CRISPR-Cas13a檢測在肺結核診斷中的價值

張治國 尚媛媛 張旭霞 劉榮梅 馬麗萍 秦林 孔忠順 任衛聰

目前,臨床上診斷肺結核的方法仍是影像學技術及細菌學檢測,但痰涂片抗酸桿菌染色法簡單、快速、經濟,但敏感性差;痰菌培養周期長,不利于臨床結核病的診斷和治療[1]。隨著結核病實驗室診斷技術不斷進步,分子生物學檢測技術以其獨特的優勢正迅猛發展且逐步取代傳統的結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis,MTB)檢測技術[2]。GeneXpert MTB/RIF(簡稱“Xpert”)是世界衛生組織推薦用于結核病檢測的分子診斷平臺,與傳統檢測方法比較,其檢測的敏感度和特異度均明顯升高[3]。然而,其檢測成本是涂片鏡檢的20多倍,阻礙了在低收入國家的大規模應用。因此,需要更多經濟有效的分子生物學技術來提高結核病的檢出率。

成簇的規律間隔短回文重復序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)和相關蛋白(Cas)系統由于其高度的靈活性、敏感性和特異性而在臨床診斷中得到越來越多的應用[4]。通過將目標核酸序列轉化為熒光信號,可以有效地檢測病原微生物。例如,基于 CRISPR/Cas12a 的平臺已用于檢測結核病和其他傳染病[5-9]。此外,RNA引導的靶向RNA的核酸內切酶 Cas13a是另一種在分子診斷方面具有巨大潛力的CRISPR-Cas系統。有研究人員將Cas13a的側鏈RNase 切割與分子擴增相結合,建立了基于 CRISPR-Cas13a 的平臺,敏感度達單拷貝、特異度達單堿基的高敏感性、高特異性病毒檢測方法[10-11]。本研究旨在利用CRISPR-Cas13a檢測方法對臨床樣本進行檢測,評價其對肺結核的診斷效能。

材料和方法

一、標本來源

采用回顧性研究方法,收集首都醫科大學附屬北京胸科醫院2022年9月至2022年12月收治住院的102例經Xpert檢測確診的肺結核患者的支氣管肺泡灌洗液標本,作為結核病組;收集同期收治入院的100例非結核病患者(包括肺癌,細菌性肺炎,支氣管擴張,慢性阻塞性肺疾病)的支氣管肺泡灌洗液標本,作為非結核病組。所有患者的支氣管肺泡灌洗液標本均進行涂片抗酸桿菌染色鏡檢、分枝桿菌培養、Xpert檢測及CRISPR-Cas13a檢測。

二、儀器與試劑

T7 RNA聚合酶(T7 RNA Polymerase Mix,M0255A,美國New England Biolabs公司)、MightyAmpTMDNA Polymerase Ver.3 [寶日醫生物技術(北京)有限公司]、報告RNA試劑盒(RNase Alert v2,30315288,美國Invitrogen公司)、RNA純化磁珠[FAgencourt RNA Clean XP,貝克曼庫爾特商貿(中國)有限公司]、鼠RNA酶抑制劑(美國New England Biolabs公司),GeneXpert MTB/RIF反應盒及樣本處理液(美國Cepheid公司),OADC(美國BD公司),Casl3a蛋白由軍事醫學研究院微生物流行病研究所贈與;ABI7500熒光定量PCR儀(美國ABI公司)、Axygen Maxygene-Ⅱ梯度PCR儀(廣州科適特科學儀器有限公司)、BACTEC MGIT 960 全自動分析儀(美國BD公司)。

三、檢測方法

(一)涂片抗酸桿菌染色鏡檢

采用直接涂片抗酸桿菌染色鏡檢法,具體操作過程按照《痰涂片鏡檢標準化操作及質量保證手冊》的要求進行。

(二)分枝桿菌培養

將1～2 ml支氣管灌洗液用2% N-乙酰-L-半胱氨酸-NaOH 進行消化處理。在MGIT液體培養管中加入雜菌抑制劑(PANTA)和營養添加劑(OADC)混合添加劑0.8 ml。將0.5 ml處理后的樣本加入到MGIT培養管并將培養管放入BACTEC MGIT 960分枝桿菌培養系統中培養。通過分析熒光強度判斷是否有MTB生長,一般快速 7～14 d培養陽性,培養周期設定為42 d。

(三)Xpert檢測

按照GeneXpert MTB/RIF操作說明書進行。取2 ml支氣管灌洗液標本與1～2倍體積的樣本處理液混合,在渦旋振蕩器上振蕩15～30 s,室溫放置15 min。用專用吸管把處理后的樣本緩慢加入Cartridge 反應盒內,然后將反應盒放置到檢測模塊中進行檢測,2 h后系統自動顯示MTB的檢測結果。MTB 陽性的診斷標準為5個探針中至少2個探針循環閾值(Ct值)≤38,并可按Ct值對樣本中MTB進行半定量分析,Ct值<16為高荷菌量,16～22為中等荷菌量,22～28為低荷菌量,>28為極低荷菌量。

(四)CRISPR-Cas13a檢測

1.crRNA的設計、篩選和制備：參考文獻[10],以MTB特異性重復序列IS1081為檢測的靶序列,在序列的不同位置分別設計crDNA,篩選熒光信號最強,敏感度好、特異度高的crRNA,具體crRNA序列如下：GGGGAUUUAGACUACCCCAAAA-ACGAAGGGGACUAAAACCCCGCCCGCUCGA-UGCCGGCCCGUAUAC,擴增需要的上游引物(5′～3′)：TAATACGACTCACTATAGGGGAT-TTAGACTACCCCAA,下游引物(5′～3′)：GTATACGGGCCGGCATCGAG。

2.樣本的核酸提取：收集入組患者的支氣管灌洗液2 ml,采用煮沸法提取基因組DNA并保存到-80 ℃備用。

3.PCR擴增靶基因序列：提取臨床樣本DNA,以ddH2O為陰性對照管,以卡介苗基因組為陽性對照組,進行靶基因的擴增。擴增引物序列如下：TB_IS1081F：5′-ACAAAGCTTTCCAAGTCGCA-3′;TB_IS1081_R1：5′-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGCCCAGGATCTCTCGGTAGC-3′。

4.熒光檢測：將上一步反應的產物2 μl進行檢測,體系見表1。體系放入熒光定量PCR儀,FAM通道檢測熒光信號變化。設置37 ℃反應30 s,37 ℃ 反應30 s(收集熒光),共30個循環。

表1 CRISPR 檢測體系

5.CRISPR 結果判定：陰性對照基本無熒光信號的變化,復孔檢測結果基本一致;陽性對照熒光信號明顯升高,滿足以上兩條說明實驗結果可信。陽性結果：檢測結果以樣品熒光信號與陰性對照具有明顯差異為陽性。陰性結果：樣品熒光信號無明顯升高,與陰性對照無明顯差異。

四、統計學處理

采用SPSS 22.0軟件進行數據分析。計數資料以“頻數和百分率(%)”描述,組間差異的比較采用χ2檢驗和Fisher精確概率法,以P<0.05為差異有統計學意義。采用GraphPad Prism 5.0軟件繪制數據韋恩圖。以Xpert檢測結果作為參考,評價CRISPR-Cas13a診斷結核病的效能,各指標計算公式如下：敏感度=真陽性數/(真陽性數+假陰性數)×100%;特異度=真陰性數/(真陰性數+假陽性數)×100%;陽性預測值=真陽性數/(真陽性數+假陽性數)×100%;陰性預測值=真陰性數/(真陰性數+假陰性數)×100%;準確度=(真陽性數+真陰性數)/(真陽性數+真陰性數+假陰性數+假陽性數)×100%。

結 果

一、檢測結果

結核病組102份標本中,CRISPR-Cas13a檢測陽性為99份(97.1%),涂片陽性40份(39.2%),培養陽性68份(66.7%)。CRISPR-Cas13a-MTB檢測陽性率明顯高于涂片和培養法,差異有統計學意義(涂片：χ2=58.141,P<0.001;培養：χ2=30.250,P<0.001)。與傳統檢測方法相比,CRISPR-Cas13a比涂片和培養法多檢測出28份標本(圖1)。非結核病組100份標本中,CRISPR-Cas13a檢測陽性4份(4.0%),明顯低于檢測結核病組標本的陽性率,差異有統計學意義(χ2=174.982,P<0.001)。

圖1 三種方法檢測102份肺結核患者支氣管肺泡灌洗液標本的韋恩圖

二、檢測效能

結核病組102份標本,Xpert檢測陽性率為100%;非結核病組100份標本,Xpert檢測陰性率為100%。以Xpert檢測結果作為參照,CRISPR-Cas13a檢測肺結核的敏感度為97.1%(99/102)、特異度為96.0%(96/100),準確度為96.5%(195/202),陽性預測值為96.1%(99/103),陰性預測值為97.0%(96/99)。

討 論

目前,CRISPR系統已被開發為體外核酸檢測的高敏感度診斷工具[10,12-13]。CRISPR系統在病毒、真菌、細菌等病原微生物的檢測中得到了廣泛應用。Gootenberg等[10]建立了敏感度可達到單拷貝的核酸檢測技術SHERLOCK,并將之應用于生物樣本(血液或尿液)中多種病毒的檢測。Qin等[14]報告CRISPR-Cas13a自動檢測埃博拉病毒RNA的POC系統,純化的埃博拉病毒RNA的檢測達到20 PFU/ml;Li等[15]把CRISPR-Cas13a系統應用到真菌的核酸檢測中,其檢測的敏感度和特異度分別為100.0%和91.7%。Ai等[16]利用CRISPR-Cas12a系統建立了對MTB的快速檢測方法,為肺結核高敏感度的診斷提供了巨大潛力,其中,Casl2a可將識別的靶序列為雙鏈DNA,并可切割單鏈DNA;Casl3a與Casl2a不同,它能夠在切割靶RNA之后呈現出強大的,對非特異的 RNA 序列的“平行切割”效應[17],起到信號放大的效應,可以提高對靶基因的檢出率。CRISPR-Casl3a系統在埃博拉病毒[14]、乙型肝炎病毒[18]、新型冠狀病毒[19]等檢測中具有較高的敏感度,說明Casl3a具有廣泛應用于科學和臨床醫學領域的潛力。

本研究對102例肺結核患者和100例非結核病患者的支氣管肺泡灌洗液標本進行CRISPR-Cas13a檢測,以Xpert檢測結果為參照,其敏感度為97.1%。Ai等[16]采用Cas12a對結核病患者進行MTB的檢測,其檢測敏感度為79%,高于Xpert檢測(敏感度為66%)和培養(敏感度為33%),兩種檢測方法的敏感度不一樣,原因之一可能是檢測的標本類型不同,原因之二可能是CRISPR系統中所用的Cas蛋白不同,原因之三可能是檢測的靶基因序列不同。本文采用的檢測方法與Ai等[16]利用Cas12a建立的MTB檢測方法對樣本量的需求是一致的,需要的樣本量少,僅需要500 μl的體液即可完成檢測,更適合兒童結核病和結核性腦膜炎的診斷。另外,此方法在低細菌載量的患者診斷中具有優勢,但其診斷的效能需要在不同類型標本中,包括標本量較少和含菌量較低的體液中進一步驗證,如肺外結核和結核性胸膜炎等。

CRISPR-Cas13a應用于臨床時,其操作過程簡單,通過臨床常用的、穩定PCR擴增和通用的“報告RNA”檢測即可完成。僅需要1臺熒光PCR儀,在2 h之內就能完成全部檢測。此外,檢測成本低于2美元,這與涂片顯微鏡的成本相當,但診斷準確性明顯提高。因此,此方法在資源有限情況下,為結核病的診斷提供了一種有競爭力的替代方案。

本診斷方法也具有一定的局限性。首先,由于其檢測的是菌體DNA,不能判斷患者體內是否有活菌存在,因此,無法滿足結核病患者隨訪的需求。其次,本研究納入樣本數量有限,需要擴大樣本量進一步驗證其診斷的準確性。再次,通過對基因組多拷貝序列IS1081作為檢測靶標,CRISPR-Cas13a表現出較高的敏感度,但是其特異度有待進一步驗證,尤其是在感染非結核分枝桿菌的患者中。最后,本研究使用的核酸采用簡單法提取,其提取效率相較自動提取法偏低,可能影響其檢測的敏感度。因此,建立基于CRISPR-Cas13a的即時診斷技術是未來發展的重要方向。

綜上所述,本研究系統評價了CRISPR-Cas13a在支氣管肺泡灌洗液中檢測MTB的效能,研究結果表明與傳統方法相比,其具有敏感度高和特異度高的優勢,且操作方法便捷,有廣闊的應用前景。未來亟需納入大樣本量開展臨床評價,為推廣基于CRISPR-Cas13a的MTB檢測系統提供更可靠依據。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻張治國：醞釀和設計實驗及實施研究;尚媛媛和秦林：實施研究;張旭霞、劉榮梅和馬麗萍：采集數據;孔忠順：分析及解釋數據;任衛聰：分析及解釋數據、起草文章、統計分析。