微卡與維生素D聯(lián)合應(yīng)用對初治涂陽肺結(jié)核CD4+ T細(xì)胞亞群平衡的影響

尚耀民 周曉蕾 薛運玲 冷霞

肺結(jié)核(pulmonary tuberculosis,PTB)進(jìn)展機制復(fù)雜且目前尚無明確定論。近年來,有研究指出PTB的發(fā)生發(fā)展與CD4+T細(xì)胞亞群輔助性 T細(xì)胞1(Th1)與Th2(Th1/Th2)比值、Th17與調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞(Treg)比值(Th17/Treg)的動態(tài)失衡密切相關(guān)[1-2]。注射用母牛分枝桿菌菌苗(微卡)是目前世界衛(wèi)生組織在結(jié)核病研究與發(fā)展戰(zhàn)略規(guī)劃中推薦使用的免疫調(diào)節(jié)制劑,輔助治療初治涂陰PTB的臨床療效顯著,且不良反應(yīng)發(fā)生率低[3],其聯(lián)合用藥可明顯增強PTB患者的免疫功能和治療效果[4]。臨床資料顯示,50%以上的PTB患者血清25-(OH)D3(維生素D)含量明顯低于健康人群,血清維生素D水平與外周血CD4+T細(xì)胞和CD4+/CD8+T細(xì)胞水平均呈正相關(guān),可通過調(diào)節(jié)PTB患者體內(nèi)免疫反應(yīng)增強 T細(xì)胞對結(jié)核分枝桿菌的殺滅能力[5],因此,維生素D缺乏可增加結(jié)核分枝桿菌感染風(fēng)險,補充維生素D可有效防治PTB[6]。基于以上研究,猜測微卡聯(lián)合維生素D輔助治療可能在增強PTB患者免疫功能和提高臨床療效上效果顯著,但目前關(guān)于二者聯(lián)合輔助治療PTB的研究報道還比較少見,尚缺乏相關(guān)研究證實。因此,本研究初步探討二者聯(lián)合應(yīng)用對PTB患者CD4+T細(xì)胞亞群動態(tài)平衡的影響,并分析其臨床療效,以期為PTB臨床療效的提高提供參考依據(jù)。

對象和方法

一、研究對象

1.研究對象遴選：采用前瞻性研究方法,于2019年6月至2022年6月,參照入組標(biāo)準(zhǔn)及患者意愿將河南省胸科醫(yī)院收治的初治涂陽PTB患者分別納入常規(guī)抗結(jié)核治療組(對照組)、常規(guī)抗結(jié)核+微卡治療組(微卡組)和常規(guī)抗結(jié)核+微卡+維生素D輔助治療組(聯(lián)合組),至每組100例時截止納入。排除中途因各種原因退出或脫落而不能完成6個月治療方案者,最終以最低入組74例為3組納入患者數(shù)[共計222例(PTB組)],并進(jìn)行統(tǒng)計分析。3組患者性別、年齡及體質(zhì)量指數(shù)(BMI)等基線資料的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(表1),具有可比性。另按222例患者的性別、年齡及BMI等人口學(xué)特征以1∶1匹配從本院體檢中心數(shù)據(jù)庫選取同期222名健康體檢者相關(guān)臨床資料(健康組),其中,男性117名,女性105名;平均年齡為(41.54±3.07)歲,BMI為21.35±1.38;吸煙81名,飲酒141名。本研究經(jīng)河南省胸科醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)(審批號：2020-07-025),且所有研究對象均簽署知情同意書。

2.PTB患者入組標(biāo)準(zhǔn)：(1)納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡≥18歲;②符合中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《WS 288—2017肺結(jié)核診斷》中PTB的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[7];③首次確診為PTB;④自愿參與本研究,臨床資料完整;⑤均完成6個月的治療;⑥所有患者均進(jìn)行了初始維生素D和血鈣濃度的檢測。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：①近3個月內(nèi)有糖皮質(zhì)激素、免疫類制劑或維生素類藥物用藥史;②妊娠或哺乳期婦女;③對微卡、維生素D或抗結(jié)核藥物過敏,有免疫相關(guān)疾病者,以及合并心、肝、腎等疾病引起呼吸系統(tǒng)功能不全者;④重癥PTB,如血行播散性PTB、結(jié)核空洞≥2個;合并干酪性肺炎及其他肺外結(jié)核等;⑤中途因各種原因退出或脫落而不能按治療方案完成6個月治療者。

表1 不同組別抗結(jié)核治療初治涂陽肺結(jié)核患者基本特征比較

二、研究方法

1.治療方法：(1)對照組：采用常規(guī)抗結(jié)核治療方案,給予患者異煙肼(廣東華南藥業(yè)集團(tuán)有限公司,批號：201201;0.3 g/d)+利福平(沈陽紅旗制藥有限公司,批號：C2521131;0.6 g/d)+吡嗪酰胺(沈陽紅旗制藥有限公司,批號：D0421151;1.5 g/d)+乙胺丁醇(廣東華南藥業(yè)集團(tuán)有限公司,批號：210301;0.75 g/d)頓服,每次用藥均在同一時間點服用。(2)微卡組：在常規(guī)抗結(jié)核治療的基礎(chǔ)上增加微卡治療,臀部肌肉深部注射微卡22.5 μg(安徽智飛龍科馬生物制藥有限公司,批號：111438)。強化期(2個月)2 次/周,兩次用藥間隔至少72 h;鞏固期(4個月)1次/周。(3)聯(lián)合組：在微卡組治療的基礎(chǔ)上再聯(lián)用維生素D制劑。強化期(2個月)口服維生素D阿法骨化醇滴劑(南通華山藥業(yè)有限公司,批號：201225),首劑量0.25 μg/d,并每2周測定1次血鈣濃度,根據(jù)血鈣濃度檢測結(jié)果增減劑量,當(dāng)血鈣含量<1/2正常下限值時補充劑量為0.5 μg/d;當(dāng)血鈣含量≥1/2正常下限值時補充劑量為0.25 μg/d。所有患者治療開始前均采用邁瑞B(yǎng)C-10 全自動血液生化分析儀檢查血鈣和維生素D水平,均低于正常參考值(血鈣：2.08～2.60 mmol/L;維生素D：26～65 ng/L),在治療強化期內(nèi)血鈣濃度連續(xù)2次檢測正常者視為退出血鈣監(jiān)測。鞏固期(4個月)口服維生素D3滴劑,400 IU/d,并每天戶外活動不少于2 h。治療期間未見明顯微卡及維生素D相關(guān)不良反應(yīng)。

2.觀察指標(biāo)：(1)臨床指標(biāo)：隨訪跟蹤患者治療前和治療后6個月內(nèi)的臨床癥狀(咳嗽、咯血、咳痰、盜汗、胸痛及疲乏等)、細(xì)菌學(xué)及影像學(xué)檢查情況(包括胸部X線攝影和CT掃描)。(2)實驗室指標(biāo)：采集所有健康組(治療前)和PTB組(治療前及治療后6個月)研究對象清晨空腹靜脈血5 ml。取2 ml肝素抗凝處理,按照人單核細(xì)胞分離試劑盒(武漢艾美捷科技有限公司)說明書分離單核細(xì)胞,并制成單個核細(xì)胞重懸液(1×106/ml),分別依次加入CD4、CD25、Foxp3熒光抗體室溫孵育40 min,再加入γ-干擾素(IFN-γ)、白細(xì)胞介素-4(IL-4)、IL-17抗體(英國abcam公司),避光孵育50 min,磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗,加染色緩沖液,上流式細(xì)胞儀檢測IFN-γ+CD4+T細(xì)胞(Th1)、IL-4+CD4+T細(xì)胞(Th2)、IL-17+CD4+T細(xì)胞(Th17)及CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞(Treg)含量,采用Kaluza分析流式數(shù)據(jù)。剩余3 ml血液樣本不抗凝處理,室溫靜置40 min,3000 r/min(離心半徑為7.5 cm) 離心15 min,收集血清,采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測血清中IFN-γ、IL-4、IL-17、IL-10水平,嚴(yán)格按照ELISA試劑盒(英國abcam公司)說明書操作。采用紫外分光光度計(上海譜元儀器有限公司)測定波長450 nm處的吸光度值(A450值),并計算各細(xì)胞因子水平。

3.療效評定[8-9]：根據(jù)臨床癥狀、細(xì)菌學(xué)檢查以及影像學(xué)檢查綜合評定患者療效。(1)痊愈：咳嗽、咳痰、盜汗等臨床癥狀完全消失,連續(xù)6個月痰涂片陰性,CT掃描示肺部空洞閉合,肺部病變無活動性;(2)顯效：臨床癥狀消失,連續(xù)3個月痰涂片陰性,CT掃描示肺部空洞閉合或縮小,病灶吸收;(3)有效：臨床癥狀改善,CT掃描示肺空洞縮小或無明顯變化,病灶有明顯吸收;(4)無效：臨床癥狀無明顯變化甚至惡化,痰涂片轉(zhuǎn)陽,或CT掃描示肺部空洞增大或出現(xiàn)新空洞,或病灶吸收不變、惡化。其中,總有效=痊愈+顯效+有效。肺部空洞情況評價包括閉合(疤痕愈合、阻塞愈合或消失)、縮小(平均直徑縮小≥1/2)、不變(平均直徑縮小<1/2)和增大(平均直徑增大)。病灶吸收評價包括吸收(病灶吸收≥1/2)、明顯吸收(病灶吸收≥1/3且<1/2)、不變(病灶吸收<1/3)和惡化(病灶增大或新增病灶)。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

一、治療前PTB患者與健康體檢者外周血Th1/Th2、Th17/Treg及相關(guān)細(xì)胞因子水平檢測情況

與健康組比較,PTB組Th1/Th2和Th17/Treg比值及IFN-γ水平均明顯降低,但I(xiàn)L-4、IL-17和IL-10水平均明顯升高,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義,見表2。

二、不同治療方案對PTB患者Th1/Th2和Th17/Treg平衡體系的影響

治療前,PTB患者不同組別外周血Th1/Th2、Th17/Treg比值及IFN-γ、IL-4、IL-17、IL-10水平的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。治療后6個月,PTB患者不同組別較治療前外周血Th1/Th2、Th17/Treg比值和IFN-γ水平均明顯升高,IL-4、IL-17及IL-10水平均明顯降低,且以對照組、微卡組及聯(lián)合組的次序依次升高或降低,兩組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。具體見表3、4。

表2 不同組別研究對象Th1/Th2和Th17/Treg體系及相關(guān)各細(xì)胞因子水平檢測情況

表3 不同組別初治涂陽肺結(jié)核患者治療前與治療6個月后Th1/Th2體系細(xì)胞因子的比較

表4 不同組別初治涂陽肺結(jié)核患者治療前與治療6個月后Th17/Treg體系細(xì)胞因子的比較

三、不同治療方案對PTB患者痰涂片陰轉(zhuǎn)率的影響

治療3、6個月后,PTB患者不同組別痰涂片陰轉(zhuǎn)率的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=11.446,P=0.003;χ2=12.025,P=0.002)。其中,聯(lián)合組治療3、6個月痰涂片陰轉(zhuǎn)率均明顯高于微卡組和對照組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義;但微卡組和對照組比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(表5)。

四、不同治療方案對初治涂陽PTB患者肺部病灶和空洞的改善效果分析

治療6個月后,PTB患者不同組別肺部病灶吸收和肺空洞改善情況的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=12.827,P=0.046;χ2=21.149,P=0.002),但聯(lián)合組肺部病灶吸收率和空洞閉合率與微卡組比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(表6)。

表5 不同組別初治涂陽肺結(jié)核患者治療3、6個月后的痰涂片陰轉(zhuǎn)情況

表6 不同組別初治涂陽肺結(jié)核患者治療6個月后肺部病灶和空洞改善情況

表7 不同組別初治涂陽肺結(jié)核患者治療6個月后的療效分析

五、不同治療方案對初治涂陽PTB患者的療效分析

治療6個月后,PTB患者不同組別綜合療效和總有效率的比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(H=12.047,P=0.002;χ2=6.541,P=0.038)。其中,聯(lián)合組痊愈、顯效的比例均高于微卡組和對照組(表7)。

討 論

Th1、Th2、Th17和Treg是重要的CD4+T細(xì)胞亞群,通過分泌多種細(xì)胞因子參與機體防御、免疫及感染性疾病的病理過程[10]。研究認(rèn)為,PTB的發(fā)生發(fā)展與Th1/Th2、Th17/Treg的平衡有關(guān),相關(guān)細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-17在結(jié)核分枝桿菌感染后異常改變,水平高低與PTB嚴(yán)重程度也密切相關(guān)[11-13]。本研究結(jié)果顯示,初治涂陽PTB患者的Th1/Th2、Th17/Treg比值及IFN-γ水平均明顯低于健康人,IL-4、IL-17、IL-10水平均明顯高于健康人,與既往研究結(jié)果[14-15]一致。因此,恢復(fù)PTB患者Th1/Th2、Th17/Treg平衡,改善相關(guān)細(xì)胞因子的分泌水平,提高PTB患者免疫功能,對PTB的防治具有十分重要的意義。

微卡作為結(jié)核病研究與發(fā)展戰(zhàn)略規(guī)劃中推薦使用的雙向免疫調(diào)節(jié)制劑,可明顯促進(jìn)T細(xì)胞轉(zhuǎn)化、增殖及釋放淋巴因子,抑制結(jié)核分枝桿菌感染所引起的變態(tài)反應(yīng),改善機體病理性損傷[3]。早期微卡多用于PTB的預(yù)防,近年來微卡逐步被用于PTB的輔助治療中,但關(guān)于其療效的相關(guān)研究報道較少見。研究顯示,微卡輔助治療可有效縮短涂陰PTB的治療周期[16],明顯提高初治藥物敏感PTB患者病灶的吸收率,在復(fù)治結(jié)核病和多耐藥結(jié)核病中也顯示出一定的療效及安全性,如微卡輔助治療提高了復(fù)治涂陽PTB和多耐藥PTB患者的痰涂片陰轉(zhuǎn)率、空洞閉合率和病灶吸收率,有效改善了患者免疫功能,并降低其1年復(fù)發(fā)率[17-19]。但對初治涂陽PTB患者免疫力及療效的作用效果目前尚不夠明確。本研究發(fā)現(xiàn),與常規(guī)抗結(jié)核治療相比,初治涂陽PTB患者微卡輔助治療后Th1/Th2、Treg/Th17平衡明顯恢復(fù),IFN-γ水平回升,IL-4、IL-17、IL-10水平依次回降;治療3、6個月的痰涂片陰轉(zhuǎn)率均明顯提高,病灶愈合和治療總有效率均有所改善,但與對照組比較無明顯差異,僅肺部空洞改善情況有差異,臨床效果并不理想。這提示單獨的微卡輔助治療對初治涂陽PTB患者自身免疫功能的改善效果顯著,但臨床療效并不明顯。

回顧現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn),在常規(guī)抗結(jié)核治療的基礎(chǔ)上聯(lián)合微卡治療更有利于提高臨床療效。崔丹等[4]研究顯示,與微卡聯(lián)合常規(guī)抗結(jié)核治療相比,常規(guī)抗結(jié)核治療聯(lián)用微卡和利奈唑胺可明顯促進(jìn)多耐藥結(jié)核病患者的病灶愈合,有效改善痰菌陰轉(zhuǎn)率,綜合療效確切,同時可有效提高患者T細(xì)胞亞群CD4+水平和CD4/CD8比值,增強了患者免疫功能;程建強[20]的研究顯示,在常規(guī)抗結(jié)核治療的基礎(chǔ)上使用微卡和沙參麥冬湯治療PTB療效確切,與常規(guī)抗結(jié)核治療組相比,可明顯改善患者病灶吸收情況,提高2、6個月末的痰涂片陰轉(zhuǎn)率,降低抗結(jié)核藥物的不良反應(yīng)發(fā)生率。但在常規(guī)抗結(jié)核治療的基礎(chǔ)上,使用微卡聯(lián)合其他藥物輔助治療的相關(guān)研究還較少,其安全、高效的聯(lián)合方案仍需進(jìn)一步探討。

維生素D具有多種免疫活性,一定程度上影響免疫平衡系統(tǒng),增強機體免疫功能[21-22]。流行病學(xué)及臨床研究顯示,PTB患者常存在維生素D缺乏或不足現(xiàn)象,較健康人明顯降低[23],這可能是結(jié)核分枝桿菌導(dǎo)致維生素D代謝紊亂所致,也可能是抗結(jié)核藥物引起血清維生素D水平下降,如異煙肼通過抑制維生素D分子結(jié)構(gòu)中的羥基導(dǎo)致25(OH)D3減少,利福平通過酶的誘導(dǎo)促進(jìn)25(OH)D3轉(zhuǎn)化為無活性代謝物;還可能與患者飲食結(jié)構(gòu)的改變及紫外線照射的減少有關(guān)[24]。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為,血清維生素D的缺乏可使維生素D介導(dǎo)的抵御結(jié)核分枝桿菌的免疫作用和機體消滅結(jié)核分枝桿菌的能力降低,是PTB發(fā)病的高危因素,也是PTB治療效果不佳的的重要原因之一[25-28]。因此,補充維生素D有助于提高自身免疫力,促使T細(xì)胞平衡恢復(fù),抑制炎癥反應(yīng),明顯提高痰涂片陰轉(zhuǎn)率,改善臨床癥狀及肺部病變程度[29-30];也有研究發(fā)現(xiàn),維生素D輔助治療可明顯改善兒童PTB臨床癥狀及肺部病變程度,提高患兒自身免疫能力[31];因此,提高外周血中維生素D的含量有助于PTB好轉(zhuǎn),但既往研究多集中于維生素D對常規(guī)抗結(jié)核治療方案的增效作用,很少見與其他藥物再聯(lián)合治療抗結(jié)核的效果研究。

本研究明確了單獨的微卡輔助抗結(jié)核治療對初治涂陽PTB患者自身免疫功能的改善效果顯著,但臨床療效改善并不明顯。因此,本研究在此治療基礎(chǔ)上,進(jìn)一步對聯(lián)合維生素D的PTB患者自身免疫功能及臨床療效進(jìn)行了探討,結(jié)果顯示,微卡與維生素D聯(lián)合使用后患者外周血Th1/Th2、Treg/Th17平衡及細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4、IL-17、IL-10水平恢復(fù)幅度均明顯高于對照組和微卡組;治療后6個月的痰涂片陰轉(zhuǎn)率、綜合療效和總有效率均優(yōu)于微卡組和對照組。分析其原因可能是：一方面,微卡含有與結(jié)核分枝桿菌相似的抗原,能夠促進(jìn)T細(xì)胞的增殖以改善細(xì)胞免疫功能,抑制病原菌引起的變態(tài)反應(yīng),改善自身免疫力,阻止結(jié)核病進(jìn)展;另一方面,體外補充維生素D能有效治療由于維生素D缺乏所致的先天性免疫和適應(yīng)性免疫功能的損害,減輕抗結(jié)核藥物不良反應(yīng)并增強其療效[32]。值得注意的是,聯(lián)合組患者的肺部病灶和空洞改善情況均優(yōu)于對照組,但與微卡組的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義,這可能與研究對象單一、患者例數(shù)較少有關(guān),后續(xù)需擴大樣本量進(jìn)一步探究。以上提示常規(guī)抗結(jié)核聯(lián)合微卡和維生素D輔助治療方案療效確切,并可有效改善PTB患者體內(nèi)CD4+T細(xì)胞Th1/Th2、Th17/Treg平衡及相關(guān)細(xì)胞因子水平,提高患者自身免疫力,發(fā)揮抗結(jié)核增效作用。本研究也存在以下局限：一是本研究納入患者僅為初治涂陽患者,結(jié)論的適用性受到一定限制;二是本研究僅選取了較重要的4種細(xì)胞因子進(jìn)行分析,屬于初步探討,其全面性可能尚缺。因此,后續(xù)工作中還需納入不同類型PTB、擴大樣本、檢測更多Th1/Th2、Th17/Treg平衡體系相關(guān)細(xì)胞因子做進(jìn)一步全面研究。

綜上所述,常規(guī)抗結(jié)核聯(lián)合微卡和維生素D輔助治療可促進(jìn)患者CD4+T細(xì)胞亞群Th1/Th2、Th17/Treg平衡恢復(fù),有效改善IFN-γ、IL-4、IL-17和IL-10細(xì)胞因子水平,臨床療效顯著。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)尚耀民：設(shè)計試驗方案,收集、匯總、核實并分析所有病例資料及數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果、撰寫文章;周曉蕾：輔助設(shè)計試驗方案,收集、復(fù)查病例資料,審閱文章;薛運玲：收集病例資料,并對痰涂片、病灶及肺空洞資料進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析;冷霞：收集病例實驗室檢驗指標(biāo),統(tǒng)計分析治療6個月療效