品牌MRS 培養(yǎng)基中乳酸菌數(shù)目的測定

另購買的活性乳酸菌飲料放置在20 ℃培養(yǎng)箱中72 h，模擬室溫保存乳酸菌飲料。

（1）乳酸菌的梯度稀釋。在無菌操作臺內(nèi)，移液槍吸取1 mL 樣品于1.5 mL 離心管中，此管為原液管。取8 個(gè)1.5 mL 離心管分別加入900 μL 無菌水，依次編號1、2、3、4、5、6、7、8 號管。從原液管中吸取100 μL 液體于1 號管，再從1 號吸取100 μL 液體置于2 號管，依次重復(fù)操作至8 號管，最終稀釋為101~108倍。

（2）涂布。在無菌操作臺內(nèi)灼燒涂布棒，并冷卻至室溫。取一品牌不同梯度稀釋菌液樣品各100 μL，均勻涂布在已滅菌的MRS 固體培養(yǎng)基后并編號。設(shè)置平行對照組，其余3 個(gè)品牌操作相同。

（3）培養(yǎng)。將涂布完的培養(yǎng)基封口后倒置在恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，20 ℃培養(yǎng)72 h 后分別計(jì)數(shù)。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

乳酸菌數(shù)目的計(jì)算方法是用肉眼觀察并計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值和標(biāo)準(zhǔn)方差表示，采用Origin 2016 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件中的單因子方差分析（ANOVA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同梯度MRS 培養(yǎng)基乳酸菌培養(yǎng)情況

由圖1 可知，乳酸菌菌落整體呈圓形，微白色，凸起，直徑為（3±1） mm，濕潤，邊緣整齊。

圖1 乳酸菌菌落形態(tài)

2.2 不同品牌乳酸菌活菌數(shù)檢測結(jié)果

由表1 可知，A 品牌乳酸菌活菌實(shí)際測量數(shù)為16.2 億個(gè)/mL，B 品牌乳酸菌活菌實(shí)際測量數(shù)為29.85 億個(gè)/mL，C 品牌實(shí)際測量數(shù)為26.15 億個(gè)/mL，D 品牌實(shí)際測量數(shù)為1.335 億個(gè)/mL。實(shí)驗(yàn)所用的4 種市售活性乳酸菌飲料廣告宣傳活菌數(shù)均達(dá)到實(shí)際測量數(shù)，符合其宣傳菌數(shù)要求，且實(shí)際測量數(shù)較廣告宣傳數(shù)大很多。分析其原因?yàn)閺S家為保證廣告乳酸菌數(shù)目在保質(zhì)期內(nèi)成立，廠家會在產(chǎn)品出廠時(shí)往產(chǎn)品中添加較多乳酸菌；廠家將廣告宣傳活菌數(shù)目降低，以達(dá)到通過檢測的目的。

表1 4 種乳酸菌飲料廣告宣傳度和實(shí)驗(yàn)室實(shí)際測量數(shù)的對比結(jié)果

2.3 不同保藏溫度對乳酸菌活菌數(shù)的影響

由圖2 可知，在保藏溫度為4 ℃時(shí)，4 種品牌飲料中B 品牌乳酸菌活菌數(shù)最多，且遠(yuǎn)大于D 品牌（P＜0.05），與其他品牌之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。在保藏溫度為20 ℃時(shí)，4 種品牌乳飲料的乳酸菌活菌數(shù)均為0，無顯著性差異（P＞0.05）。此外，相同品牌在不同保藏溫度下的活菌數(shù)結(jié)果也略有不同。A、B、C 品牌的乳酸菌飲料在4 ℃保藏時(shí)，乳酸菌活菌數(shù)大于在20 ℃的培養(yǎng)結(jié)果（P＜0.05），但D 品牌在4 ℃保藏時(shí)的乳酸菌含量與20 ℃保藏并無太大差異（P＞0.05）。

圖2 不同保藏溫度對4 種品牌的乳酸菌活菌數(shù)的影響

由以上結(jié)果可知，在保藏溫度為4 ℃時(shí)，D 品牌的乳酸菌數(shù)量雖然達(dá)到廣告符合標(biāo)準(zhǔn)，但在所有品牌中乳酸菌活菌數(shù)最少，其他各品牌間乳酸菌活菌數(shù)從多到少分別是B、C、A。此外，20 ℃對于乳飲料中乳酸菌活菌數(shù)的影響很大，幾乎沒有活菌檢出，建議消費(fèi)者購買低溫保藏產(chǎn)品，并在未飲用之前放置于低溫冷藏。

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過不同品牌活性乳酸菌飲料菌數(shù)符合度鑒定及不同溫度對活菌數(shù)的影響，得出以下結(jié)論。①A、B、C 和D 品牌的活性乳酸菌飲料菌數(shù)達(dá)到均其宣傳數(shù)，測量菌數(shù)分別為1.62×109個(gè)/mL、2.985×109個(gè)/mL、2.615×109個(gè)/mL 和1.335×108個(gè)/mL。②4 種品牌乳飲料中B 品牌乳酸菌含量最高，與D 品牌之間存在顯著性差異（P＜0.05），與其他品牌之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。③在保藏溫度為20 ℃時(shí)，4 種品牌乳飲料的乳酸菌含量均為0，無顯著性差異（P＞0.05）。④活性乳酸菌飲料應(yīng)當(dāng)放置在4 ℃左右條件下貯藏，室溫會影響其乳酸菌活性和含量。

3.2 討論

實(shí)驗(yàn)選取的4 種市售活性乳酸菌飲料菌數(shù)均達(dá)到其宣傳數(shù)。董慶利等[7]對市場乳酸菌飲料的抽檢結(jié)果表明，兩種乳酸菌飲料在冷藏溫度下，乳酸菌數(shù)顯著下降，但仍在其宣傳范圍內(nèi)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與董慶利等結(jié)論相對比發(fā)現(xiàn)，乳制品市場已經(jīng)趨于規(guī)范，并未存在虛假宣傳的現(xiàn)象。

此外，本實(shí)驗(yàn)比較了溫度對乳酸菌數(shù)的影響。當(dāng)不同品牌在溫度為4 ℃保藏時(shí)，A、B、C 培養(yǎng)結(jié)果之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且檢測出的活菌數(shù)量未低于廣告宣傳數(shù)。當(dāng)不同品牌在20 ℃下保藏時(shí)，所有樣品中乳酸菌均未檢出，說明20 ℃對于乳飲料中乳酸菌含量影響很大，與張巖等[6]實(shí)驗(yàn)關(guān)于酸乳在4 ℃條件下貯藏時(shí)，乳酸菌生長情況以及酸乳品質(zhì)最佳，可有效延長酸乳貨架期的結(jié)果相同。在4 ℃保藏時(shí)，A、B、C 品牌的乳酸菌含量大于20 ℃的活菌數(shù)（P＜0.05），但D 品牌4 ℃保藏時(shí)乳酸菌含量與20 ℃保藏并無太大差異（P＞0.05）。綜上所述，所有活性乳酸菌飲料均應(yīng)當(dāng)放置在4 ℃條件下貯藏，20 ℃（室溫）會影響其乳酸菌活性和含量，從而導(dǎo)致活性乳酸菌飲料的營養(yǎng)價(jià)值降低。建議消費(fèi)者購買時(shí)，挑選在保質(zhì)期內(nèi)的低溫保藏產(chǎn)品，并在未飲用前放置于低溫冷藏。