DNA甲基化與高同型半胱氨酸血癥

甕佳旭，周宏宇，李子孝，3，4

高同型半胱氨酸血癥（hyperhomocysteinemia，HHcy）與動脈粥樣硬化性血管病的關聯源于McCully[1]對一名有HHcy的8歲男孩進行尸檢時，發現了廣泛的動脈血栓和動脈粥樣硬化病灶形成。統計數據表明，有40%被診斷為早發冠狀動脈疾病、外周血管疾病或復發性靜脈血栓形成的患者存在HHcy[2]。多項研究表明HHcy是心血管疾病的獨立危險因素，并可能與血管內皮細胞功能障礙有關[1，3-5]。DNA甲基化作為基因表達表觀遺傳調控的重要形式之一，其水平異常在伴有HHcy的心血管疾病患者中也有報道[6-7]。由Hcy和甲硫氨酸（methionine，Met）共同參與的Met-Hcy（methionine-homocysteine，M-H）循環可為甲基化反應提供甲基單元，其代謝關鍵酶功能缺陷或輔酶因子缺乏所導致的Hcy水平升高可在整體或位點特異性水平參與DNA甲基化的調節[8]。這可能是HHcy增加動脈粥樣硬化和心腦血管疾病風險的潛在機制之一。

1 Hcy的來源、代謝途徑及影響因素

Hc y是人體內一種含硫的非必需氨基酸，主要來源于食物中攝取的必需氨基酸Met（也稱為蛋氨酸）[9]。Met在甲硫氨酸腺苷轉移酶（methionine adenosyltransferase，MAT）的催化和ATP的參與下生成S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine，SAM），SAM通過甲基轉移酶（DNA methyltransferases，D N M Ts）將甲基轉移至D N A、R N A、蛋白質等分子后，形成S-腺苷同型半胱氨酸（S-adenosyl-L-homocysteine，SAH），再被SAH水解酶（SAH hydrolase，SAHH）水解脫去腺苷后生成Hcy（圖1）。目前普遍認為這是人體產生Hcy的唯一途徑[10]。

圖1 同型半胱氨酸的生成與代謝循環

Hcy在人體內通過再甲基化和轉硫化兩個途徑完成代謝[11]。再甲基化途徑是指Hcy在酶催化下結合甲基再次生成Met的過程。根據提供甲基的化學物不同，再甲基化途徑分為由5-甲基四氫葉酸（5-methyltetrahydrofolate，5-MTHF）提供甲基的葉酸循環途徑和由三甲基甘氨酸（又名甜菜堿）提供甲基的甜菜堿循環途徑。葉酸循環途徑在甲硫氨酸合成酶（methionine synthetase，MS）的催化下，以維生素B12為輔酶完成[12]。其中，葉酸的活化形式四氫葉酸在5-MTHF生成過程中發揮重要作用，在被絲氨酸羥甲基轉移酶（hydroxylmethyl transferase，SHMT）轉化為5，10-亞甲基四氫葉酸后，由亞甲基四氫葉酸還原酶（methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）還原生成5-MTHF，為Hcy葉酸循環途徑提供甲基。這個過程幾乎存在于所有的細胞中[13]。肝臟和腎臟中也可以發生由甜菜堿—同型半胱氨酸甲基轉移酶（betainehomocysteine methyltransferase，BHMT）催化完成的甜菜堿循環[14-15]。轉硫途徑是指Hcy在胱硫醚β合酶（cysteine beta synthase，CBS）的催化下，以維生素B6作為輔酶因子，與絲氨酸結合生成胱硫醚，之后γ胱硫醚酶將胱硫醚水解為半胱氨酸，再由谷胱甘肽合成酶催化合成谷胱甘肽隨尿液排出[16-17]。

體內大部分Hcy以二硫鍵與血漿蛋白結合，在正常情況下保持穩定水平，正常值為5～15 μmol/L[18]。當Hcy生成或代謝途徑受遺傳或非遺傳因素影響，出現膳食中葉酸、維生素B12和維生素B6缺乏或相關酶缺陷時，Hcy的穩定水平被打破，在人體中發生聚積[19-21]。當血漿中Hcy的濃度增加至15 μmol/L以上時，即為HHcy。

2 HHcy影響sDNA甲基化水平

較多研究表明，Hcy水平可影響整體的DNA甲基化水平。例如：在葉酸和維生素B12缺乏、Hcy代謝酶基因MTHFRC677T型突變的群體中可檢測到Hcy水平升高、DNA甲基化水平降低[22]。在HHcy小鼠模型和HHcy患者的動脈粥樣硬化斑塊中均可觀察到整體DNA呈低甲基化狀態[23-24]。通過檢測動脈粥樣硬化性血管病變患者和匹配后的健康對照者血漿中Hcy和白細胞中的DNA甲基化水平，發現動脈粥樣硬化性血管病變患者的Hcy水平升高、SAM/SAH比值和DNA甲基化水平降低[25]。研究結論為DNA甲基化的狀態與血漿Hcy水平顯著相關。此外，有研究發現，Mthfr缺陷小鼠的大腦和卵巢中DNA呈低甲基化水平[26]。有研究顯示，妊娠早期葉酸缺乏與嬰兒神經管發育缺陷風險增高有關，DNA低甲基化可能是相關機制之一[27]。Pogribny等[28]給雄性大鼠喂食葉酸缺乏飲食9周，檢測發現大鼠血漿中SAM濃度、SAM/SAH比值降低，肝臟整體DNA甲基化水平降低。以上研究均證明Hcy水平升高可能與DNA甲基化水平的降低有關。

Hc y水平與DNA甲基化的關系可能與M-H循環中葉酸循環途徑的代謝平衡有關。首先，在哺乳動物中，SAM是甲基化反應的甲基供體，SAM及其反應產物SAH的濃度可調節DNA甲基化反應[29-30]。其次，SAH可以與DNMTs的催化區域高親和力結合，成為強有力的競爭性甲基轉移酶抑制劑，因此SAH的快速去除對甲基化反應效率至關重要[31]。在Hcy生成過程中，SAH水解為Hcy作為可逆反應，趨向于SAH的合成明顯優于水解。因此，Hcy的快速代謝對于SAH的水解也非常重要，Hcy積聚會造成SAH積聚，進而引起甲基化反應抑制，導致DNA甲基化水平降低[32]。因此，目前觀點認為Hcy通過M-H循環中的SAM和SAH與DNA甲基化形成連接，占據了一碳代謝和表觀遺傳修飾之間的重要連接點[8]。

有研究在小鼠模型中探索了Hcy升高的情況下，SAH積聚與細胞低甲基化的關系，發現Cbs基因缺陷小鼠表現出Hcy及SAH增加，肝臟和大腦中蛋白甲基化狀態降低，但整體DNA甲基化狀態未受影響[33-34]。研究結果提示，整體DNA低甲基化可能不參與小鼠Cbs基因突變的病理生理學過程，但并不能排除有特定位點DNA甲基化異常的可能性。因此，在未來的研究中分析全基因組DNA甲基化的狀態變化是有必要的。

3 HHcy相關DNA甲基化與動脈粥樣硬化

在動脈粥樣硬化患者中經常觀察到Hcy水平升高，有研究認為HHcy對DNA甲基化的影響可能是心血管疾病風險增加的機制之一，這可能與動脈粥樣硬化發病過程中的內皮細胞功能障礙、平滑肌細胞增殖和轉移、脂質代謝等過程有關[35-37]。

3.1 內皮和平滑肌細胞功能障礙 目前認為血管內皮和平滑肌細胞功能障礙是動脈粥樣硬化發展過程中的重要階段，并預示著不良的心血管結局[38]。

有研究認為HHc y通過影響DNA甲基化從而在內皮細胞的衰老過程中發揮作用。Zhang等[39]發現，體外HHcy條件下培養的人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）在傳代期間出現p16、p21和p53等細胞衰老標志物的加速上調，通過實時定量聚合酶鏈反應、甲基化特異性聚合酶鏈反應檢測，發現了端粒酶逆轉錄酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）基因啟動子區域的低甲基化。內皮細胞在一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）的催化下合成一氧化氮（nitric oxide，NO），可抑制血小板黏附、平滑肌細胞增殖和LDL-C的氧化[40]。在體外HHcy條件下培養人臍靜脈內皮細胞可以檢測到NOS的抑制劑——不對稱二甲基精氨酸表達含量增加，并導致NO合成抑制、內皮細胞破壞，從而激活動脈粥樣硬化過程[41]。其中的機制與HHcy條件下二甲基精氨酸二甲胺水解酶（dimethylarginine dimethyl amino hydrolase，DDAH）基因啟動子區域的甲基化水平降低有關[42]。上述研究表明，HHcy對內皮細胞功能的影響可能與DNA甲基化有關。

血管平滑肌細胞的增殖和去分化參與動脈粥樣硬化形成的病理過程[43]。血小板衍生生長因子（platelet derived growth factor，PDGF）基因是血管平滑肌細胞增殖的有效促分裂劑[44]。Han等[45]在不同梯度濃度的Hcy條件下培養人血管平滑肌細胞，發現血管平滑肌細胞增殖數量、PDGF表達水平隨Hcy濃度增高而增加，PDGF啟動子甲基化的水平隨Hcy濃度增加而降低。進一步的評估發現，Hcy處理組細胞內SAH的濃度較對照組增加，SAM較對照組濃度降低，SAM/SAH比值顯著降低。這與HHcy導致DNA去甲基化水平降低的機制相符，表明HHcy可能影響PDGF啟動子區域的低甲基化，導致PDGF表達、刺激血管平滑肌細胞增殖，從而促進動脈粥樣硬化的加速發展。

3.2 脂質代謝 有證據表明DNA甲基化異常可能是HHcy相關脂質代謝異常的重要作用機制。一項調查了152例妊娠中期女性維生素B12和脂質關系的隊列研究提示，維生素B12水平較低的妊娠期女性Hcy水平顯著升高，脂肪細胞中SAH濃度增加，同時血漿TC、LDL-C、TC/HDL-C水平升高。進一步的全基因組DNA甲基化測序分析發現，這種變化與膽固醇調節元件結合蛋白（sterol regulatory element binding transcription factor 1，SREBF1）基因，以及低密度脂蛋白受體（low-density lipoprotein receptor，LDLR）基因轉錄起始位點甲基化水平降低同步[46]。

有動物實驗使用高Met飲食喂養載脂蛋白E（apolipoprotein E，ApoE）基因敲除小鼠20周，檢測發現小鼠血清Hcy升高、SAH聚集和DNMT1表達水平降低，基因組分析表明，HHcy組小鼠脂肪酸結合蛋白4（fatty acidbinding protein 4，Fabp4）基因啟動子區域甲基化降低，FABP4的表達增加[47]。FABP4作為脂肪細胞和巨噬細胞中長鏈脂肪酸和視黃酸的脂質轉運蛋白，其表達增高可增加TC和TG的積累，在上述試驗中測量主動脈根部動脈粥樣硬化斑塊面積時，HHcy組小鼠較對照組病灶面積明顯增大[48]。除此之外，HHcy條件下體外培養巨噬細胞72 h后，實驗組Fabp4基因啟動子甲基化水平顯著降低，Fabp4mRNA轉錄和蛋白表達明顯上調[48]。這提示，Fabp4啟動子區域低甲基化在HHcy介導的脂質代謝紊亂中可能發揮重要作用。上述HHcy動物模型實驗的結果支持并擴展了動脈粥樣硬化發展過程中的體內、體外機制，證明HHcy可能對脂質代謝過程中的DNA甲基化產生影響，從而加速動脈粥樣硬化的形成。

4 HHcy與DNA甲基化對心血管危險因素的影響

HHcy與DNA甲基化的關聯在糖尿病等心血管疾病的危險因素中也有體現。一項研究選取了85例糖尿病患者和30例健康受試者作為對照，分別采集單純性糖尿病組、早期糖尿病腎病組、臨床糖尿病腎病組和正常對照組外周血白細胞DNA，測定MTHFR基因啟動子區域甲基化狀態及血清中Hcy水平，結果顯示，與正常對照組相比，單純性糖尿病組、早期或臨床糖尿病腎病組均具有更高的Hcy水平，且MTHFR基因啟動子區域呈現低甲基化狀態[49]。該研究顯示，HHcy與MTHFR啟動子低甲基化有明顯關聯，且此種關聯與糖尿病有關。

Hcy通過代謝循環中的SAM和SAH影響DNA甲基化狀態，是一碳代謝和表觀遺傳修飾之間的重要連接點。HHcy是心血管疾病的獨立危險因素，其機制可能與血管內皮細胞及平滑肌細胞功能障礙、脂質代謝異常等動脈粥樣硬化過程中DNA甲基化狀態的改變有關，未來需要更多的研究對這些機制進行探索。

【點睛】HHcy可能通過影響DNA甲基化影響動脈粥樣硬化的形成，從而增加心血管疾病的風險。