超臨界CO2 萃取桑枝黃酮工藝的研究

李文馨，殷 勇，孫惠桉，陳 菊，陸 敏，王雪雅

（1.貴州省農業科學院蠶業研究所，貴州貴陽 550006；2.貴州省農業對外經濟合作中心，貴州貴陽 550001）

桑枝（Ramulus mori）屬于桑科桑屬植物桑（Morus albaL.）的一年生干燥嫩枝，屬于原衛生部于2002 年發布的《關于進一步規范保健食品原料管理的通知》（衛法監發〔2002〕51 號）中《可用于保健食品的物品名單》，收錄在《中國藥典》中，具有祛風濕、利關節、益肺氣等作用[1-2]。根據相關文獻報道，桑枝富含多種生物活性成分，如黃酮、香豆素、多糖以及生物堿等，其中黃酮類成分是主要成分之一[3-4]。

根據其基本結構黃酮可分為黃酮類、黃酮醇類、二氫黃酮類、二氫黃酮醇類以及其他黃酮類等，廣泛分布于植物的葉片、花和果實中，部分與糖結合成苷類形式存在，少部分以游離形式存在[5]。近幾年，黃酮類物質的研究相對較多，對心血管系統、神經系統、內分泌系統等具有藥理作用[6-7]。

超臨界萃取技術是以超臨界流體的性質為基礎，在高壓下，使需要萃取的溶質溶解于超臨界流體中，再進行降壓，或者升溫，降低溶質的密度，從而降低在超臨界流體中的溶解度，使其從流體溶液中析出，實現萃取指定溶質的技術[8]。近年來被普遍應用于醫藥、生物、食品和化學等領域，具有處理溫度低、提取率高、對人體無害和安全穩定等特點[9-11]。與其他提取方法相比，存在明顯優勢[12]。目前，關于桑枝中總黃酮的提取方法主要是浸提法和超聲波提取法[13-14]。

本文以桑枝為研究對象，采用超臨界CO2萃取技術，以桑枝總黃酮得率為指標，通過正交試驗確定桑枝黃酮萃取的工藝參數，可為桑枝黃酮的綜合利用和開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

桑枝：市售，采收地為安徽省亳州地區，將干燥后的桑枝粉碎過篩，取30 ～40 目為桑枝粉，冷藏備用；CO2：純度≥99.9%；NaNO2、Al(NO3)3、NaOH、無水乙醇：國藥集團化學試劑有限公司；蘆丁標準品：北京索萊寶科技有限公司。

1.2 主要儀器與設備

SFE-4 超臨界CO2萃取儀：美國應用分離公司；Multiskan GO 酶標儀：Thermo Fisher Scientific 公司；Centrifuge 5424 離心機：Eppendorf 公司；BSA224SCW 電子分析天平：德國賽多利斯公司；DHG-9240A 電熱鼓風干燥箱：上海煜南儀器有限公司；FW135 粉碎機：天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 超臨界CO2萃取

準確稱取桑枝粉2 g 裝入萃取釜中，達到設定溫度時，加壓調至設定值，設定CO2流速為3 L·min-1，以無水乙醇作為夾帶劑，調整夾帶劑流速，循環萃取。待萃取完畢，收集萃取液，過濾定容，待測。分別考察不同的萃取溫度、萃取壓力、萃取時間和夾帶劑流速對于桑枝總黃酮得率的影響。

1.3.2 單因素試驗

分別考察萃取溫度（30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃和50 ℃）、萃取壓力（40 MPa、45 MPa、50 MPa、55 MPa和60 MPa）、 萃取時間（30 min、45 min、60 min、75 min 和90 min）、 夾帶劑流速（0.500 mL·min-1、0.625 mL·min-1、0.750 mL·min-1、0.875 mL·min-1和1.000 mL·min-1）對桑枝總黃酮得率的影響。

1.3.3 正交試驗

為全面考察超臨界CO2萃取中各因素的影響，在單因素試驗結果的基礎上開展正交試驗，以萃取溫度、萃取壓力、萃取時間和夾帶劑的流速為考察因素，以桑枝總黃酮的得率為指標，采用4 因素3 水平正交試驗進行優化，確定超臨界CO2萃取桑枝黃酮的最佳工藝條件，試驗的各因素水平見表1。

表1 正交試驗因素水平表

1.3.4 總黃酮得率的測定

（1）標準曲線的繪制。準確稱取蘆丁標準品，加入無水乙醇定容到50 mL，搖勻，即為蘆丁標準溶液。準確吸取標準溶液0 mL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL 和5 mL，置于10 mL 容量瓶中，加入5%NaNO2溶液0.5 mL，混合均勻后靜置5 min，加入10% Al(NO3)3溶液0.5 mL，混合均勻后靜置5 min，再加入4% NaOH 溶液4 mL，以50%乙醇溶液定容，搖勻后放置15 min，測定OD510nm，橫坐標為蘆丁濃度，縱坐標為吸光度值，繪制標準曲線[15]。

（2）桑枝總黃酮含量的測定。準確吸取待測樣品液1 mL，按照上述步驟測定吸光度值，總黃酮含量根據標準曲線的回歸方程計算。

（3）桑枝總黃酮得率的計算。根據總黃酮含量計算桑枝中總黃酮得率，計算公式為

式中：c為提取液總黃酮含量，mg·mL-1；v為提取液定容后的體積，mL；m為桑枝粉的質量，mg。

2 結果與分析

2.1 標準曲線

標準曲線的線性回歸方程與系數如圖1 所示。

圖1 蘆丁標準曲線圖

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 萃取溫度對桑枝總黃酮得率的影響

由圖2 可知，隨著溫度的升高，桑枝總黃酮得率呈現先升高后降低的趨勢，當溫度達到40 ℃時，桑枝總黃酮得率最大。在超臨界CO2萃取過程中，溫度的影響主要表現在兩個方面。①隨著溫度的升高，CO2流體密度降低，溶解能力下降，不利于萃取；②在一定壓力條件下，溫度的升高可提高溶質在CO2中的熱運動，從而增大相應的溶劑蒸汽壓，使得萃取物的揮發性擴散系數增強，有利于萃取[16-17]。因此，確定最佳萃取溫度為40 ℃。

2.2.2 萃取壓力對桑枝總黃酮得率的影響

由圖3 可知，隨著壓力的升高，桑枝總黃酮得率總體呈上升趨勢，且在50 MPa 時得率最高，一般認為增加壓力，在增加CO2的密度的同時還會減少傳質距離，有利于傳質效率的增加[18]。當壓力升高到55 MPa 時，總黃酮得率出現下降趨勢，隨著壓力的升高，流體對流性和擴散性下降，傳質速率降低[19]。壓力的增大也會促進基質的溶脹，從而加快有效成分向外擴散的速率，促進萃取過程中的傳質[20]。同時，萃取壓力較高，組織會發生形變、疏松，細胞壁受到破壞，通透性提高，使總黃酮溶出性增強，這也可能是壓力達到60 MPa 時，總黃酮得率出現小幅度上升的原因[21]。因此，確定最佳萃取壓力為50 MPa。

圖3 萃取壓力對桑枝總黃酮得率的影響圖

2.2.3 萃取時間對桑枝總黃酮得率的影響

由圖4 可知，桑枝總黃酮得率隨著萃取時間的延長而增加。萃取時間從30 min 增加到45 min，總黃酮得率增加得比較快，萃取時間大于45 min，得率增加得比較緩慢，這是因為萃取剛開始，CO2流體與桑枝粉顆粒接觸不充分，總黃酮得率較低，隨著萃取時間的延長，CO2流體與桑枝粉顆粒的混合越來越充分，傳質速率提高，桑枝粉中被萃取的總黃酮含量快速增加，從而總黃酮得率增加較快；當萃取達到一定時間后，由于桑枝粉顆粒中剩余的未被萃取的總黃酮含量較少，總黃酮得率不會隨著萃取時間的進一步延長而明顯增加。因此，確定最佳萃取時間為45 min。

圖4 萃取時間對桑枝總黃酮得率的影響圖

2.2.4 夾帶劑流速對桑枝總黃酮得率的影響

由圖5 可知，當夾帶劑無水乙醇流速在0.750 mL·min-1時，桑枝總黃酮得率最高。夾帶劑流速在一定范圍內的增快，有利于總黃酮得率的增加，可推斷是在此濃度范圍內，夾帶劑流速的變快有利于桑枝粉中黃酮類化合物的溶出。但當夾帶劑流速達到一定數值后，會縮短桑枝粉與夾帶劑的接觸時間，影響黃酮類化合物在溶劑中的溶解，降低夾帶劑的使用效率，從而降低了總黃酮得率。CO2是非極性物質，這導致其在某些分離過程中存在很大的局限性[22]：對于烴類物質和弱極性的脂溶性物質溶解能力較好，但對于具有強極性的有機化合物則需增大萃取壓力或使用夾帶劑來實現分離，因而單純的超臨界CO2萃取只適合極性較低的親脂性物質，黃酮類物質一般極性較大[23]。實驗表明，在不加夾帶劑的條件下只能得到少量易揮發性的小分子物質，黃酮類化合物的得率極低，因此針對黃酮類化合物的提取，夾帶劑的添加十分必要[24]。綜上，確定最佳夾帶劑流速為0.750 mL·min-1。

圖5 夾帶劑流速對桑枝總黃酮得率的影響圖

2.3 正交試驗結果

由表2 可知，每個因素對桑枝總黃酮得率的影響程度都有所差別，且影響程度大小分別為夾帶劑流速（D）＞萃取壓力（C）＞萃取溫度（A）＞萃取時間（B），根據各因素影響水平選取各因素的最佳水平A2B2C1D2，即萃取溫度40 ℃、萃取時間45 min、萃取壓力45 MPa 以及夾帶劑流速0.750 mL·min-1。

表2 正交試驗結果與極差分析表

由表3 可知，萃取溫度、萃取時間、萃取壓力和夾帶劑流速對桑枝總黃酮得率均有極顯著影響，由F值可得出各因素對桑枝總黃酮得率顯著性影響的順序為夾帶劑流速、萃取壓力、萃取溫度和萃取時間，這與極差分析的結果一致。

表3 正交試驗方差分析結果

按優選的工藝進行驗證實驗，平行操作3 次，桑枝總黃酮得率平均值為2.4817 mg·g-1，RSD 值為3.491%，高于表2 中的其他組合，表明該工藝能較好地提取桑枝總黃酮，為最佳萃取條件。

3 結論

本文選擇超臨界CO2萃取桑枝總黃酮，采用正交試驗進行工藝優化。結果表明，超臨界CO2萃取桑枝黃酮的最佳工藝條件為萃取時間45 min、萃取溫度40 ℃、萃取壓力45 MPa 和夾帶劑流速0.750 mL·min-1，在此條件下，桑枝總黃酮得率為2.481 7 mg·g-1，其中夾帶劑流速對桑枝總黃酮得率的影響最為顯著，萃取壓力次之，萃取溫度和萃取時間的影響相對較小。