熒光PCR探針熔解曲線技術檢測痰標本結核分枝桿菌利福平耐藥性的研究

王嫩寒 田麗麗 陳雙雙 趙琰楓 樊瑞芳 陳昊 任怡宣 張潔 易俊莉 楊新宇 于蘭 丁北川 李傳友 代小偉

據世界衛生組織估算,2021年我國耐多藥結核病(multidrug-resistant tuberculosis,MDR-TB)/利福平耐藥結核病(rifampicin-resistant tuberculosis,RR-TB)發病數為33 000例;而實驗室確診的MDR/RR-TB患者數僅為16 826例,治療成功率僅為53%[1],耐藥結核病疫情形勢嚴峻。利福平是一種廣譜抗生素,作為一線抗結核藥物,其耐藥性備受關注。患者感染的結核分枝桿菌是否對利福平耐藥,決定了不同的臨床治療方案[2]。傳統的藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)建立在患者標本培養陽性的基礎上,此種方法耗時長,易延誤治療。近年來,快速分子耐藥篩查技術發展迅速,如GeneXpert MTB/RIF,能直接檢測患者標本,及時獲得利福平耐藥檢測結果,為患者制定個體化治療方案贏取寶貴時間。但該技術的儀器耗材均為進口,影響其推廣應用。本研究應用我國自主研發的熒光PCR探針熔解曲線(fluorescence polymerase chain reaction probe melting curve,MeltPro)技術對痰標本直接進行結核分枝桿菌利福平耐藥性檢測,以評價該方法的應用價值。

資料和方法

一、資料來源

收集2021年5月至2022年5月在北京市疾病預防控制中心結核病門診就診的初治肺結核患者痰標本。納入標準：(1)GeneXpert MTB/RIF檢測結果為陽性;(2)痰液標本量>3 ml。對收集到的痰標本進行涂片鏡檢及分枝桿菌分離培養,培養陽性菌株進行利福平比例法藥敏檢測;采用GeneXpert MTB/RIF方法和MeltPro技術對痰標本直接進行結核分枝桿菌利福平耐藥性檢測。

二、儀器和試劑

萋-尼抗酸桿菌染色液由珠海貝索生物技術有限公司生產,酸性羅氏培養基、中性羅氏培養基及含藥培養基均由河南賽諾特生物技術有限公司生產,細菌超聲分散計數儀BAC spreader 1100C由廣東希格生物科技有限公司提供,使用廈門致善生物科技股份有限公司生產的結核分枝桿菌利福平耐藥突變檢測試劑盒(熒光PCR熔解曲線法),以及SLAN-96S Real-Time PCR System實時PCR檢測系統(上海宏石醫療科技有限公司)進行結核分枝桿菌利福平的耐藥性檢測及結果分析。GeneXpert MTB/RIF檢測儀及試劑盒由美國賽沛公司生產。

三、研究方法

1.涂片鏡檢：按照《結核病實驗室檢驗規程》[3],選取適量痰標本進行涂片,隨后進行萋-尼抗酸桿菌染色,在100倍油鏡下進行檢測。對檢測結果進行分級,即“陰性”“1～8條/300視野”“+”“++”“+++”“++++”。

2.分枝桿菌分離培養：按照《結核病實驗室檢驗規程》,吸取1 ml痰標本放入前處理管中,加入1～2倍體積4%的NaOH溶液,旋緊處理管螺旋蓋,振蕩混勻,使痰標本充分液化,于室溫下靜置15 min后,均勻接種于酸性羅氏培養基上,每支0.1～0.15 ml,旋緊螺旋蓋,在36 ℃±1 ℃中孵育,直至長出可視菌落,記錄生長情況。培養8周無菌落生長者報告“陰性”。

3.結核分枝桿菌比例法藥敏試驗：參照《結核病實驗室檢驗規程》的結核分枝桿菌固體藥敏試驗操作,使用細菌超聲分散計數儀BAC spreader 1100C、中性羅氏培養基、含藥培養基(利福平,40 μg/ml),對培養陽性菌株進行利福平比例法藥敏試驗,同時用對硝基苯甲酸/噻吩-2-羥酸肼(PNB/TCH)培養基鑒定是否為結核分枝桿菌。TCH培養基上有菌落生長,PNB培養基上無菌落生長者為結核分枝桿菌;PNB培養基上有菌落生長,TCH培養基上無菌落生長者為非結核分枝桿菌。耐藥百分比(%)=含藥培養基上生長的菌落數/對照培養基上生長的菌落數×100%。若耐藥百分比大于1%,則認為受試菌對該藥耐藥。

4.MeltPro技術耐藥性檢測：吸取1 ml痰標本加入到50 ml圓底離心管內,再加入1～2 ml前處理液(N-乙酰-L-半胱氨酸-氫氧化鈉溶液),室溫下振蕩混勻15 min,加入40 ml 磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中和離心(3000×g離心18 min),棄上清,加1 ml的PBS進行重懸沉淀,10 000×g離心1 min,棄上清。在沉淀中加入300 μl試劑盒中提供的TB-DNA提取液,90 ℃加熱10 min,10 000×g離心1 min,吸取上清液,得到結核分枝桿菌的DNA。按說明書要求配置PCR反應液,在20 μl反應液中加入5 μl結核分枝桿菌DNA,使用SLAN-96S Real-Time PCR系統進行結核分枝桿菌利福平耐藥性檢測及結果分析,反應程序參照說明書。通過比較所檢測樣本與陽性對照樣本之間熔解曲線熔點值的差異判斷樣本是否發生突變：樣本的熔點與陽性對照的熔點一致,誤差不超過1 ℃時,判定為野生型,待檢樣本對所檢測藥物敏感;樣本的熔點低于陽性對照2 ℃及以上時,判定為突變型,待檢樣本對所測藥物耐藥。若結果為結核分枝桿菌未檢出或耐藥不明確,則檢測不成功,需重復檢測。

5.GeneXpert MTB/RIF檢測：按照GeneXpert MTB/RIF檢測說明書要求操作,取1 ml痰標本置于螺旋蓋前處理管中,加入2倍體積的檢測樣品試劑,旋緊前處理管,室溫下振蕩混勻15 min,使痰標本充分液化,打開檢測匣,取2 ml處理后的樣品,由加樣孔緩慢加入檢測匣中,放置到檢測模塊,儀器開始自動化檢測。該技術針對rpoB基因81 bp利福平耐藥核心區間(RRDR)設計引物和探針,檢測其是否發生突變,用于輔助診斷是否為結核分枝桿菌,以及是否對利福平耐藥。基于樣本中結核分枝桿菌的Ct值,結核分枝桿菌結果以高、中、低和極低顯示,Ct值<16為結核分枝桿菌含量高,Ct值在16～22之間為結核分枝桿菌含量中等,Ct值在22～28之間為結核分枝桿菌含量低,Ct值>28為結核分枝桿菌含量極低。

四、質量控制

本研究藥敏試驗所用培養基均用標準菌株H37Rv進行含藥培養基質量控制。北京市疾病預防控制中心結核病實驗室每年參加中國疾病預防控制中心結核病參比實驗室組織的藥敏試驗熟練度測試,成績為優秀。MeltPro技術耐藥性檢測選用含有相應野生型靶擴增基因的質粒作為陽性對照,既完成了結果的判讀,又保證了檢測的質量。GeneXpert MTB/RIF檢測每個檢測匣包括樣本處理質控,確保樣品經過正確處理;以及探針檢查質控,保證探針檢查合格。

五、統計學處理

采用SPSS 19.0軟件對數據進行統計分析。計量資料呈偏態分布時以“M(Q1,Q3)”描述,計數資料以“例數”和“百分率/構成比(%)”描述,采用χ2檢驗或Fisher精確概率法及Kruskal-WallisH檢驗進行組間差異的比較,以P<0.05為差異有統計學意義。以利福平比例法藥敏試驗結果為參考標準,分別計算MeltPro技術和GeneXpert MTB/RIF方法檢測利福平耐藥的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值和Kappa值。Kappa值用于一致性檢測,0～0.20為一致性極低,0.21～0.40為一致性一般,0.41～0.60為一致性中等,0.61～0.80為基本一致,0.81～1.00為幾乎完全一致。

結 果

一、一般情況

本研究共收集158例初治肺結核患者GeneXpert MTB/RIF檢測陽性痰標本,其中男性115(72.8%)例,女性43(27.2%)例。年齡范圍16～88歲,年齡M(Q1,Q3)為46(31,64)歲。158例患者的痰標本中,涂片陽性104例,涂片陽性率為65.8%(104/158);經分枝桿菌分離培養,獲得陽性菌株130株,培養陽性率為82.3%(130/158),培養陰性20例,污染8例,污染率為5.1%(8/158)。104例患者的涂片陽性標本中,培養陰性14例,涂陽培陰率為13.5%。130株陽性菌株均進行了利福平比例法藥敏試驗,得到明確的利福平藥敏試驗結果。

158份痰標本經MeltPro技術進行利福平耐藥性檢測,成功125份,失敗33份。在130份培養陽性進行藥敏試驗的痰標本中,110份MeltPro技術利福平耐藥性檢測成功,20份檢測不成功。28份未得到陽性菌株的痰標本中,經MeltPro技術檢測有15份對利福平敏感,13份檢測不成功。

二、痰標本荷菌量對MeltPro技術利福平耐藥性檢測的影響

MeltPro技術的利福平耐藥性檢測成功率為79.1%(125/158),隨著痰涂片結果等級的升高而升高,各等級間差異有統計學意義(H=22.271,P=0.001),見表1。檢測成功率也隨著GeneXpert MTB/RIF檢測結核分枝桿菌等級的升高而升高,各等級間差異有統計學意義(H=15.637,P=0.001),見表2。

表1 痰涂片結果不同等級與MeltPro技術檢測利福平耐藥性成功的關系

表2 GeneXpert MTB/RIF檢測結核分枝桿菌不同等級與MeltPro技術檢測利福平耐藥成功的關系

三、利福平耐藥性檢測

MeltPro技術的利福平耐藥檢出率為17.6%(22/125),GeneXpert MTB/RIF方法的利福平耐藥檢出率為12.7%(20/158),比例法的利福平耐藥檢出率為13.1%(17/130),三者差異無統計學意義(χ2=1.537,P=0.464)。

以比例法藥敏試驗結果為參考標準,MeltPro技術和GeneXpert MTB/RIF方法檢測利福平耐藥的敏感度均為100.0%,特異度分別為94.6%和97.3%。見表3。

GeneXpert MTB/RIF方法檢測利福平耐藥基因突變而比例法藥敏試驗結果敏感者3例,MeltPro技術檢測利福平耐藥基因突變而比例法藥敏試驗結果敏感者5例。由于標本量不足,無法進行GeneXpert MTB/RIF重復實驗;對相應結核分枝桿菌DNA用MeltPro技術進行了2次重復實驗,結果同前。

表3 MeltPro技術和GeneXpert MTB/RIF方法檢測利福平耐藥性的效能

討 論

Meltpro技術是國家科技重大專項的“結晶”,可以在3 h內完成檢測,有多個熒光探針同時檢測多個突變,通過熔點的變化和突變對應特有的熔解峰自動分析結果。多中心研究測得Meltpro技術檢測的敏感度和特異度分別為94.2%和97.5%[4]。本研究選用肺結核患者痰標本,直接采用MeltPro技術進行利福平耐藥性檢測,發現其有較高的敏感度和特異度,但在基層實驗室應用時還需注意DNA提取、標本的選擇等問題。

一、MeltPro技術檢測結果與痰標本菌荷量的關系

將MeltPro技術檢測結果與痰涂片結果分級對應,涂片陰性痰標本檢測成功率為59.3%,涂片1～8條/300視野及“+”的痰標本檢測成功率為80.0%和86.2%,“++”及以上痰標本檢測成功率為90.6%～100.0%,隨著涂片陽性等級的升高,檢測成功率相應升高。涂片陽性痰標本檢測成功率達到80.0%以上,能獲得可靠的耐藥信息,與趙國連等[5]報告的結果基本一致。本研究同時對GeneXpert MTB/RIF檢測結核分枝桿菌等級進行了比較,Meltpro檢測成功率也隨著結核分枝桿菌陽性級別的升高而升高,結核分枝桿菌陽性等級達到“中”和“高”時,檢測成功率分別為91.8%和92.9%。因此,筆者建議基層實驗室應用Meltpro技術時,為保證耐藥檢測的成功率,可選用涂片結果為“++”及以上或GeneXpert MTB/RIF檢測結核分枝桿菌等級為“中”或“高”的痰標本。

二、MeltPro技術的利福平耐藥篩查臨床應用價值

本研究中,MeltPro技術、GeneXpert MTB/RIF方法和比例法藥敏試驗檢測痰標本結核分枝桿菌利福平耐藥的檢出率分別為17.6%、12.7%和13.1%,三者差異無統計學意義。以比例法藥敏試驗檢測結果為參考標準,MeltPro技術檢測利福平耐藥的敏感度為100.0%,特異度為94.6%,與蘇碧儀等[6]報道的結果基本一致。與比例法藥敏試驗結果一致性的比較顯示,Kappa值為0.845,為幾乎完全一致。

三、MeltPro技術的可實施性

比例法藥敏試驗依賴于培養陽性菌株,需4～6周得到藥敏試驗結果。GeneXpert MTB/RIF是目前常用的分子利福平耐藥檢測方法,操作時長約2.5 h,試劑平均成本約220元/例;儀器及設備均需要進口,在使用和維修保養中受到一定限制;常規的GeneXpert MTB/RIF檢測儀為4通道,可同時檢測4份標本。與之相比,MeltPro技術也可以直接檢測痰標本,于3 h內獲得耐藥檢測結果,試劑平均成本約100元/例。MeltPro技術的試劑及儀器設備均為國產,試劑采購和儀器維修保養均很方便;可同時檢測46份標本的利福平耐藥情況。除此之外,該技術檢測藥物種類更多,可檢測異煙肼、利福平、鏈霉素、乙胺丁醇及氟喹諾酮類藥物的耐藥情況。有文獻報道,經GeneXpert MTB/RIF檢測為利福平耐藥的結核分枝桿菌,同時對異煙肼和氟喹諾酮類藥物耐藥的比例也較高[7],可能會造成對MDR-TB及準廣泛耐藥結核病的漏診。另外,RR-TB患者一經診斷,往往以氟喹諾酮類藥物作為初始抗結核治療方案的核心藥物之一,若此時結核分枝桿菌對氟喹諾酮類藥物耐藥,會降低治療效果,造成治療失敗甚至患者死亡[8]。MeltPro技術能夠快速篩查MDR-TB和準廣泛耐藥結核病患者,為臨床醫生因人施治提供依據。

四、比例法與分子藥敏試驗結果不一致原因初步分析

本研究中,部分痰標本的分子耐藥檢測結果與比例法藥敏試驗結果不一致,均已進行了重復試驗。造成該現象的原因可能與利福平存在一定比例的邊緣耐藥現象有關。本研究中,比例法藥敏試驗于接種后4周報告藥敏試驗結果。Xia等[9]通過將比例法藥敏試驗結果的報告時間由4周延長至6周,使得更多邊緣利福平耐藥菌株被檢出,利福平耐藥的檢出率由43.9%上升至57.9%;Xia等[9]在用優化肉湯微孔板法進行藥敏試驗時發現,將臨界濃度由1.0 μg/ml降低至0.5 μg/ml時,利福平耐藥的檢出率由52.6%上升至70.2%,說明耐藥基因檢測與比例法藥敏試驗結果不符還可能與培養基含藥濃度有關;另外,有研究報道,rpoB基因RRDR區位點突變導致的利福平耐藥患者中,有48.8%的表型藥敏試驗結果為敏感,其中Leu511Pro是最常見的突變位點[10]。由此推斷,利福平耐藥基因突變而比例法藥敏試驗結果敏感也可能與突變位點有關。

另外,若患者存在敏感菌和耐藥菌的混合感染,通常在培養過程中,敏感菌生長優于耐藥菌,導致培養物中耐藥菌的比例下降,出現表型藥敏試驗結果為假陰性[11]。后續可對菌株進行MeltPro技術耐藥性篩查,探討異質性耐藥對分子耐藥檢測和比例法藥敏試驗結果的影響。

五、實驗中存在的問題和不足

本研究中有33份痰標本MeltPro耐藥性檢測不成功。根據說明書提供的數據,MeltPro技術進行利福平耐藥篩查的檢測限為2×104菌/ml。本研究采用粗提法從痰標本中提取結核分枝桿菌DNA。該方法雖然操作簡便快捷,適用于基層實驗室,但提取效能有限,不能保證DNA純度及濃度,可能會干擾耐藥檢測結果[10]。此外,病原學檢測結果的敏感度與痰標本質量密切相關[12],若能提高痰標本質量,并對粗提DNA進行純化或采用提取效能高的方法或儀器進行核酸的提取,可極大提高MeltPro技術的檢測成功率。再者,對比例法藥敏試驗與分子耐藥結果不符合的標本,應進一步行全基因組測序等檢測,分析不一致的原因;本研究受經費和課題時間的限制,耐藥標本收集數量有限,在后續條件允許的情況下,將收集更多耐藥痰標本進行深入研究。

綜上所述,使用MeltPro技術直接對痰標本進行利福平耐藥性篩查具有敏感度高、特異度強、操作簡便等優點,可縮短檢測時間,為臨床提供快速準確的耐藥篩查結果。同時,MeltPro技術還能夠快速篩查MDR-TB和準廣泛耐藥結核病患者。但MeltPro技術對DNA的濃度及純度有較高要求,若能保證DNA濃度及純度,可以極大提高檢測的成功率。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻王嫩寒：醞釀和設計實驗、整理數據、論文撰寫和修改;田麗麗、陳雙雙和趙琰楓：整理數據、進行統計分析;樊瑞芳、陳昊、任怡宣、張潔、易俊莉、楊新宇和于蘭：收集標本、實施研究;丁北川：行政、技術支持,獲取研究經費;李傳友和代小偉：技術和材料支持、文章修改和指導