核酸基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜技術在結核病和非結核分枝桿菌病診斷中的臨床應用專家共識

解放軍總醫院第八醫學中心結核病醫學部 《中國防癆雜志》編輯委員會 中國醫療保健國際交流促進會結核病防治分會基礎和臨床學術部

結核病是嚴重威脅人類健康的重要傳染性疾病之一。世界衛生組織(World Health Organization,WHO)估計,2021年全球有1060萬例新發結核病患者,死亡近160萬例,新增45萬例耐多藥/利福平耐藥結核病患者。其中,我國新發78萬例結核病患者,新增耐多藥/利福平耐藥結核病患者約3.3萬例,是全球結核病及耐藥結核病高負擔國家之一[1-2];肺外結核占所有結核病的15%～40%[3-6],因其容易導致器官或組織功能性損傷和器質性障礙而成為近年來結核病領域關注的重點;全球由非結核分枝桿菌(non-tuberculous mycobacteria,NTM)引起的疾病比例呈現上升趨勢[7-8],在很多發達國家,NTM病甚至超過了結核病[9-10]。我國的NTM分離率也逐年增高[11-15],南方和沿海地區高于北方和內陸地區[11,16]。宿主及環境因素對NTM病的流行也有很大影響[8,17-18]。臨床上以NTM肺病最為常見[19],NTM肺病的臨床表現、放射影像學特征和痰涂片抗酸桿菌染色檢查特征與肺結核極其相似,且大多數NTM對常用抗結核藥物呈天然耐藥或耐藥率高[11-12],需要經過數月至數年的漫長復雜的治療,有時因不能耐受藥物的不良反應,導致治療不完全或再感染而復發[20-22],對人類健康構成重大威脅,已成為全球關注的公共衛生健康問題。因此,準確快速診斷和鑒別診斷結核病與NTM病及其耐藥性,對指導臨床開展早期精準有效治療至關重要。

第一部分 核酸基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜技術的基本原理與特點

基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)技術是一種直接分析大分子的質譜技術。來自生物樣本的核酸、蛋白質、脂質等提取物與基質混合后置于合成金屬板孔的芯片中,使得樣本在基質中被晶體化。將該金屬板芯片放入質譜儀中,氮氣激光的短脈沖將在此轟擊金屬板,吸收能量后的基質將導致生物樣本解離、蒸發并在氣象階段離子化。離子化分子在靜電場中加速,噴射通過真空的金屬飛行管直到抵達檢測器,離子化分子的飛行速度取決于質荷比,其中相對分子質量小的離子抵達時間短于相對分子質量大的離子。基于以上原理,樣本解離的離子根據其飛行時間而被分開,產生一系列由不同強度的質荷比峰組成的質譜結果,且每個樣本產生一個質譜[23]。

1996年,第一個MALDI-TOF MS試驗成功鑒定出細菌[24]。自2010年以來,逐漸應用于臨床微生物檢測領域,在分枝桿菌領域也有應用,但是絕大多數應用都是基于蛋白質的相對分子質量差異,而非基因序列多態性[11, 25-33]。基于蛋白質的MALDI-TOF MS技術需要進行分枝桿菌培養,無法達到快速診斷的目的,因此,基于基因序列多態性的核酸MALDI-TOF MS技術應運而生。

核酸MALDI-TOF MS技術是以核酸作為細菌鑒定的生物標志物[34-35],基本原理是通過對多靶點基因片段進行多重PCR特異性擴增,去除脫氧核糖核苷酸后,進行各個位點的單堿基延伸反應,經處理后的延伸反應產物同質譜所需基質混合,放入飛行時間質譜儀中運行,每份樣本會得到獨特的指紋質譜圖,經過判讀后獲得菌種及耐藥信息。

核酸MALDI-TOF MS技術可以同時針對分枝桿菌的保守基因片段,例如16S rRNA、hsp65等基因的多態性進行設計,從而快速鑒定分枝桿菌菌種。同時,根據耐藥相關的基因多態性進行設計,獲得rpoB、katG、gyrA、erm(41)等分枝桿菌相關的耐藥基因突變結果。常見的基于核酸擴增技術的結核分枝桿菌檢測均基于IS6110、IS1081等位點進行擴增,選擇其中的1個或2個,而核酸MALDI-TOF MS技術可以在此基礎上考慮增加其他位點的多態性檢測,例如內轉錄間隔區(internal transcribed space,ITS)、rpoB等基因,因此鑒定分枝桿菌的敏感度更高;而且由于有多基因結果的驗證,可以在提高敏感度的同時,保證結核分枝桿菌檢測的特異度。同時,在耐藥性檢測方面應用范圍更廣,幾乎覆蓋了目前常用的抗結核和抗NTM病的藥物,檢測針對性強、準確性高。在飛行時間質譜儀檢測的過程中,從激光發射到信號接收檢測只需幾毫秒,因此在短時間內對數百例樣本同時進行檢測分析,具有高通量、快速、靈敏、高分辨率、低成本等特點,且不依賴于熒光探針等熒光類試劑,檢測周期短于一代和二代測序,對少量樣本也能進行多基因多位點檢測。通過提取生物樣本中的核酸分子繼而進行特異性擴增,實現單個核苷酸堿基的直接鑒定,無需培養,實現快速診斷,可以滿足臨床早期診斷并指導治療的需求。表1簡要概括總結了常用分枝桿菌病原學及其耐藥性鑒定的分子診斷方法的優劣勢。

已有研究證實,核酸MALDI-TOF MS技術鑒定分枝桿菌及其耐藥性具有較高的準確性。2017年,來自中國臺灣的研究團隊將此技術應用于鑒定結核分枝桿菌復合群和NTM,結果表明該技術的檢測限為5個拷貝數,同時檢測耐藥的敏感度和特異度都達到了較高水平[34]。有文獻報道,通過對168株臨床結核分枝桿菌分離株進行抗結核藥物的耐藥性分析,發現核酸MALDI-TOF MS技術檢測結核分枝桿菌耐藥性有很好的表現,大部分藥物的檢測結果與表型藥物敏感性(簡稱“藥敏”)試驗結果具有很好的一致性[36]。針對復治結核病患者的結核分枝桿菌耐藥性檢測研究顯示,核酸MALDI-TOF MS技術與液體培養藥敏檢測具有很好的一致性[37];針對涂陰或無痰肺結核患者的支氣管肺泡灌洗液樣本的檢測結果顯示,核酸MALDI-TOF MS技術的敏感度和曲線下面積(area under curve,AUC)均優于GeneXpert MTB/RIF和培養法[38]。來自西安市胸科醫院的一篇研究報道,相比于高分辨率熔解曲線方法(high-resolution melting curve,HRM),核酸MALDI-TOF MS技術表現出更高的準確性[39]。

表1 分枝桿菌病原學及其耐藥性檢測常用分子診斷方法的比較

核酸MALDI-TOF MS技術檢測分枝桿菌及其耐藥性具有較好的診斷價值和臨床應用前景。為了規范核酸MALDI-TOF MS技術在分枝桿菌病診斷中的應用,結合中國臨床證據及專家實踐,在借鑒國際研究證據的基礎上,解放軍總醫院第八醫學中心、《中國防癆雜志》編輯委員會和中國醫療保健國際交流促進會結核病防治分會基礎和臨床學術部聯合組織專家共同擬定《核酸基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜技術在結核病和非結核分枝桿菌病診斷中的臨床應用專家共識》,供臨床醫生在臨床診療時參考,并為將來進一步制定臨床相關指南提供基礎。

第二部分 共識制定的過程

2022年3月,解放軍總醫院第八醫學中心結核病醫學部和《中國防癆雜志》編輯委員會依托中國醫療保健國際交流促進會結核病防治分會基礎和臨床學部組建《核酸基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜技術在結核病和非結核分枝桿菌病診斷中的臨床應用專家共識》專家組。專家組成員必須滿足以下條件：(1)擔任中國防癆協會專業分會或中國醫療保健國際交流促進會結核病防治分會委員或《中國防癆雜志》編委、通信編委;(2)具有高級專業技術職稱;(3)從事結核病臨床、檢驗和基礎研究工作10年以上,具有豐富的相關工作經驗,在結核病領域有較高的學術地位;(4)自愿參加專家組,能夠全程參加專家共識的討論與制定,并積極提出自己的意見和建議。專家組成員來自全國結核病專業診療機構,歷時1年時間,對國內外核酸MALDI-TOF MS技術在結核病和NTM病診斷中的臨床應用及進展進行了文獻檢索和復習,并對國內各地相關臨床問題及應用經驗進行了深入調查和相互溝通。雖然核酸MALDI-TOF MS技術作為一項新型技術在結核病和NTM病診斷中的臨床應用研究較少,專家組多次召開專家討論會,經過認真分析,反復論證,歸納總結,一致認為核酸MALDI-TOF MS技術在分枝桿菌菌種鑒定和耐藥性快速檢測方面具有較好的臨床診斷價值和應用前景,最終達成一致意見,形成共識終稿。

第三部分 核酸MALDI-TOF MS技術鑒定分枝桿菌菌種及其耐藥性

一、應用核酸MALDI-TOF MS技術鑒定分枝桿菌菌種

目前,核酸MALDI-TOF MS技術可鑒定結核分枝桿菌復合群8個亞種和40個NTM菌種及其亞種,合計48個分枝桿菌菌種和亞種(表2),幾乎覆蓋了臨床上分枝桿菌病的所有常見致病菌,可以滿足臨床實現快速鑒定分枝桿菌菌種的要求,為臨床醫務人員提供診斷參考。另外,隨著臨床實踐的逐步積累,核酸MALDI-TOF MS技術可根據臨床上未來可能出現的菌種予以增加鑒定。

表2 應用核酸MALDI-TOF MS技術鑒定的分枝桿菌菌種或亞種

續表2

二、應用核酸MALDI-TOF MS技術檢測分枝桿菌對常用藥物的耐藥性

根據WHO 2018年[40]和2021年[41]發布的耐藥位點證據等級和我國發表的高質量文獻[42-44],目前核酸MALDI-TOF MS技術可檢測結核分枝桿菌4種一線抗結核藥物(異煙肼、利福平、吡嗪酰胺和乙胺丁醇)和常用的二線抗結核藥物(氟喹諾酮類、鏈霉素、阿米卡星、卡那霉素、卷曲霉素、乙硫異煙胺、丙硫異煙胺、對氨基水楊酸鈉、環絲氨酸、氯法齊明、貝達喹啉、利奈唑胺)的耐藥基因型;并可檢測NTM大環內酯類和氨基糖苷類藥物的耐藥基因型,了解其耐藥性(表3,4)。

表3 應用核酸MALDI-TOF MS技術檢測結核分枝桿菌耐藥基因及耐藥位點

續表3

表4 應用核酸MALDI-TOF MS技術檢測非結核分枝桿菌耐藥基因及耐藥位點

注 圖中1～11條詳細信息見正文“第四部分 應用核酸MALDI-TOF MS技術檢測分枝桿菌病的臨床適應證和送檢時機”中的推薦意見順序編號及解釋;IGRA：γ-干擾素釋放試驗;TST：結核菌素皮膚試驗;EC：重組結核桿菌融合蛋白;PPD：結核菌素純蛋白衍生物;MALDI-TOF MS：基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜圖1 核酸MALDI-TOF MS技術檢測分枝桿菌病的臨床適應證和送檢時機

三、應用核酸MALDI-TOF MS技術檢測分枝桿菌耐藥基因位點同義突變

基因突變一般包括錯義突變、同義突變和無義突變3種類型,核酸MALDI-TOF MS技術除可檢測上述的錯義突變外,目前還可檢測到的結核分枝桿菌常見同義突變如表5所示。

表5 應用核酸MALDI-TOF技術可檢測的結核分枝桿菌常見同義突變

第四部分 應用核酸MALDI-TOF MS技術檢測分枝桿菌病的臨床適應證和送檢時機

對可疑肺結核、肺外結核和NTM病患者的快速診斷和鑒別診斷,以及確診結核病、NTM病但治療效果不理想患者的藥敏檢測,應盡早送核酸MALDI-TOF MS檢測。見圖1。

推薦意見1：近期具有明確的肺結核密切接觸史,咳嗽、咳痰超過2周,伴或不伴有咯血、胸痛、胸悶、氣短等呼吸道癥狀和低熱、盜汗、乏力、體質量減輕等全身中毒癥狀,臨床常用結核病病原學檢查結果為陰性,影像學檢查存在肺部病變,需快速確診的患者,建議送痰和支氣管肺泡灌洗液進行培養的同時送核酸MALDI-TOF MS檢測,可在1～2 d內快速鑒定病原菌以明確診斷。

推薦意見2：胸部影像學表現高度懷疑肺結核,γ-干擾素釋放試驗(interferon-gamma release assays,IGRA)陽性,結核菌素皮膚試驗(tuberculin skin test,TST)強陽性或重組結核桿菌融合蛋白(EC;宜卡?)陽性,臨床常用病原學檢測陰性,診斷性抗結核治療效果差,適合送MALDI-TOF MS檢測,可快速明確診斷。

推薦意見3：疑似結核性胸膜炎患者,胸腔積液常規結核分枝桿菌細菌學檢查陽性率低,建議按要求送胸腔積液進行核酸MALDI-TOF MS檢測以提高病原學檢出率。

推薦意見4：疑似肺外結核,如結核性腦膜炎、結核性淋巴結炎、骨關節結核、腸結核、結核性腹膜炎、泌尿生殖系統結核、結核性心包炎、皮膚結核等肺外結核患者,治療效果差,分泌物和(或)活檢、手術組織臨床常用病原學檢測陰性時,適合送核酸MALDI-TOF MS檢測。

推薦意見5：胸部影像學表現高度疑似NTM肺病,尤其是IGRA陰性和EC皮膚試驗陰性,TST陽性者,適合及早送痰和(或)支氣管肺泡灌洗液進行核酸MALDI-TOF MS檢測。

推薦意見6：慢性肺部疾病,包括肺囊性纖維化、支氣管擴張、慢性阻塞性肺疾病、塵肺、肺間質纖維化、支氣管哮喘、過敏性肺炎、變應性支氣管肺曲霉菌病等患者,經規范性治療效果差,尤其合并免疫功能受損,如艾滋病病毒(human immunodeficiency virus,HIV)感染/艾滋病(acquired immune deficiency syndrome,AIDS)和器官移植等長期服用免疫抑制劑的患者,高度懷疑并發肺結核或NTM肺病時,適合送核酸MALDI-TOF MS,以快速鑒定病原菌及其耐藥性。

推薦意見7：對外傷或手術,包括醫療美容手術后出現局部皮膚反復感染,傷口經久不愈的患者,建議送傷口分泌物進行核酸MALDI-TOF MS,排除NTM感染。

推薦意見8：確診NTM病,包括NTM肺病和肺外NTM病的患者,需要明確感染菌種對藥物的敏感性,可進行核酸MALDI-TOF MS檢測。

推薦意見9：復治肺結核和肺外結核,抗結核藥物治療效果不佳或者病情復發,高度懷疑耐藥的患者,進行痰、分泌物、活檢及手術組織表型和基因型藥敏試驗的同時,可送核酸MALDI-TOF MS進行耐藥性檢測;高度懷疑異質性耐藥者,可在治療過程中進行核酸MALDI-TOF MS耐藥性檢測跟蹤。

推薦意見10：肺結核和肺外結核診斷明確,痰、分泌物和(或)活檢、手術組織GeneXpert MTB/RIF檢測利福平耐藥的患者,建議送核酸MALDI-TOF MS檢測結核分枝桿菌對其他一線和二線抗結核藥物的耐藥性。

推薦意見11：對于鳥分枝桿菌、胞內分枝桿菌和膿腫分枝桿菌等致病性NTM,建議送核酸MALDI-TOF MS進行耐藥性檢測;對于弱致病性的NTM,可根據送檢樣本來源、臨床癥狀和影像學表現,決定是否進行核酸MALDI-TOF MS檢測其耐藥性。

第五部分 標本的采集、運輸、檢測及實驗室質量控制、出具報告

臨床上采集的生物標本類型和質量對檢測結果及后續的臨床診斷具有直接而顯著的影響。不同類型的生物標本存在被污染的可能性,采樣部位不同,因定植菌的影響也隨之不同,因此會影響核酸MALDI-TOF MS檢測結果的可信度。對不同類型臨床標本的采集需建立標準規范的操作程序,盡量避免污染。

一、生物標本的采集

分枝桿菌病的主要標本類型為來自肺部的痰液、支氣管肺泡灌洗液,同時胸腔積液、腹腔積液、心包積液、腦脊液、膿液、尿液、糞便、骨髓及手術組織、活檢組織等均可進行核酸MALDI-TOF MS檢測。但檢測結果依賴于送檢標本中分枝桿菌的含量,如痰液檢測下限為30個菌落形成單位(colony forming units,CFU)/ml。對于NTM鑒定結果還需要考慮標本被污染或者是定植菌的可能。

(一)生物標本采集過程的注意事項

1.采集標本容器：收集臨床標本的容器內需含有分枝桿菌滅活劑成分。

2.采集標本信息：收集標本的容器上應標注患者信息、標本類型、送檢醫院和科室等信息。送檢標本應有送檢申請表,填寫受檢者信息,包括編碼、采樣日期、個人基本信息、標本類型、采樣單位等。采樣人員在采樣前及采樣后均需仔細核對受檢者信息。

3.采集標本前：采集標本之前須知曉患者是否在近期服用抗菌藥物,盡量在抗菌藥物使用之前采集標本。

4.采集標本時：不同類型的生物標本采集,必須由經過培訓且考核合格的專業人員進行規范操作,嚴格執行無菌操作,避免標本污染;對高度懷疑分枝桿菌病者,建議送檢2份以上同類型或不同類型的樣本;其他肺外結核樣本最好采集自病灶處;呼吸道樣本采集必須采取適當的感染控制預防措施,包括個人防護措施等。

5.采集標本后：采集后的樣本應該在24 h內進行滅活保存處理。

推薦意見12：生物標本采集必須由專業人員執行,采取適當的感染控制措施;收集標本的專用容器上應注明患者及標本的詳細信息;對高度懷疑分枝桿菌病者,建議采集2份以上同類型或不同類型的樣本;采集后的樣本應該立即送檢,否則須放在4 ℃冰箱暫存且在24 h內進行滅活處理。

(二)不同類型臨床生物標本采集時的注意事項

1.痰液：需3～5 ml。最好采集清晨痰或夜間痰。合格的痰標本應是患者深呼吸后,由肺部深處咳出的分泌物,包括干酪痰、血痰、黏液痰,唾液或口水為不合格痰標本。對于不合格痰標本,應重新采集。但若患者無法自行咳痰或者無痰、少痰,可通過誘導(濃氯化鈉溶液霧化誘導排痰)獲得深部痰,也可通過吸痰器從氣道采集。采集樣本后應立即送檢,實驗室收到樣本后應即刻進行質量檢查和處理等,如不能立即檢查,應暫放在4 ℃冰箱且在24 h內進行滅活保存處理。

2.支氣管肺泡灌洗液：需>15 ml。通過纖維支氣管鏡接近病灶處,用等滲氯化鈉溶液分次注入,立即負壓吸引回收,棄去首次灌洗液,以減少污染。收集2～3次回收的支氣管肺泡灌洗液至少15 ml送檢。如果回收的支氣管肺泡灌洗液超過15 ml,將支氣管肺泡灌洗液放在桌面上靜置沉淀片刻后,留取15 ml下層液體,在密封狀態下搖勻后,轉移至采樣管中,以封口膜密封管口,裝入密封袋中送檢。若灌洗液沒有及時轉移到采樣管,須放在4 ℃冰箱暫存且在24 h內進行滅活保存處理。

3.積液型樣本：比如胸腔積液、腹腔積液、心包積液、關節腔積液等樣本的留取量及處理方法同支氣管肺泡灌洗液。

4.尿液：需50 ml。留取尿液樣本前一晚盡量少飲水,取清潔容器收集清晨第一次全部尿液或24 h尿液沉淀。

5.糞便：需取體積至少為黃豆粒大小的新鮮糞便,或者稀便至少為3～5 ml。

6.組織類樣本：需取體積至少為5 mm3的新鮮或石蠟包埋的組織標本。

7.其他類型樣本：腦脊液樣本需留取至少5 ml;膿液需留取1～2 ml;咽拭子和分泌物拭子需留取2份拭子。

推薦意見13：不同類型的臨床生物標本采集量不同。采集液體類標本應靜置,取下層沉淀物至采樣管中,裝入密封袋中送檢;對于固體標本和組織類標本,最好采集新鮮病灶處樣本立即送檢,必要時可采集石蠟包埋的組織標本進行進一步檢測。

二、生物標本的運輸和保存

標本的運輸和保存需遵循《病原微生物實驗室生物安全管理條例》[45]和《可感染人類的高致病性病原微生物菌(毒)種或樣本運輸管理規定》[46]。

1.生物標本的運輸：需申請獲得《可感染人類的高致病性病原微生物菌(毒)種或樣本準運證書》。運輸生物標本的容器或包裝材料應達到國際民航組織《危險物品安全航空運輸技術細則》規定的A類包裝標準[47],并印有衛生部門規定的生物危險標簽、標識、運輸登記表、警告用語和提示用語。運輸過程應有專人護送,護送人員不得少于2名,且需接受過相關的生物安全知識培訓。運輸前應仔細檢查容器和包裝是否符合安全要求,標簽及標本登記表是否完整無誤,運輸采取冷鏈運輸,送達后包裝的開啟須在符合生物安全規定的場所中(生物安全級別2級及以上)進行標本前處理及核酸提取。

2.生物標本的保存：收到的生物標本盡可能當天處理,完成核酸的抽提;無法當天處理的,可暫凍在―20 ℃冰箱保存,次日及時處理。對于未用完的核酸樣本或者臨床標本可長期保存于―80 ℃冰箱。根據生物樣本管理方法命名并保存樣本,以便于未來追溯。要避免標本的反復凍融,一般不得超過3次。

推薦意見14：標本的運輸和保存需遵循生物安全管理規定,符合安全要求。妥善保存未用完的核酸樣本或者臨床標本,建議根據生物樣本管理方法命名并保存樣本,以便于未來追溯。

三、樣本的核酸MALDI-TOF MS檢測

1.樣本前處理：結核病屬于乙類傳染病,生物樣本具有潛在的傳染性,在樣本處理前需采取必要的防護措施,即使是裝在具有滅活劑的管里也必須在二級生物安全實驗室中的生物安全柜中操作。對于痰液等黏性較高的生物標本,需要進行液化處理。分枝桿菌細胞壁厚且含大量脂質,需進行破壁處理,目前,樣本前處理采取的是鋯珠振蕩破碎法破碎細菌,后續流程主要有離心和過濾等步驟。實驗室應建立標準操作流程(standard operation procedure,SOP)。

2.核酸提取：實驗室必須建立完整的核酸提取流程,嚴格防控外源核酸的污染,操作人員須進行核酸提取操作的培訓,規范化操作。首先對選取的核酸提取試劑盒進行驗證,確保核酸提取的純度和濃度,對每次提取的核酸樣本進行定量純度的檢測,確保能滿足后續實驗要求,一般不得低于5 ng/μl。每批次實驗都應包括內參照、陽性對照和陰性對照,以評估每批次樣本中是否存在操作或環境帶來的污染等異常。

3.PCR反應和延伸反應：多重聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)后進行蝦堿性磷酸酶(shrimp alkaline phosphatase,SAP)反應,產物延伸后進行脫鹽處理。

4.質譜分析：采用納米分配器將以上PCR產物點在金屬板芯片上,放入飛行時間質譜儀進行檢測和分析。實驗室應安排專門的醫學人員對耐藥基因每個變異進行人工審核,后期需定期統計分析檢測效率、準確性并進行及時的優化與更新。根據最新的研究信息和我國的耐藥基因特點,進行耐藥基因和耐藥位點的補充和調整。

四、質量控制

實驗室必須建立嚴格的質量控制,嚴格評估是否存在操作或環境帶來的污染。每一步都需要進行質量檢驗,盡可能將人為污染降到最低。PCR反應之后的每一步都需要加陰性對照和陽性對照。必須定期進行室內質量控制和室間質量控制管理。

推薦意見15：樣本前處理、核酸提取、PCR反應和質譜分析,每一步都需要進行質量檢驗,PCR反應和質譜分析需要設置陰性對照和陽性對照。要定期進行室內質量控制和室間質量控制。

五、出具報告

1.出具報告要求：病原檢測報告需要符合《醫療機構臨床實驗室管理辦法》[48]和《醫學檢驗實驗室基本標準和管理規范(試行)》[49]對檢測報告的要求,列出患者信息、臨床初步診斷、標本種類及編號、檢測方法、檢測項目、檢測結果、檢測機構與報告人信息等內容。檢測報告需要有嚴格的發放和審核流程,以確保報告的及時、有效、正確和完整。

2.出具報告需要列出的參數：生物標本中提取核酸的濃度、利用定量聚合酶鏈反應(quantitative polymerase chain reaction,qPCR)法初步評估分枝桿菌在生物標本總核酸中的豐度。涉及到分枝桿菌耐藥檢測,需列出項目覆蓋的所有檢測耐藥基因的位點信息,以及相應的檢測核苷酸的結果,同義突變類型需標明,存在異質性耐藥的需標注;根據WHO的耐藥基因目錄文件,評估檢測到的突變位點可能導致的耐藥水平等級。在出具耐藥檢測結果時,應指出相應耐藥水平,以更好地指導臨床醫生用藥。

3.出具報告的內容：應用核酸MALDI-TOF MS技術檢測分枝桿菌菌種及其耐藥性完整的項目包含分枝桿菌菌種鑒定,以及分枝桿菌對一線藥物和二線藥物的耐藥基因位點的檢測。包括結核分枝桿菌復合群中的具體亞種;針對治療結核病的一線藥物(利福平、異煙肼、乙胺丁醇和吡嗪酰胺)及二線藥物(鏈霉素、對氨基水楊酸鈉、環絲氨酸、利奈唑胺、氟喹諾酮類、乙硫異煙胺、丙硫異煙胺、阿米卡星、卡那霉素、卷曲霉素、氯法齊明和貝達喹啉)耐藥基因突變檢測結果;針對治療NTM病的核心藥物(大環內酯類和氨基糖苷類)耐藥基因檢測結果;針對上述藥物的耐藥基因突變情況;附件里包含具體的檢測基因名稱、檢測位點、野生型位點核苷酸、檢測到的位點核苷酸。核酸MALDI-TOF MS技術檢測分枝桿菌的耐藥相關基因位點會根據最新研究結果并根據我國的實際情況進行不斷更新擴充,出具的報告中也會呈現相應擴充。

推薦意見16：病原檢測報告信息必須完整準確,尤其要對患者信息、檢測標本、檢測參數進行嚴格審核才能出具報告;在出具耐藥檢測結果時,應指出相應耐藥水平程度,以更好地指導臨床醫生用藥。

第六部分 臨床結果判讀

一、結核病的診斷

應用核酸MALDI-TOF MS技術檢測結核分枝桿菌復合群是實現臨床快速診斷結核病強有力的輔助工具,可提供臨床醫生早期精準診斷和治療參考。臨床醫生在診斷肺內外結核病時,須根據核酸MALDI-TOF MS檢測結果,結合患者的流行病學史、臨床表現、影像學特征、實驗室檢查等進行綜合分析做出判斷。對于陰性結果,尤其是一次呼吸道樣本結果,不能排除結核病的診斷時,可根據臨床情況和患者意愿,提供多次樣本送檢進行核酸MALDI-TOF MS檢測以提高檢出率。對于陽性結果,可進一步進行耐藥性檢測。

推薦意見17：對于呼吸道樣本,核酸MALDI-TOF MS檢測結果為結核分枝桿菌陽性者,可進一步參考《WS 288—2017肺結核診斷》[50]做出綜合判斷。對于經核酸MALDI-TOF MS檢測為陰性而臨床高度懷疑結核病者,可根據患者意愿,再次送樣本進行核酸MALDI-TOF MS檢測,以提高檢出率。

推薦意見18：對于非呼吸道標本,如腦脊液、胸腔積液、心包積液等各種體液樣本,核酸MALDI-TOF MS檢測結果為結核分枝桿菌陽性,則具有較好的臨床診斷價值,優先考慮肺外結核的可能。

推薦意見19：對于鑒定為結核分枝桿菌復合群感染的患者,進一步進行一線和二線抗結核藥物的耐藥性檢測,可實現快速診斷的目的,盡早提供精準的個體化治療方案,有利于控制結核分枝桿菌尤其是耐藥結核分枝桿菌的進一步傳播。

二、NTM病的診斷

核酸MALDI-TOF MS檢測結果為NTM陽性,還需要關注樣本類型和具體的NTM菌種。NTM在自然界中普遍存在,大部分來源于土壤和水源等環境,對容易引起污染而非致病性的NTM菌種,如嗜血分枝桿菌、產黏液分枝桿菌、不產色分枝桿菌及土分枝桿菌等,要根據臨床信息綜合評定檢測結果。雖然目前已有報道的NTM菌種及亞種近250種,臨床上與致病相關的并不是很多。我國常見的致病NTM包括胞內分枝桿菌、鳥分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌和蟾蜍分枝桿菌等。建議對致病NTM的檢測結果,在排除操作污染或環境污染可能性的前提下,出具具體菌種報告,可進一步參考2007年美國胸科學會(ATS)/美國傳染病協會(IDSA)規定的NTM肺病診斷的臨床和微生物學診斷標準[51],以及國內《非結核分枝桿菌病診斷與治療指南(2020年版)》[52]做出綜合判斷。

推薦意見20：針對痰液樣本,建議送檢2次分開采集的樣本,結果為同一種NTM菌種才能做出診斷。

推薦意見21：針對支氣管肺泡灌洗液樣本,結果為陽性即可做出診斷。不同臨床樣本所得到的結果,其臨床意義有所不同,來自血液、淋巴結、骨髓、肝臟、腎臟等非開放無菌來源的樣本檢出NTM往往意味著致病菌,而呼吸道、尿液樣本檢出的NTM,需要排除污染或定植菌的可能。

三、耐藥性診斷

應用核酸MALDI-TOF MS可檢測常用一線、二線抗結核藥物和抗NTM核心藥物的耐藥基因位點。推薦對鑒定出的結核分枝桿菌和與臨床致病密切相關的NTM菌種均需要進行進一步的耐藥基因位點的檢測,預測分析分枝桿菌的耐藥性。耐藥位點的檢出數目與生物標本中分枝桿菌的量及提取的核酸濃度密切相關,以qPCR檢測結果的循環閾值(cycle threshold,Ct)來評估。Ct值在36以上時,表明樣本中分枝桿菌量較少,耐藥相關基因突變會出現漏檢的現象,建議重新采樣送檢進行進一步檢測以提高耐藥位點檢出率。

(一)對常用抗結核藥物耐藥基因檢測結果的判讀

1.利福平：利福平耐藥突變主要集中在rpoB基因上的81 bp利福平耐藥決定區(rifampicin resistance determination region,RRDR),占臨床耐藥菌株的95%以上[53]。應用核酸MALDI-TOF MS技術能夠檢測出RRDR上的所有突變位點,以及RRDR以外的常見位點I572F[54],能較全面地預測利福平耐藥性,且與表型藥敏試驗結果和臨床耐藥診斷具有很好的一致性。同時,核酸MALDI-TOF MS檢測的結果會提示低水平耐藥還是高水平耐藥。如I572F位點引起的利福平耐藥通常是低水平耐藥,常被表型藥敏試驗檢測所遺漏[53]。

2.異煙肼：異煙肼耐藥突變主要集中在katG、inhA和oxyRC-ahpC操縱子。katG基因突變占臨床耐藥菌株的50%～70%,inhA基因突變占臨床耐藥菌株的10%～35%[55-56]。目前,應用核酸MALDI-TOF MS技術可檢測katG和inhA基因的常見突變位點,能很好地預測異煙肼耐藥,與臨床耐藥存在較高的一致性。對于異煙肼耐藥結核病,可根據檢測到的突變基因型選擇用藥,當僅檢測到inhA突變時,考慮為INH低水平耐藥,可以綜合考慮加大異煙肼劑量,而當檢測到katG突變時,考慮為INH中、高水平耐藥,建議停用異煙肼[57-58]。檢測報告中予以相應提示,供臨床醫生參考。

3.乙胺丁醇：乙胺丁醇耐藥突變主要發生于embB基因。編碼1098個氨基酸的阿拉伯糖基轉移酶,涉及到的耐藥位點包括306位密碼子ATG和406位密碼子GGC,可檢測70%以上的乙胺丁醇耐藥。臨床上,embB的306和406位點的一些突變也出現在乙胺丁醇敏感型菌株中,這可能是臨床表型藥敏試驗檢測結果存在不穩定性、可重復性差所導致的[59-60]。WHO不推薦乙胺丁醇進行表型藥敏試驗檢測[61]。

4.吡嗪酰胺：吡嗪酰胺耐藥突變主要集中在pncA基因,占臨床耐藥菌株的72%～98%。吡嗪酰胺的耐藥位點較為特殊,幾乎平均分布于pncA整個基因上,pncA全長561 bp,有60多個突變位點,耐藥類型多樣,包括突變(約43個)、插入(約7個)和缺失(約12個),有些位點已被證實與耐藥無關[62]。臨床表型藥敏試驗存在可重復性差的問題。研究發現,pncA57CAC和pncA啟動子區域A-11G 是較為常見的耐藥突變位點[42]。如果核酸MALDI-TOF MS檢測到突變,提示該菌株很可能存在吡嗪酰胺耐藥;如果沒有檢測到突變,可結合臨床治療效果綜合判定,也可進一步對pncA基因進行基因測序加以確認。

5.氟喹諾酮類藥物：氟喹諾酮類耐藥突變主要集中在gyrA和gyrB基因。應用核酸MALDI-TOF MS可檢測gyrA基因絕大多數耐藥位點,以及gyrB基因上的常見耐藥位點,能很好地預測氟喹諾酮類耐藥,與臨床表型耐藥具有較高的一致性。若檢測到gyrAA90V突變,大劑量的莫西沙星仍有一定的殺菌活性[63]。根據人群藥代動力學模型提示,引起低水平耐藥的基因突變菌株,如gyrAA90V突變,加大莫西沙星劑量仍可以發揮治療效果,但是加大左氧氟沙星和氧氟沙星劑量無效;而引起高水平耐藥的基因突變菌株,如gyrA的G88C、D94N和D94G突變,加大任意一種氟喹諾酮類藥物均無效[64]。檢測報告中可提示“供臨床醫生參考”。

6.乙硫異煙胺/丙硫異煙胺：乙硫異煙胺/丙硫異煙胺的耐藥突變主要集中在inhA啟動子區域和ethA基因。inhA基因啟動子區域,涉及到的位點同異煙肼;ethA基因耐藥位點散在分布[65]。研究表明,如果設計增加ethA基因,雖然可增加乙硫異煙胺/丙硫異煙胺的耐藥檢測敏感度,但特異度下降[66]。另外,乙硫異煙胺/丙硫異煙胺的表型藥敏試驗檢測缺乏充分的可重復性,與基因型藥敏試驗結果一致性較差,故目前核酸MALDI-TOF MS技術并未用于檢測ethA基因的耐藥位點。如果MALDI-TOF MS檢測到inhA啟動子突變,提示該菌株很可能存在耐藥,而且乙硫異煙胺/丙硫異煙胺的耐藥水平高[42];而表型藥敏試驗檢測結果若為敏感,可結合病原學檢查綜合判讀,也可考慮重復實驗或用其他方法檢測。

7.貝達喹啉/氯法齊明：這兩種藥物的耐藥突變主要發生于mmpR(Rv0678),該基因突變往往導致結核分枝桿菌對貝達喹啉和氯法齊明的外排增多,導致氯法齊明耐藥和貝達喹啉部分耐藥。貝達喹啉在耐藥結核病中的耐藥率較低,根據已有報道,在1.0%～7.16%之間[43, 67-68],其耐藥機制復雜,涉及幾個基因(mmpR、atpE、pepQ和Rv1979)的多種突變,臨床最為流行的是mmpR基因突變,atpE突變只占小部分。來自重慶的一項研究顯示,貝達喹啉耐藥菌株只發現mmpR突變,其余的耐藥菌株未找到相關已知基因的突變[68],因此存在其他機制導致貝達喹啉耐藥,預測耐藥效果不佳。氯法齊明在耐藥結核病中的耐藥率約為6.65%[43],耐藥相關基因有mmpR、Rv1979c、Rv2535c和Rv1453,其中mmpR突變是導致氯法齊明耐藥的主要機制[69],同樣存在未鑒定的機制導致氯法齊明耐藥,預測耐藥效果不佳。目前,應用核酸MALDI-TOF MS檢測mmpR(Rv0678)基因193G和466C位點突變與臨床耐藥高度一致。其中,貝達喹啉作為耐藥結核病治療方案中的A組藥物,建議對耐藥結核病患者盡早進行貝達喹啉的耐藥性檢測,若為敏感,應盡早使用貝達喹啉,可減少利福平耐藥結核病/耐多藥結核病的相關死亡和治療失敗率[70]。氯法齊明作為耐藥結核病治療方案中的B組藥物,建議在決定使用該藥治療之前進行藥敏檢測以防止用藥不當產生的不良反應[71]。

8.利奈唑胺：利奈唑胺耐藥突變主要發生在rplC,應用核酸MALDI-TOF MS可檢測常見突變位點,與臨床耐藥高度一致。利奈唑胺在耐多藥結核病中的耐藥率約為3.84%[43]。如果發生rplC基因突變,MIC通常增加4～32倍。若檢測到突變,提示該菌對利奈唑胺極大可能是耐藥的,與治療失敗相關,目前可預測約75%的表型耐藥臨床株[72]。對于耐藥結核病,尤其是準廣泛耐藥結核病(pre-extensive drug-resistant tuberculosis,Pre-XDR-TB)患者,接受利奈唑胺治療的效果比未接受利奈唑胺治療的效果好[73]。

9.環絲氨酸：目前對于環絲氨酸的臨床臨界濃度沒有統一的標準。我國研究者通過對100多例患者的臨床菌株進行最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentrations,MIC)分析和全基因組測序分析相關耐藥基因突變,提出BACTEC MGIT 960體系中的流行病學臨界濃度為16 mg/L[74]。大部分環絲氨酸耐藥的臨床菌株集中在alr和ald基因。WHO的耐藥突變基因目錄中尚未納入環絲氨酸的耐藥基因,同時WHO也不推薦對環絲氨酸進行常規表型藥敏試驗檢測。目前,應用核酸MALDI-TOF MS檢測alr和ald基因上的常見耐藥位點用于預測環絲氨酸耐藥性,會存在一部分漏檢。若檢測到突變,提示該菌株對環絲氨酸耐藥的可能性極大。

10.對氨基水楊酸鈉：對氨基水楊酸鈉耐藥突變主要發生在folC和thyA,臨床上以folC占多數。WHO的耐藥突變基因目錄中尚未納入對氨基水楊酸鈉的耐藥基因,同時也不推薦對其進行常規表型藥敏試驗檢測。目前,根據我國研究者發表的臨床數據[75-76],應用核酸MALDI-TOF MS檢測folC和thyA兩個基因的常見突變位點用于預測對氨基水楊酸鈉的耐藥性,會存在一部分漏檢。若檢測到突變,提示該菌株對對氨基水楊酸鈉耐藥的可能性極大。

11.注射類藥物(鏈霉素、卡那霉素、阿米卡星、卷曲霉素)：鏈霉素耐藥突變主要集中在rpsL基因,占臨床耐藥菌株的80%;還有少數突變發生于rrs基因。目前,應用核酸MALDI-TOF MS檢測rpsL43位和88位密碼子,與臨床耐藥性有很好的一致性,若檢測到突變,則提示該菌很可能對鏈霉素高水平耐藥[42];阿米卡星耐藥突變主要集中在rrs基因,占臨床耐藥菌株的85%以上,通過核酸MALDI-TOF MS檢測rrs的兩個位點(1401、1484),與臨床耐藥的一致性高;卡那霉素耐藥突變主要集中在rrs和eis啟動子區域,通過核酸MALDI-TOF MS檢測rrs的3個位點(1401、1402、1484)和eis啟動子區位點與臨床耐藥高度一致;卷曲霉素耐藥突變也主要是rrs,通過核酸MALDI-TOF MS檢測rrs的3個位點(1401、1402、1484)與臨床耐藥高度一致,若檢測到突變,則提示該菌很可能對卷曲霉素耐藥。

推薦意見22：對于確定的結核分枝桿菌感染者,建議送核酸MALDI-TOF MS檢測上述幾種常見藥物的耐藥性,以提供快速而全面的預測判斷,盡早給予個體化精準治療。其中,一線抗結核藥物利福平和異煙肼的耐藥基因突變檢測可很好地預測耐藥性。其他大部分藥物也可檢出絕大部分臨床常見耐藥突變類型,可以較好地預測耐藥性。

推薦意見23：對于強烈懷疑對吡嗪酰胺耐藥的菌株,不推薦送核酸MALDI-TOF MS檢測,必要時可以對整個pncA基因進行測序分析。

推薦意見24：對于懷疑對氟喹諾酮類藥物耐藥的菌株,可以送核酸MALDI-TOF MS檢測,若檢出耐藥基因突變,很可能該菌株對氟喹諾酮類藥物耐藥;如果未檢測到突變,也不能排除耐藥的可能性。

(二)對于部分抗NTM藥物的耐藥基因與耐藥位點結果判讀

1.大環內酯類藥物(克拉霉素和阿奇霉素)：NTM對這類藥物的耐藥突變主要集中在rrl和erm兩個基因,通過核酸MALDI-TOF MS檢測rrl2058位和2059位堿基突變[77-78]與臨床耐藥高度一致。而膿腫分枝桿菌和博萊分枝桿菌存在誘導型耐藥的現象[79],與erm(41)編碼的甲基轉移酶相關,野生型erm(41)可誘導這兩種NTM對大環內酯類藥物產生耐藥,當erm(41)的28T突變為28C時,這種誘導功能將不復存在,使得這兩種NTM對大環內酯類敏感。目前,通過核酸MALDI-TOF MS檢測這個位點,可以預測膿腫分枝桿菌和博萊分枝桿菌對大環內酯類的誘導型耐藥。若檢測到rrl突變,對于鳥分枝桿菌復合群感染疾病具有重要意義,可指導治療。

2.氨基糖苷類(阿米卡星、卡那霉素和慶大霉素)：NTM對這類藥物的耐藥突變主要集中在rrs基因,目前,應用核酸MALDI-TOF MS檢測rrs1406、1408和1409位堿基突變與臨床耐藥高度一致[80]。若未檢測到突變,提示這些藥物可以治療大環內酯類耐藥的鳥分枝桿菌復合群肺病,建議使用吸入式阿米卡星治療嚴重或對大環內酯類耐藥的鳥分枝桿菌復合群肺病。

推薦意見25：對于檢測出鳥分枝桿菌、胞內分枝桿菌、膿腫分枝桿菌各亞種、堪薩斯分枝桿菌、蟾蜍分枝桿菌等跟臨床疾病密切相關的NTM,建議送核酸MALDI-TOF MS檢測大環內酯類和氨基糖苷類藥物的耐藥性。

推薦意見26：對于檢測出弱致病性的與臨床疾病不相關的NTM,可根據臨床癥狀和影像學表現決定是否送核酸MALDI-TOF MS檢測其耐藥性。

(三)對于異質性耐藥、同義突變的檢測結果判讀

異質性耐藥現象是一個不容忽視的問題。傳統意義上,異質性耐藥是指同一份樣本中耐藥型菌株和敏感型菌株共存的現象。通過傳統的基于培養的稀釋法可檢測出1%的耐藥菌株(吡嗪酰胺除外,為10%),是目前檢測異質性耐藥較為敏感的方法。隨著分子診斷技術的開發引進及廣泛應用,異質性耐藥從基因型角度有了更新的定義,是指同一份樣本中野生型和各種耐藥型基因序列共存的現象[81]。越來越多的研究報道了結核病患者樣本中的結核分枝桿菌存在異質性耐藥的現象[82-86],這往往會導致基因型檢測結果和表型檢測結果不一致,準確診斷不及時,錯誤用藥,甚至更多耐藥菌株的產生及流行。核酸MALDI-TOF MS技術對異質性耐藥具有較高的敏感度,能檢測出1%的耐藥菌[87]。

同義突變是指基因突變并未引起編碼的氨基酸改變,不導致耐藥的情況。傳統分子檢測方法中同義突變的錯誤判讀會導致耐藥假陽性的診斷,而核酸MALDI-TOF MS檢測會在報告中指出該突變為同義突變(表3),可能不會導致耐藥。例如rpoB基因513位密碼子CAA突變為CAG,突變型密碼子所編碼氨基酸與野生型相同,利福平作用的靶蛋白未改變,為同義突變,不產生耐藥;如gyrA基因90位密碼子GCG突變為GCA,編碼的氨基酸與野生型相同,均為丙氨酸,為同義突變,仍可使用氟喹諾酮類藥物進行治療。

推薦意見27：核酸MALDI-TOF MS檢測可發現異質性耐藥和同義突變,應結合臨床治療效果及時調整藥物,優化治療方案,提高診治水平。

第七部分 總結

目前,核酸MALDI-TOF MS技術在結核病和NTM病診斷中應用的相關文獻較少。隨著核酸MALDI-TOF MS技術的持續更新優化、臨床應用經驗的不斷積累及臨床數據的不斷增加,核酸MALDI-TOF MS技術對各類結核病和NTM病的診斷及耐藥性的診斷價值將會逐漸被認識,本共識中的觀點也將會不斷完善。隨著對分枝桿菌,尤其是結核分枝桿菌耐藥基因及位點的不斷深入研究,核酸MALDI-TOF MS檢測也會不斷增加新的耐藥基因和耐藥位點。希望本共識能幫助臨床醫生科學合理地應用核酸MALDI-TOF MS技術,提高結核病和NTM病的診斷、鑒別診斷及其耐藥性的診斷水平。

執筆者梁建琴 吳雪瓊 安慧茹

專家組成員(排名不分先后) 吳雪瓊、梁建琴、安慧茹、王濤、陳志、梁艷、杜經麗、王仲元、袁小東、曹兵生、何建苗、俞珊、李志明、陳文、王鳳華(中國人民解放軍總醫院第八醫學中心);王黎霞、李敬文、范永德、郭萌(《中國防癆雜志》期刊社);成詩明(中國防癆協會);趙雁林、周林(中國疾病預防控制中心結核病預防控制中心);初乃惠、黃海榮、逄宇(首都醫科大學附屬北京胸科醫院/北京市結核病胸部腫瘤研究所);陳效友(首都醫科大學附屬北京地壇醫院);范琳、沙巍、余方友(同濟大學附屬上海市肺科醫院);張俠(南京中醫藥大學附屬南京醫院/南京市第二醫院);陳曉紅(福建省福州肺科醫院);賀建清(四川大學華西醫院);吳桂輝(成都市公共衛生臨床醫療中心);譚耀駒(廣州市胸科醫院);鈕曉紅(南京市中西醫結合醫院);蔡青山、楊高怡(浙江省結核病診療中心/浙江省中西醫結合醫院/杭州市紅十字會醫院/浙江大學醫學院附屬杭州市胸科醫院);劉忠達、張尊敬、郭凈(浙江中醫藥大學附屬麗水中醫院);汪峰(華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院);王春花(天津市結核病控制中心);鹿振輝(上海中醫藥大學附屬龍華醫院)

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