乳酸菌飲料活菌數符合度鑒定及溫度對乳酸菌的影響

曹曉玉，王緒晶

（1.岳陽職業技術學院 生物環境工程學院，湖南岳陽 414000；2.浙鰲高級中學，浙江溫州 325400）

隨著人們對食品營養和功能性的需求越來越大，飲食習慣逐漸轉向符合人們需求的食品——發酵食品。發酵食品主要包括由益生菌如乳桿菌屬、雙歧桿菌屬和革蘭氏陽性球菌等所發酵而成的食品[1]。大量研究表明，乳酸菌不僅能改善食品的風味，還具有調節機體胃腸道正常菌群[2]、保持微生態平衡[3]、降低血清膽固醇[4]等保健功能，被廣泛應用于輕工業、乳制品、醫藥及飼料等行業中。

活性乳酸菌飲料作為一種含活乳酸菌的發酵乳飲料，因其可被益生菌當作優良載體，受到了消費者的喜愛。同時，如何保證乳酸菌飲料中活菌數含量成為相關人員的重點研究方向。孟令帥等[5]研究表明，酸奶在貨架期內，pH 值下降，酸度上升，乳酸菌活菌數呈下降趨勢，酸奶的整體感官評價下降。張巖等[6]研究發現在4 ℃條件下貯藏時，乳酸菌生長情況以及酸乳品質最佳，可有效延長酸乳貨架期。本文從食品安全角度出發，以市售的4 種活性乳酸菌飲料為研究對象，測定其中的乳酸菌活菌數量，判斷其在保質期內是否符合宣傳內容，是否達到國家乳制品食品衛生安全標準。此外，通過比較冷藏溫度和室溫保存溫度對乳酸菌活菌數的影響，評價不同品牌活性乳酸菌飲料的貯藏性差異以及為該類產品的貯藏及消費提供建議。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

乳酸菌飲料A、B、C 和D，市售。

蛋白胨、牛肉膏、酵母菌粉、醋酸鈉（乙酸鈉）、磷酸氫二鉀、檸檬酸銨、硫酸鎂、硫酸錳、瓊脂、吐溫-80 和葡萄糖。

潔凈工作臺（SW-CJ-2FD）、高壓蒸汽滅菌鍋（KG-SX-500）、恒溫水浴培養箱（GHX-927OB）、冰箱（BCD-621WDCAU1）、數顯pH 計（梅特勒-托利多儀器有限公司）、天平、移液槍、平板、1.5 mL EP 管、無菌水、封口膜、250 mL 錐形瓶、1 L 燒杯、玻璃棒、1 L 量筒。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養基配制

本實驗主要采用乳酸菌專用培養基MRS，成分為蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、酵母菌粉5 g、醋酸鈉（乙酸鈉）5 g、磷酸氫二鉀2 g、檸檬酸銨2 g、硫酸鎂0.2 g、硫酸錳0.2 g、瓊脂20 g、吐溫-80 1 mL、葡萄糖20 g，加水定容至1 000 mL 后，用冰乙酸調pH 值至6.2 ～6.6。因葡萄糖與蛋白胨發生反應，應先將葡萄糖配制成母液，分別滅菌后再按照比例加入。

1.2.2 實驗操作方法

實驗分別取不同品牌的活性乳酸菌飲料1 mL 進行梯度稀釋，稀釋倍數為100~108，每個稀釋梯度做3 個平行，并將每個稀釋梯度的3 個平行樣涂布于已滅菌的MRS 固體培養皿上，在4 ℃恒溫培養箱中培養，每24 h 觀察一次菌落生長情況。

1.2.3 保藏溫度為4 ℃時，不同品牌MRS 培養基中乳酸菌數目的測定

（1）乳酸菌的梯度稀釋。在無菌操作臺內，移液槍吸取1 mL 樣品于1.5 mL 離心管中，此管為原液管。取8 個1.5 mL 離心管分別加入900 μL 無菌水，依次編號1、2、3、4、5、6、7、8 號管。從原液管中吸取100 μL 液體于1 號管，再從1 號吸取100 μL 液體置于2 號管，依次重復操作至8 號管，最終稀釋為101~108倍。

（2）涂布。在無菌操作臺內灼燒涂布棒，并冷卻至室溫。取一品牌不同梯度稀釋菌液樣品各100 μL，均勻涂布在已滅菌的MRS 固體培養基后并編號。設置平行對照組，其余3 個品牌操作相同。

（3）培養。將涂布完的培養基封口后倒置在恒溫培養箱內，4 ℃培養72 h 后分別計數。

1.2.4 保藏溫度為20 ℃時，不同品牌MRS 培養基中乳酸菌數目的測定

另購買的活性乳酸菌飲料放置在20 ℃培養箱中72 h，模擬室溫保存乳酸菌飲料。

（1）乳酸菌的梯度稀釋。在無菌操作臺內，移液槍吸取1 mL 樣品于1.5 mL 離心管中，此管為原液管。取8 個1.5 mL 離心管分別加入900 μL 無菌水，依次編號1、2、3、4、5、6、7、8 號管。從原液管中吸取100 μL 液體于1 號管，再從1 號吸取100 μL 液體置于2 號管，依次重復操作至8 號管，最終稀釋為101~108倍。

（2）涂布。在無菌操作臺內灼燒涂布棒，并冷卻至室溫。取一品牌不同梯度稀釋菌液樣品各100 μL，均勻涂布在已滅菌的MRS 固體培養基后并編號。設置平行對照組，其余3 個品牌操作相同。

（3）培養。將涂布完的培養基封口后倒置在恒溫培養箱內，20 ℃培養72 h 后分別計數。

1.2.5 數據分析

乳酸菌數目的計算方法是用肉眼觀察并計數。實驗數據均以平均值和標準方差表示，采用Origin 2016 數據統計軟件中的單因子方差分析（ANOVA）。

2 結果與分析

2.1 不同梯度MRS 培養基乳酸菌培養情況

由圖1 可知，乳酸菌菌落整體呈圓形，微白色，凸起，直徑為（3±1） mm，濕潤，邊緣整齊。

圖1 乳酸菌菌落形態

2.2 不同品牌乳酸菌活菌數檢測結果

由表1 可知，A 品牌乳酸菌活菌實際測量數為16.2 億個/mL，B 品牌乳酸菌活菌實際測量數為29.85 億個/mL，C 品牌實際測量數為26.15 億個/mL，D 品牌實際測量數為1.335 億個/mL。實驗所用的4 種市售活性乳酸菌飲料廣告宣傳活菌數均達到實際測量數，符合其宣傳菌數要求，且實際測量數較廣告宣傳數大很多。分析其原因為廠家為保證廣告乳酸菌數目在保質期內成立，廠家會在產品出廠時往產品中添加較多乳酸菌；廠家將廣告宣傳活菌數目降低，以達到通過檢測的目的。

表1 4 種乳酸菌飲料廣告宣傳度和實驗室實際測量數的對比結果

2.3 不同保藏溫度對乳酸菌活菌數的影響

由圖2 可知，在保藏溫度為4 ℃時，4 種品牌飲料中B 品牌乳酸菌活菌數最多，且遠大于D 品牌（P＜0.05），與其他品牌之間差異無統計學意義（P＞0.05）。在保藏溫度為20 ℃時，4 種品牌乳飲料的乳酸菌活菌數均為0，無顯著性差異（P＞0.05）。此外，相同品牌在不同保藏溫度下的活菌數結果也略有不同。A、B、C 品牌的乳酸菌飲料在4 ℃保藏時，乳酸菌活菌數大于在20 ℃的培養結果（P＜0.05），但D 品牌在4 ℃保藏時的乳酸菌含量與20 ℃保藏并無太大差異（P＞0.05）。

圖2 不同保藏溫度對4 種品牌的乳酸菌活菌數的影響

由以上結果可知，在保藏溫度為4 ℃時，D 品牌的乳酸菌數量雖然達到廣告符合標準，但在所有品牌中乳酸菌活菌數最少，其他各品牌間乳酸菌活菌數從多到少分別是B、C、A。此外，20 ℃對于乳飲料中乳酸菌活菌數的影響很大，幾乎沒有活菌檢出，建議消費者購買低溫保藏產品，并在未飲用之前放置于低溫冷藏。

3 結論與討論

3.1 結論

本實驗通過不同品牌活性乳酸菌飲料菌數符合度鑒定及不同溫度對活菌數的影響，得出以下結論。①A、B、C 和D 品牌的活性乳酸菌飲料菌數達到均其宣傳數，測量菌數分別為1.62×109個/mL、2.985×109個/mL、2.615×109個/mL 和1.335×108個/mL。②4 種品牌乳飲料中B 品牌乳酸菌含量最高，與D 品牌之間存在顯著性差異（P＜0.05），與其他品牌之間差異無統計學意義（P＞0.05）。③在保藏溫度為20 ℃時，4 種品牌乳飲料的乳酸菌含量均為0，無顯著性差異（P＞0.05）。④活性乳酸菌飲料應當放置在4 ℃左右條件下貯藏，室溫會影響其乳酸菌活性和含量。

3.2 討論

實驗選取的4 種市售活性乳酸菌飲料菌數均達到其宣傳數。董慶利等[7]對市場乳酸菌飲料的抽檢結果表明，兩種乳酸菌飲料在冷藏溫度下，乳酸菌數顯著下降，但仍在其宣傳范圍內。本實驗結果與董慶利等結論相對比發現，乳制品市場已經趨于規范，并未存在虛假宣傳的現象。

此外，本實驗比較了溫度對乳酸菌數的影響。當不同品牌在溫度為4 ℃保藏時，A、B、C 培養結果之間差異無統計學意義，且檢測出的活菌數量未低于廣告宣傳數。當不同品牌在20 ℃下保藏時，所有樣品中乳酸菌均未檢出，說明20 ℃對于乳飲料中乳酸菌含量影響很大，與張巖等[6]實驗關于酸乳在4 ℃條件下貯藏時，乳酸菌生長情況以及酸乳品質最佳，可有效延長酸乳貨架期的結果相同。在4 ℃保藏時，A、B、C 品牌的乳酸菌含量大于20 ℃的活菌數（P＜0.05），但D 品牌4 ℃保藏時乳酸菌含量與20 ℃保藏并無太大差異（P＞0.05）。綜上所述，所有活性乳酸菌飲料均應當放置在4 ℃條件下貯藏，20 ℃（室溫）會影響其乳酸菌活性和含量，從而導致活性乳酸菌飲料的營養價值降低。建議消費者購買時，挑選在保質期內的低溫保藏產品，并在未飲用前放置于低溫冷藏。