等溫擴增熒光技術快速檢測沙門氏菌的研究

梁振瑞，張 薇，許紹坤，李鮮鮮，馮 紅，自武全

（云南瑞栢泰生物科技有限公司，云南昆明 650000）

沙門氏菌是革蘭氏陰性菌，屬于腸桿菌科，是常見的食源性致病菌，目前已知血清型有2 500 個以上[1-3]。人一旦攝入了含有大量沙門氏菌的食品，就會引起細菌性感染，進而導致食物中毒、急性腸胃炎等疾病，因此，沙門氏菌檢測是各個國家檢驗機構的必檢項目之一[4]。目前，檢測沙門氏菌的方法有很多，如酶聯免疫法[5]、PCR 法等[6]，但這些檢測方法都存在檢測過程煩瑣、檢測周期長的弊端[7]。近年來，隨著新技術的不斷發展與完善，以分子生物學技術為基礎的分析檢測方法迅速發展[8-9]。因此，建立一種快速簡便的沙門氏菌檢測方法具有重要意義。

等溫擴增熒光技術是核酸等溫擴增和熒光技術結合的新型核酸診斷POCT 技術，針對目的片段設計4 ～6 條特異引物。使用DNA 聚合酶，通過添加熒光染料實時監控整個擴增過程，分析實時擴增曲線和產物熔解曲線對產物進行定性或半定量。等溫擴增熒光技術對溫度精準度要求低，只需要恒定溫度就能完成擴增反應，不需要預先進行雙鏈DNA 的變性，大大縮短了反應時間。由于該方法具有操作簡單、反應快速、靈敏度和特異性強等優勢，已被廣泛用于病原體的快速檢測。

1 材料與方法

1.1 病原菌

沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏桿菌、惡臭假單胞菌（簡稱：SM、DC、JP、ZH、EC）由云南國際旅行衛生保健中心（昆明海關口岸門診部）提供。

1.2 主要儀器

電泳儀、電泳槽、電子天平、微波爐、凝膠成像儀、OPG GENIE Ⅱ系統等溫擴增熒光系統（OptiGene 公司）、恒溫水浴鍋、大龍移液器等。

1.3 方法

1.3.1 DNA 的提取

采用菌液直接擴增法提取DNA，按1 ∶1 的比例加入裂解液與菌液混合，95 ℃水浴或金屬浴加熱5 min，備用。

1.3.2 引物的設計

利用美國NCBI 提供的BLAST 在線軟件分析沙門氏菌中的SSAQ 基因目標序列，結合快速熒光PCR 法對目標片段的要求，篩選出長度為1 079 bp穩定的保守區域，作為引物設計的目標片段，并利用目標片段序列作為引物探針，針對保守區使用Lamp Designer 軟件設計引物SM-1，其包括1 對內引物（FIP，BIP）和1 對外引物（F3，B3）。

1.3.3 等溫擴增熒光法的建立

向擴增反應管中加入2.5 μL 沙門氏菌DNA，18.5 μL 反應液，4 μL 引物，陰性對照加2.5 μL ddH2O，混勻。用GENIE Ⅱ設置擴增程序65 ℃反應40 min，熔解程序98 ～80 ℃，0.05 ℃為1 個循環，根據擴增曲線和熔解曲線判定實驗結果。

（1）特異性檢測試驗。用等溫擴增熒光法對沙門氏菌和其他非沙門氏菌（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏桿菌和惡臭假單胞菌）菌株提取的DNA 分別進行擴增。

（2）靈敏度檢測實驗。將沙門氏菌核酸樣本（初始濃度為528 ng·μL-1）10 倍比依次稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9和10-10濃度檢測最低檢測限。取八連管，每管分裝18.5 μL Mix，4 μL 引物組，2.5 μL 樣本，用ddH2O 作陰性對照。65 ℃反應40 min；熔解程序為98 ～80 ℃進行上機擴增。

1.3.4 常規PCR 檢測沙門氏菌

（1）重復性實驗。向擴增反應管中加入1 μL 沙門氏菌DNA（未稀釋），12.5 μL 反應液，2 μL 引物（上游引物、下游引物各1 μL），9.5 μL ddH2O，混勻，設置一個空白對照，以ddH2O 代替，重復7 次，設置程序開始運行。完成電泳后，將凝膠塊放置凝膠成像儀中，觀察電泳條帶。

（2）靈敏度檢測實驗。將沙門氏菌核酸樣本（初始濃度為528 ng·μL-1）10 倍比依次稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6濃度檢測最低檢測限。設置一個原液濃度、一個空白對照，分別對擴增后不同濃度的沙門樣本進行電泳分析，根據其條帶的亮度和清晰度分析其最低檢測限。

2 結果與分析

2.1 引物設計

引物設計完成后，使用BLAST 軟件比對，結果發現，引物序列與沙門氏菌基因高度重合，且未匹配到其他病原的序列信息，初步證明SM-1 引物有比較高的特異性。

2.2 等溫擴增熒光法

2.2.1 特異性檢測試驗

對沙門氏菌和其他4 種非沙門氏菌（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏桿菌和惡臭假單胞菌）同時進行檢測，其結果只有沙門氏菌出現了特異性擴增，起峰時間在30 min 以內，將時間延長至1 h 后其他樣本也未出現擴增，說明該試劑盒只針對沙門氏菌進行特異性檢測。

2.2.2 靈敏性檢測實驗

由表1 可知，當樣本檢測濃度大于等于10-4時，本試驗所建立的等溫擴增熒光檢測方法均能在30 min 內檢出；當檢測濃度低于10-4時未出現完整的擴增曲線，說明建立的等溫擴增熒光技術能快速檢測沙門氏菌的濃度為10-4，檢測限為5.28×10-2ng·μL-1。

表1 靈敏度檢測實驗結果

2.3 常規PCR 檢測沙門氏菌的結果

2.3.1 PCR 方法檢測沙門氏菌的重復性

對沙門氏菌的DNA（未稀釋）進行PCR 擴增，重復10 次，均可見清晰明顯的288 bp 大小的條帶，與預期結果吻合，說明該引物重復性好。

2.3.2 PCR 方法檢測沙門氏菌的靈敏度

菌液稀釋到10-3時候擴增效果不穩定，有微弱的條帶但時常不會顯現，因此判斷10-2為常規PCR的最穩定的最低檢測濃度，檢測限為5.28 ng·μL-1，詳見圖1。與等溫擴增熒光法相比，檢測的靈敏度弱于等溫擴增熒光法。

圖1 沙門氏菌不同濃度電泳結果

3 結論與討論

傳統的沙門氏菌檢測方法整個過程需4 ～5 d，且過程煩瑣[10]。聚合酶鏈式反應在沙門氏菌診斷方法中具有較高的特異性和靈敏度，是沙門氏菌感染診斷中最具有應用前景的一種方法。然而，常規PCR 檢測時間長，對反應環境要求較高，且檢測儀器笨重。因此，建立一種反應快速、操作簡單、特異性靈敏的方法至關重要。目前，等溫擴增熒光法是一種能在恒定溫度下進行體外核酸擴增的技術，已被廣泛應用于醫學病原物檢測、食品安全檢測和植物病原物的檢測等方面[11]，有著極為廣泛的應用前景。

本文測試了4 種非沙門氏菌（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏桿菌和惡臭假單胞菌），結果發現，本方法只對沙門氏菌的檢測結果呈陽性，而對4 種非沙門氏菌的檢測結果呈陰性，表明該方法特異性良好。同時梯度稀釋方法進行沙門氏菌的靈敏度試驗，并與常規PCR 檢測方法進行了比較。結果表明，本試驗建立的等溫擴增熒光法檢測沙門氏菌的靈敏度為5.28×10-2ng·μL-1，而常規PCR 的檢測限為5.28 ng·μL-1，比常規PCR 靈敏100 倍。

等溫擴增熒光法不需要反復變換溫度，檢測速度、易攜性等方面比PCR 有很大的優勢，有著操作簡單、快速、敏感性和特異性好等特點，具有良好的發展前景，是病原檢測的一項重要技術。