典型大氣壓冷等離子體射流的劑量評估

李 靜,趙潞翔,羅嵐月,張子明,何 濤,袁 月,張 宇,*,李和平,*

(1.清華大學a.工程物理系;b.機械工程系;c.醫學院;d.藥學院,北京 100084;2.中國空氣動力研究與發展中心空氣動力學國家重點實驗室,四川 綿陽 621000)

大氣壓冷等離子體(Cold atmospheric plasma,CAP)具有顯著的非平衡特性,被廣泛應用于多個領域,目前已經形成了等離子生物醫學[1]、等離子體農業[2]等多個交叉應用領域。在上述等離子體的實際應用中,研究發現不同強度的CAP處理會導致具有顯著差異的實際作用效果。因此,迫切需要引入“等離子體劑量”這一概念來對CAP作用強度進行定量化描述,從而有助于對實際應用中等離子體處理效果的調控和優化,獲得符合預期的等離子體材料處理效果。已有研究表明,等離子體物理學和生物醫學領域的諸多參數均會對等離子體的作用效果產生顯著影響,進而影響對“等離子體劑量”的評估。其中的物理參數包括等離子體發生器的幾何結構設計、驅動電源的波形和頻率、工作氣體化學成分、氣體溫度、作用距離等[3-11],而從非物理角度出發,被處理生物活體材料的種類、活性與數量、培養基參數[5,6]等同樣是重要的影響因素。

盡管等離子體劑量學的研究隨著等離子體醫學研究的深入而不斷深入,但現有研究中仍然主要以物理參數來評估等離子體劑量的大小,其中最常用的是處理時間和放電功率等。例如,2005年,Kieft等的研究結果表明,等離子體短時間作用于哺乳動物細胞并不會對其造成損傷,而延長等離子體處理時間則會導致細胞凋亡[3];Dobrynin等亦采用不同類型的CAP源得到了類似的實驗結果[4],即當采用低檔功率CAP處理細胞時,細胞幾乎不被損傷,而采用中檔或者高檔功率CAP進行處理后,細胞出現凋亡現象。盡管采用放電功率或處理時間作為等離子體劑量的標度從物理上看來非常直觀,但由于實際應用中CAP源的種類豐富,其放電特性與參數范圍各不相同。對某一種CAP源的劑量評估方法往往很難適用于其他CAP源,從而使得依賴于作用時間和功率等參數的等離子體劑量評估方法缺乏足夠的通用性。近幾年來,各國研究者對等離子體劑量學的研究不斷深入。比如,Cheng等提出以等離子體的等效總氧化勢(Equivalent total oxidation potential,ETOP)作為等離子體劑量的定義方法,并通過實驗方法建立了等離子體殺菌效果和ETOP數值的對應關系[5],為等離子體劑量的定義提供了新的思路。此外,由于等離子體與待處理材料間可能存在的物理-化學-生物相互作用十分復雜,為了準確描述等離子體劑量從而調控具體作用效果,有研究者采用機器學習等方法對CAP材料處理效果進行實時控制和優化[8-11]。最近,Li等則結合藥學中“半數致死劑量(Median lethal dose,LD50)”的概念和體外細胞培養實驗,提出了一種通用、便捷且可操作性強的CAP劑量評估方法,即LD50-等離子體劑量評估方法[12]。綜合考慮上述各種表征等離子體劑量的方法,可以看到,等離子體放電功率和處理時間這兩個參數無法從本質上反應等離子體劑量,僅能作為適用于特定CAP源的經驗參考;基于ETOP的劑量學定義需要對活性粒子種類、濃度、氧化電位及其他可能產生等離子體生物學效應的因素進行精確的計算或實驗測量[13];而LD50-等離子體劑量評估方法無需考慮復雜的等離子體活性成分及其與被處理材料間的相互作用,不受限于等離子體參數,而是直接利用體外細胞實驗結果對等離子體劑量進行表征,但有關作用于生物體的不同CAP源的有效功率的確定,以及等離子體對不同細胞系的作用劑量等問題,亦需開展深入的研究。總之,一個合理的等離子體劑量定義方法,應該滿足通用性強、重復性好、操作簡單、成本低等基本要求,從而建立起不同類型CAP源作用效果與其工作參數之間的定量關系,為調控和優化CAP的實際作用效果提供指導。特別地,此處的通用性指的是劑量學的定義方法應該不依賴于具體的CAP源結構設計和工作參數,以及對等離子體-生物體復雜相互作用過程的解析。

本論文基于LD50-等離子體劑量評估方法,采用一種以高純氦為工作氣體的典型CAP源,即大氣壓射頻輝光放電(Radio-frequency atmospheric-pressure glow discharge,RF-APGD)等離子體射流來處理人體胚胎腎293(Human embryoric kidnoy 293,HEK293)細胞,獲得對應的LD50數值,并與文獻[12]中采用大氣壓介質阻擋放電(Atmospheric-pressure dielectric-barrier discharge,AP-DBD)等離子體射流的實驗結果進行了對比和分析。本論文工作進一步驗證了LD50-等離子體劑量評估方法的可靠性和便捷性,也為兩種典型CAP源在生物醫學等領域的實際應用提供了一定的理論指導和劑量參考。

1 材料與方法

1.1 LD50-等離子體劑量評估方法

在藥學中,測量LD50值是評估藥物毒性的典型方法之一,其數值代表了某種藥物可以殺死半數實驗對象(如體外細胞、實驗動物等)時對應的劑量數值。對于藥物來說,藥物的劑量一般取其質量或者體積。LD50數值的測量可為藥物毒性的定量測試和評估提供重要的依據[14],該數值越大,說明該藥物的毒性越低,即這種藥物的安全性越高。Li等受到這一概念的啟發[12],提出了通過測量CAP射流處理體外培養細胞的LD50數值來定量化評估等離子體劑量的方法,并取有效注入能量與被處理細胞個數的比值(Weff/N)作為劑量單位(mJ·cell-1),形成了一種操作簡單但通用性較強的等離子體劑量評估方法。Li等[12]采用如圖1(a)所示的同軸型氦氣AP-DBD等離子體發生器對體外培養的HEK293細胞進行不同時長的處理,并將細胞存活率(ξ)擬合成了關于等離子體劑量對數值的“S”型曲線(圖2),進而得到了細胞存活率為50%時對應的等離子體劑量為34.67 mJ·cell-1。該數值為AP-DBD在生物醫學應用中放電功率、處理時間等的選擇提供了一定的參考。

圖1 (a) AP-DBD[12]和(b) RF-APGD發生器示意圖Fig.1 Schematics of the AP-DBD[12] and RF-APGD plasma generators

log(W/N)/(mJ·cell-1)

1.2 細胞培養

為了使得實驗結果具有可對比性,本研究采用的體外培養細胞與Li等相同[12],均為來自北京協和醫學院細胞中心的HEK293細胞。經過細胞復蘇操作后,在補充10%胎牛血清和1%盤尼西林的DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)培養基(賽默飛世爾科技有限公司)中進行培養。培養基置于37 °C和提供5%CO2的細胞培養箱(賽默飛世爾科技有限公司)中;每隔幾個小時在生物倒置熒光顯微鏡(舜宇集團有限公司,型號:XD)下觀察;當觀察到細胞達到對數生長期后,將細胞種植到96孔板中,每個細胞培養孔中固定種植5 000個細胞;放入細胞培養箱培養24 h后再進行CAP射流處理。

1.3 實驗裝置

RF-APGD等離子體具有放電均勻、柔和、穩定性好等特點,是在實際應用中被廣泛采用的CAP源之一。本論文采用頻率f=13.56 MHz射頻電源驅動裸露電極型發生器產生RF-APGD等離子體射流,發生器示意圖如圖1(b)所示。等離子體發生器具有同軸結構,內外電極材料均為紫銅,內電極直徑為12.0 mm,放電間隙為1.6 mm。內電極與射頻電源相連,為功率電極;外電極為地電極,在實驗中保持接地狀態。發生器端帽的作用是調整等離子體流動方向,從而形成類似火焰形狀的等離子體射流,便于開展材料處理。為了獲得等離子體射流的特性,采用數字示波器(Tektronix,型號:DPO4034)、電壓探頭(Tektronix,型號:P6015A)和電流探頭(Tektronix,型號:TCP0030A)采集了放電過程中的電壓-電流波形,采用Z-scan(Advanced Energy Industries,型號:3155135-003)測量放電功率,并采用光纖光譜儀(Avantes多通道光纖光譜儀,型號:AvaSpec-3648)對等離子體的發射光譜特性進行測量。為了避免電路中的分布電感和分布電容對測量結果的影響,電壓探頭和電流探頭的夾持位置要盡可能靠近等離子體發生器的放電區。

本研究采用的等離子體工作氣體為高純氦(含0.5×10-6的氮氣雜質),氣體流量固定為Q=20 slpm。氦氣在內外電極間的環形間隙中沿著發生器的軸向流動,并在外加射頻電場的作用下放電形成均勻、穩定的等離子體,隨后噴出發生器端帽出口形成等離子體射流,如圖1(b)所示。RF-APGD等離子體發生器端帽出口處直徑為10 mm,由此噴出的等離子體自由射流直徑亦在10 mm量級,大于96孔板中的細胞培養孔直徑,從而對自由射流細胞處理的效率產生影響。為了解決這一問題,在發生器出口處外接了長度為5 mm且末端內徑與細胞培養孔直徑相同(6 mm)的錐形亞克力管,如圖1(b)所示。該亞克力管的另一作用是固定實驗中等離子體的處理距離為5 mm。這一處理距離與Li等[12]的工作有所不同,將會在后文中給出詳細討論。此處需要說明的是,選擇Q=20 slpm這一流量是為了保證發生器出口處氣體流速與Li等采用AP-DBD時的氣體流速基本一致[12]。

由于RF-APGD的放電電流一般在安培量級,放電過程中的熱效應明顯,等離子體氣體溫度會顯著高于室溫。然而細胞等活體生物材料對外界溫度是非常敏感的,當外界溫度超過42 ℃時,細胞會發生凋亡[15]。由于Li等采用的AP-DBD發生器產生的等離子體射流溫度在20 ℃～24 ℃范圍內[12],為了使得實驗結果具有可對比性,本研究采用經過液氮冷卻的高純氦氣作為工作氣體[16],保證得到的等離子體射流溫度在20 ℃～24 ℃范圍內,避免對細胞產生熱損傷。在放電功率Pin=30 W,工作氣體流量Q=20 slpm的條件下,將進入發生器的工作氣體冷卻至THe,in=7 ℃～11 ℃范圍內時,在距離發生器出口為5 mm的射流區采用低溫溫度計(衡水明輝自動化儀器有限公司,型號:DT-180A)測量得到的射流平均氣體溫度在Tg=20 ℃～24 ℃范圍內。此處需要強調的是,本文實驗中采用液氮冷卻進入發生器的工作氣體并不會對射流區的活性粒子的種類和濃度產生明顯的影響。這是由于射流區活性粒子主要由電子碰撞的化學反應控制,而僅有部分與重粒子碰撞相關的化學反應速率依賴于氣體溫度(單位取K)[17],而液氮將氣體溫度為室溫(本文實驗中為298 K)的高純氦冷卻至THe,in,平均溫差為16 K,相對于室溫變化約為5%,對于相關的化學反應速率影響較小。因此,在本文實驗中,可近似認為液氮對發生器入口處工作氣體的冷卻不會對射流區活性粒子的種類和濃度產生顯著影響。

RF-APGD等離子體射流細胞處理的完整過程在生物安全柜[海爾,型號:HR30-IIA2(KY)]中完成,其中放置有CAP源支架和三維平移臺(米思自動化儀器有限公司,型號:LWX60-1200和LWE4090),分別用于放置圖1(b)所示的RF-APGD等離子體射流發生器和種植體外培養細胞的96孔板。

1.4 細胞致死率測量

利用RF-APGD等離子體射流對96孔板中的體外培養細胞進行不同時間的處理,以對比不同劑量等離子體處理對細胞存活率的影響。CAP射流處理完成后,裝有HEK293細胞的96孔板被置于細胞培養箱中培養24 h,再利用MTT試劑盒(北京雷根生物技術有限公司)和酶標儀獲得每個細胞培養孔中的吸光度,進而計算得到每個孔中的細胞存活率(ξ),即

(1)

其中,A為吸光度數值,Acontrol為對照組對應的吸光度數值,下標t為處理時間,單位為分鐘(min)。對照組細胞不進行RF-APGD等離子體射流處理,其他培養條件與實驗組細胞完全一致。

1.5 統計學分析方法

細胞存活率實驗數據以均數±標準差表示,并采用統計軟件Prism進行單因素方差分析(ANOVA),其中,****p<0.000 1代表統計學上有著顯著差異。

2 實驗結果與分析

2.1 RF-APGD等離子體特性

本研究中利用RF-APGD等離子體射流對HEK293細胞進行處理時,對應的放電特性如圖3所示。可以看到,實驗測量得到的放電電壓(U)和電流(Id)波形具有類似正弦波的形狀,僅在正負峰值附近存在微小的變形,這說明本研究采用的RF-APGD為均勻、穩定的輝光放電。實驗測量得到的放電電壓和電流均方根值分別為Urms=211.1 V和Irms=1.36 A。

t/ns

利用光纖光譜儀獲得的等離子體射流發射光譜特性如圖4所示,采集時光纖探頭置于圖1(b)中錐形亞克力管的末端側面處?？梢钥吹?RF-APGD等離子體射流包含種類豐富的活性粒子,除了與工作氣體(高純氦)相關的粒子外,還包含了與空氣中的氮、氧相關的粒子,如O、OH、N2等,這與Li等報道的AP-DBD等離子體射流的發射光譜類似[12]。在等離子體生物醫學等領域,普遍認為活性氧氮粒子(Reactive oxygen nitrogen species,RONS)在對生物材料的處理過程中起著重要的作用[18-20]。此處需要強調的是,由于發射光譜所給出的是不同波長譜線的相對強度,因此無法通過對比RF-APGD和AP-DBD等離子體射流的光譜相對強度來直接判斷兩種等離子體射流中活性粒子濃度的相對大小,這也是后續研究中需要進一步深入開展的工作。

2.2 實驗參數的初步選擇

體外細胞實驗從最初的細胞復蘇階段到實驗完成,往往需要一周以上時間。為了提高實驗效率,在較短時間內獲得準確可靠的結果,本研究首先開展實驗參數的初步選擇實驗,以獲得有關等離子體射流作用距離和作用時間的參數窗口,從而為提高細胞實驗的效率和可靠性提供基礎。

λ/nm

首先,考慮到在Li等的工作中,AP-DBD等離子體發生器出口處外接的亞克力管長度為2 cm[12],即等離子體處理距離固定為2 cm,而本研究采用的處于α放電模式的RF-APGD等離子體射流長度一般在毫米量級,若仍采用2 cm的處理距離可能導致實驗效果并不顯著。因此,本小節首先針對等離子體處理距離和放電功率的選擇開展了實驗研究。結果表明,在處理距離2 cm、處理時間1～10 min條件下,即使當射頻放電的功率達到50 W時,實驗組細胞與對照組細胞(無等離子體處理)的存活率均無顯著統計學差異?？紤]到實際應用中,RF-APGD等離子體的處理距離一般在毫米量級[21],我們將等離子體處理距離縮小為5 mm。在此處理距離下,當放電功率在30～50 W范圍內變化時,相應的實驗結果表明,在相同的處理時間下,實驗組細胞與對照組細胞的存活率具有顯著的統計學差異,且隨著處理時間增長,細胞存活率下降。因此,在后續實驗中,綜合考慮等離子體發生器的放電特性,特別是等離子體射流長度以及液氮冷卻狀態的調控,將RF-APGD的放電功率和等離子體射流的處理距離分別固定為30 W和5 mm。

其次,我們將處理時間在較大的范圍內變化以初步確定細胞50%存活率對應的處理時間范圍,從而為后續實驗中處理時間的選擇提供依據。實驗結果表明,當等離子體處理時間為0(對照組)、1、3、5、7、10 min時,對應的細胞存活率依次為100%、93.21%、85.12%、54.53%、46.61%和37.40%。由此可以得到初步的結論:體外細胞存活率50%對應的處理時間范圍在5～7 min之間。因此,在后續的實驗中,采用的等離子體處理時間為t=1、4、5、6、7、8、9、10、12、16、20 min,每個處理時間的實驗至少重復3次以獲得具有統計學意義的結果。其中,處理時間為5、6和7 min的實驗組需要重點關注,重復次數均為5次以上,從而排除偶然因素對實驗結果的影響。此外需要說明的是,本論文所采用的RF-APGD等離子體發生器具有良好的放電穩定性,在放電持續至少20 min的過程中,放電模式、放電電壓和電流以及等離子體發射光譜均無明顯變化,這在很大程度上保證了等離子體生物學效應的可重復性。

2.3 RF-APGD等離子體有效功率的計算

在本文研究中,將有效功率定義為射頻放電功率中,被流經發生器的氣體吸收、進而轉化為等離子體所消耗的功率。對于AP-DBD等離子體,Li等以其放電功率作為有效功率(Peff),并與處理時間(t)相乘得到有效注入能量(Weff)[12]。這是由于AP-DBD等離子體熱效應不明顯,幾乎所有外電路注入的功率都用于等離子體的產生。而對于RF-APGD等離子體來說,需要額外冷卻工作氣體才能獲得氣體溫度在20 ℃～24 ℃范圍內的射流。因此,有效功率的計算必須考慮傳熱導致的能量損失。一般來說,RF-APGD等離子體體系的能量損失主要包括電極壁面處的對流(Pconv)和導熱(Pcond)熱損失以及氣體宏觀流動(Pflow)熱損失[17]。因此,有效功率的計算方法為:

Peff=Pin-Pflow-Pconv-Pcond

(2)

其中,Pflow、Pconv和Pcond的推導過程和計算方法見文獻[17]。

表1 Tg、Tw和THe,in測量結果Tab.1 The measured values of Tg,Tw and THe,in

計算RF-APGD等離子體體系的熱量損失還需要確定等離子體氣體溫度(Tg)、電極壁面溫度(Tw)和工作氣體的進氣溫度(THe,in)等參數,在本文實驗中采用低溫溫度計對以上幾個參數進行了3次測量,結果如表1所示。由此可以估算得到Pflow、Pconv和Pcond的數值分別為4.03、14.85和10.13 W,即有效功率Peff的數值為0.99 W。該數值相對于放電功率30 W來說要小得多。He等的研究指出,對于射頻電源驅動的輝光放電等離子體來說,注入等離子體體系的有效功率為輸入功率的5%左右[22],這在一定程度上佐證了本文估算所得到的RF-APGD的有效功率數值是可靠的。另外,從上述數據也可以看到,相對于大氣壓介質阻擋放電,RF-APGD中用于產生等離子體的有效功率占放電功率的比例非常低,即能量利用效率很低。在今后的研究中,還需要深入研究RF-APGD體系的能量輸運機制,進一步提高放電過程中的能量利用效率。

2.4 RF-APGD等離子體劑量評估

不同處理劑量條件下,利用RF-APGD等離子體射流處理體外培養的HEK293細胞的存活率結果如圖5所示。對照組細胞不經過等離子體處理,其對應的等離子體劑量為0,對應于等離子體處理時間為1、4、5、6、7、8、9、10、12、16、20 min的等離子體劑量分別為11.94、47.76、59.70、71.64、83.58、95.52、107.46、119.40、143.28、191.04、238.80 mJ·cell-1。其中,每組數據均與對照組進行對比,****p<0.000 1代表兩組數據在統計學上有著顯著差異。

為了獲得RF-APGD等離子體射流處理HEK293細胞的LD50數值,在得到圖5所示的實驗數據后,可以用統計學軟件擬合得到細胞存活率(ξ)隨log(Weff/N)數值變化的曲線,如圖6所示。該擬合曲線亦呈“S”型,與圖2所示的采用AP-DBD等離子體射流條件下的擬合曲線形狀類似。圖6的實驗結果表明,當RF-APGD等離子體射流的作用劑量較小時,其對細胞的損傷作用同樣不明顯,細胞存活率曲線近似為一條平行于橫軸的直線;而隨著等離子體劑量的增加,當超過某一數值后,細胞的存活率開始快速下降,這說明RF-APGD等離子體射流對細胞的殺滅作用開始占主導,大量細胞被殺死;而當細胞存活率低于10%后,其下降趨勢又變得平緩,形成了“S”形的結構。圖6中擬合曲線上對應于存活率ξ=50%的等離子體作用劑量為LD50=75.86 mJ·cell-1,即橫坐標log(Weff/N)=1.88的點。

(Weff/N)/(mJ·cell-1)

log(Weff/N)/(mJ·cell-1)

2.5 分析與討論

圖6擬合得到的LD50數值可為RF-APGD等離子體射流的實際應用提供劑量參考。例如,在f=13.56 MHz、Pin=30 W、Q=20 slpm、THe,in=7 ℃～11 ℃條件下,LD50數值對應的處理時間為381 s,說明在以等離子體促進作用為目標的RF-APGD等離子體應用中處理時間應低于這一數值,而對于以滅活作用為目標的應用中處理時間則需高于這一數值。而對于不同放電參數下的RF-APGD等離子體射流,則需先估算有效放電功率,再結合75.86 mJ·cell-1這一LD50數值,計算對應的處理時間,從而作為實際應用中處理時間的重要參考。

另一方面,與圖2所示的AP-DBD等離子體射流的LD50數值(34.67 mJ·cell-1)相比,對于同一種HEK293細胞,RF-APGD等離子體射流的LD50數值更高,但兩者仍在同一數量級范圍內。在后續的研究工作中,我們將繼續采用LD50-等離子體劑量評估方法開展系統的CAP源劑量研究,如利用這兩種典型的CAP射流源處理其他類型的體外培養細胞,并獲得對應的LD50數值,探索不同種類細胞對CAP射流處理的耐受性;又如采用其他更多類型的CAP源處理HEK293體外培養細胞,在深入理解等離子體-細胞相互作用機制的基礎上,明確不同種類等離子體源對同一種細胞作用劑量間的關系,建立詳實可靠的等離子體劑量數據庫,為推動等離子體生物醫學應用的快速發展提供理論指導。此外,我們還將圍繞作用距離對CAP劑量的影響開展更加細致的數值模擬和實驗研究工作,以形成適用于不同結構等離子體發生器的作用距離選取原則,進一步完善LD50-等離子體劑量評估方法。

3 結論

本論文基于Li等提出的LD50-等離子體劑量評估方法[12],開展了RF-APGD等離子體射流處理HEK293細胞的劑量學研究,主要得到如下結論:

1)在本論文工作條件下得到的RF-APGD等離子體射流處理HEK293細胞的LD50=75.86 mJ·cell-1。雖然該數值較文獻[12]中采用AP-DBD等離子體射流處理HEK293細胞得到的LD50值(34.67 mJ·cell-1)偏大,但二者仍在同一數量級范圍內。

2)本論文研究工作進一步證明了LD50-等離子體劑量評估方法的可靠性、便捷性和通用性。而另一方面,在未來的工作中,還應基于LD50-等離子體劑量評估方法,開展多種CAP源處理多種類型體外培養細胞的LD50實驗研究,從而形成詳實可靠的等離子體劑量學數據庫,為推動CAP生物醫學應用的發展提供理論指導。

聲明：李靜,趙潞翔兩位作者對本論文貢獻一致。