橙色紅曲菌Ku70基因缺失菌株的構建及功能分析

焦雪雪,李燕萍*

(南昌大學a.食品科學與技術國家重點實驗室;b.中德聯合研究院;c.食品學院,江西 南昌 330047)

紅曲菌是一種重要的傳統藥食同源菌,能夠產生多種對人體有益的代謝產物,其以粳米為基質培養得到的紅曲米具有除濕痰、化血化瘀和健脾消食等藥用功能[1-3]。紅曲菌的有益代謝產物Monacolin K是一種高效降脂產品[4],代謝產物色素是一種應用廣泛的天然食用色素,可作為多種慢性疾病甚至癌癥的潛在治療物[5],所以紅曲菌是一種在醫療工業中具有重要意義的商業生物。但是紅曲菌產生的有益代謝產物產量偏低,且能產生具有腎毒性、肝毒性和致癌活性的桔霉素,嚴重限制了紅曲菌的應用[6-8]。近年來,多項研究涉及在提高紅曲菌有益代謝產物的同時抑制甚至消除桔霉素的產生,通常采用三種策略來實現。第一種是優化生理生化過程,包括培養基選擇、培養參數(pH值、溶氧量、時間)和發酵模式(補料分批或連續模式)[2,9-11]。第二種策略是突變選育,利用物理、化學等因素誘發生物產生突變,然后通過大量的篩選工作來獲得桔霉素含量降低的菌株[12]。第三種策略是通過基因編輯技術,構建基因敲除菌株或異源表達菌株來研究生物體某一段基因的生理功能,推斷出其代謝途徑,進而引導其代謝流向有益方向[13-15]。

基于同源重組的基因敲除工程菌的構建是研究紅曲菌代謝途徑和改造紅曲菌株的有效方法。該方法的轉化效率與生物體內非同源末端連接(non-homologous end joining,NHEJ)和同源重組修復(homo-logous recombination,HR)兩種DNA雙鏈斷裂修復機制有關[16]。但由于真菌中NHEJ相對于HR具有極大優勢,導致真菌中基因靶向效率低。在研究絲狀真菌某基因簇功能時,通常需要敲除多個基因,通過大量的篩選工作才能得到陽性敲除菌株[17]。由于生物體內HR和NHEJ存在相互競爭的關系,故可以通過抑制NHEJ途徑而提高HR發生概率[18]。真核生物中的NHEJ系統與DNA依賴蛋白激酶密切相關,Ku70/80異源二聚體是DNA依賴蛋白激酶的主要組成部分[19]。其中Ku70和Ku80具有序列保守性,Ku70和Ku80在生物體內具有序列保守性,常被用來研究生物體內NHEJ途徑,以及通過抑制其表達來提高基因敲除效率[20]。

圓紅冬孢酵母(Rhodosporidiumtoruloides)的Ku70基因缺陷后,目標基因缺失頻率到90%以上[21]。通過CRISPR技術敲低Ku70基因將豬胎兒成纖維細胞的同源重組的效率提高到1.85倍[22]。缺失Ku70可將斯達氏油脂酵母(LipomycesStarkeyi)基因打靶效率從10%提高到50%～100%[23]。敲除紅色紅曲菌M7的Ku70/80基因,同源重組效率提高2～3倍[24]。構建Ku70基因缺失菌株是提高紅曲菌同源重組效率的有效途徑。

本實驗室前期對紅曲菌的研究工作中基因敲除效率低于20%,因此本研究將通過敲除紅曲菌中參與NHEJ途徑的Ku70基因來提高紅曲菌基因敲除效率,構建紅曲菌的高效基因敲除體系,為紅曲菌功能基因組學的研究工作提供優良菌株。

1 材料與方法

1.1 菌種和培養基

橙色紅曲菌(Monascusaurantiacus)AS3.4384:購于中科院微生物菌種保藏中心,在4 ℃斜面MES培養基上保存。大腸桿菌DH5α:本實驗室保存;農桿菌EHA105:中國科學院青島生物能源與過程研究所贈送;質粒pCAMBIA1300:中國科學院青島生物能源與過程研究所贈送;質粒pUC18-hph:本實驗室構建。MES培養基:取500 g麥芽粉碎后加入2 L水,60 ℃糖化4 h,過濾收集濾液并煮沸,加入蛋清再次過濾,用水將濾液的波美度調至6,加入20 g·L-1瓊脂粉,121 ℃滅菌15 min。MPPY液體培養基:40 g·L-1葡萄糖,2 g·L-1Yeast Extract,3 g·L-1NaNO3,0.5 g·L-1KCl,0.5 g·L-1MgSO4·7H2O,0.01 g·L-1FeSO4·7H2O,121 ℃滅菌15 min。G25N培養基:3 g·L-1NaNO3,1 g·L-1K2HPO4,0.5 g·L-1KCl,3 g·L-1NaNO3,0.5 g·L-1KCl,0.5 g·L-1MgSO4·7H2O,0.01 g·L-1FeSO4·7H2O,5 g·L-1Yeast Extract,30 g·L-1蔗糖,15g·L-1瓊脂粉,121 ℃滅菌15 min。

1.2 Ku70蛋白的鑒定和同源性分析

以紅色紅曲菌Ku70蛋白序列(GenBank登錄號:AGF90043.1)為同源序列,在橙色紅曲菌AS3.4384的蛋白質組中進行同源搜索,將得到的Ku70蛋白序列提交至NCBI上,在Conserved Domains數據庫中進行搜索,分析其保守的結構域并預測功能。

將紅曲菌AS3.4384Ku70基因編碼的氨基酸序列提交至NCBI數據庫進行blastp分析,搜索與Ku70蛋白質序列同源性較高的生物序列,進行序列同源性比較。

1.3 pCAMBIA-△Ku70打靶載體的構建

使用NCBI分析紅曲菌AS3.4384的核酸序列后,確定Ku70基因的位置及其上下游序列。根據重疊延伸PCR和無縫克隆的原理設計引物,并以AS3.4384基因組DNA為模板分別擴增Ku70 5’和Ku70 3’片段,以質粒pUC18-hph為模板擴增hph片段為抗性基因,通過重疊延伸PCR的方法將上述3個片段連接起來獲得Ku70基因敲除盒。采用PCR的方法將載體pCAMBIA1300線性化。最后使用無縫克隆試劑盒將Ku70基因敲除盒與線性化載體連接,獲得打靶載體pCAMBIA-△Ku70。打靶載體構建原理如圖1所示,所需引物如表1所示。

1.4 農桿菌介導的紅曲菌轉化

紅曲菌的轉化借助農桿菌介導的T-DNA轉化技術來實現[25]。出發菌株為AS3.4384,農桿菌為EHA105。轉化過程中農桿菌EHA105的培養所用的培養基為含20 μg·mL-1利福平和30 μg·mL-1Kana的LB培養基,農桿菌EHA105介導的紅曲菌轉化所用的篩選平板為含150 μg·mL-1潮霉素和200 mM頭孢霉素的MES平板。

圖1 pCAMBIA-△Ku70打靶載體構建示意圖Fig.1 Schematic diagram to construct pCAMBIA-△Ku70 targeting vector

表1 Ku70缺失菌株構建所需引物Tab.1 Primers of ku70-deficient strains were constructed

1.5 轉化子的篩選及基因組DNA提取

挑取單菌落轉化子到含150 μg·mL-1潮霉素的MES平板上,復篩轉化子,28 ℃培養至菌落呈現紅色,將其轉接到5 mL MPPY液體培養基中,28 ℃,200 rpm培養至長出少量菌絲后,雙層濾紙過濾,收集菌絲體,使用玻璃珠法提取基因組DNA[26]。

1.6 PCR驗證轉化子

以1.5中提取的轉化子基因組DNA為模板,分別用287/288,289/507以及508/292三對引物,進行PCR驗證,篩選出驗證正確的Ku70基因缺失菌株。基因敲除原理如圖2所示。

圖2 紅曲菌Ku70基因缺失菌株驗證原理圖Fig.2 Schematic diagram of validation of Monascus Ku70 gene deletion strain

1.7 單孢分離

將經PCR驗證的候選轉化子接種到含0.1% Triton X-100和150 μg·mL-1潮霉素的MES平板上,28 ℃,培養3 d;洗下閉囊殼,稀釋后涂布在含0.1% Triton X-100和150 μg·mL-1潮霉素MES平板上,培養3 d;重復分離純化一次;按1.5和1.6方法提取基因組DNA并進行PCR驗證。

1.8 Ku70基因缺失菌株的生物學特性分析

分析Ku70基因缺失菌株(AS△Ku70)的生物學特性,研究AS△Ku70和起始菌株AS3.4384間的菌落形態、孢子產量以及紅曲色素產量的差異變化。

1.8.1 菌落形態觀察

在MES和G25N平板上分別接種2 μL 1×105個·mL-1的AS3.4384和AS△Ku70菌株的孢子懸浮液,28 ℃培養10 d,觀察菌落大小及菌絲形態、顏色等表現型。

1.8.2 紅曲菌孢子計數

挑取菌株AS3.4384和AS△Ku70菌絲到50 mL的MPPY液體培養基中,28 ℃,200 r·min-1,培養至菌絲開始產生色素。分別取1 mL菌液涂布到MES平板上,28 ℃培養16 d,加適量孢子洗液洗脫孢子,生理鹽水洗滌兩次,用血球計數板計數。洗下孢子后加熱余下的培養基直至融化,過濾后純水沖洗菌絲,收集菌絲體烘干后稱重。

1.8.3 紅曲色素的測定

接種105個AS3.4384和AS△Ku70孢子在含有50 g大米的大米培養基中,28 ℃靜置培養,每天混勻兩次,在第6、8、10、12、14、16和18 d取0.5 g樣品,測其色素含量。色素的測定方法參考國標:《中華人民共和國國家標準 食品添加劑 紅曲米GB4926-85》。

1.9 同源重組效率統計

基于同源重組原理和無縫克隆技術構建帶有G418抗性基因的置換型Rab6和Rab17基因敲除打靶載體,然后借助1.4農桿菌轉化法將打靶載體分別轉入AS3.4384和AS△Ku70菌株,轉化條件保持一致,根據1.5、1.6和1.7方法篩選并進行PCR擴增來驗證轉化子,統計轉化子的同源重組效率。

2 結果

2.1 Ku70蛋白的鑒定及同源性分析

通過對Ku70蛋白結構域的分析(圖3A),發現Ku70基因編碼的蛋白是KU家族蛋白的一個亞基,KU家族的蛋白質參與非同源末端連接,用于修復雙鏈DNA斷裂。

將橙色紅曲菌AS3.4384的Ku70基因編碼的氨基酸序列提交至NCBI蛋白數據庫進行比對,搜索與Ku70基因編碼的氨基酸序列同源性較高的生物序列,進行多重序列比對,結果如圖3B所示。Ku70基因編碼的氨基酸序列與紅色紅曲菌(Monascusruber,GenBank:KC192955.1)、紫色紅曲菌(Monascuspurpureus,GenBank:TQB71160.1)的同源性分別為96.43%、96.75%,說明Ku70蛋白在紅曲菌屬中高度保守。AS3.4384的Ku70蛋白與米曲霉(Aspergillusoryzae,GenBank:AB214649.1)、土曲霉(A.terreus,GenBank:GES65941.1)、黑曲霉(A.niger,GenBank:GAQ40800.1)的同源性分別為72.71%、73.12%、69.13%。

2.2 pCAMBIA-△Ku70打靶載體的構建

使用NCBI分析紅曲菌AS3.4384的核酸序列后,確定Ku70基因的位置及其上下游序列。PCR擴增上游964 bp的序列為Ku70 5’(圖4A泳道1)和下游961 bp的序列為Ku70 3’(圖4A泳道3)。

圖3 Ku70蛋白結構域分析(A)和Ku70蛋白多重序列比對圖(B)Fig.3 Ku70 protein domain analysis (A) and multiple sequence alignment diagram of Ku70 protein

PCR擴增質粒pUC18-hph中3 060 bp的hph片段為抗性基因(圖4A泳道2)。通過重疊延伸PCR的方法將三個片段連接起來,得到4 966 bp的Ku70基因敲除盒(圖4A泳道4)。選擇pCAMBIA1300為模板,采用PCR的方法獲得6 800 bp的線性化載體(圖4A泳道5)。

使用無縫克隆試劑盒將上述純化后的目的片段和載體連接起來后,通過鈣轉感受態細胞的方法將連接產物轉入DH5α感受態細胞中,挑取單菌落進行菌液PCR驗證。首先使用引物473/474擴增Ku70基因敲除盒(4 966 bp,圖4B泳道1～5),選出陽性克隆子并提取質粒。為進一步驗證該陽性克隆子,以質粒為模板,使用引物473/474,327/473,329/328和474/330分別擴增Ku70基因敲除盒(4 966 bp,圖4C泳道1)、Ku70 5’(947 bp,圖4C泳道2)、hph(3 060 bp,圖4C泳道3)和Ku70 3’片段(944 bp,圖4C泳道4)。

2.3 紅曲轉化子的篩選和鑒定

借助農桿菌介導的T-DNA轉化技術將pCAMBIA-△Ku70打靶載體轉入出發菌株AS3.4384中,得到113個轉化子,選取菌落顏色為紅色的85個轉化子進行復篩,培養3 d后,得到83個生長狀態良好的轉化子。選取其中36個轉化子繼續傳代并進行單菌落分離,提取其基因組DNA,進行PCR驗證。

以轉化子基因組DNA為模板,使用3對引物287/288、289/507和508/292進行PCR驗證。初次篩選確定30號轉化子為AS△Ku70異核體菌株,擴增出Ku70 5’同源交換片段和Ku70 3’同源交換片段,但是也能擴增出Ku70缺失片段。對該菌株進行單孢分離后,再次進行PCR驗證,轉化子未能擴增出327 bp的Ku70缺失片段(圖5A泳道1),但能擴增出3 642 bp的Ku70 5’同源交換片段(圖5B泳道1)和3 172 bp的Ku70 3’同源交換片段(圖5B泳道4),確定該轉化子為AS△Ku70純合子菌株。

(A) Ku70基因敲除載體構建。M:DL15000;泳道1:Ku70 5’;泳道2:hph片段;泳道3:Ku70 3’;泳道4:Ku70 5’-hph-Ku70 3’融合片段;泳道5:pCAMBIA1300線性化片段(B)打靶載體pCAMBIA-△Ku70轉化子菌液PCR驗證。M:DL15000;泳道1～5:轉化子菌液;泳道6:陽性對照;泳道7:陰性對照;泳道8:空白對照(C)打靶載體pCAMBIA-△Ku70質粒PCR驗證。M:DL15000;泳道1:Ku70 5’-hph-Ku70 3’融合片段;泳道2:Ku70 5’;泳道3:hph;泳道4:Ku70 3’

2.4 Ku70基因缺失菌株的生物學特性分析

2.4.1 菌落形態觀察

將AS3.4384和AS△Ku70菌株分別接種到MES和G25N平板上,28 ℃培養10 d,觀察菌落大小及菌絲形態、顏色等表現型差異。如圖6A所示,AS△Ku70菌株在MES和G25N平板上的菌落大小與出發菌株AS3.4384基本一致,說明其生長速度與出發菌株基本沒有差異,Ku70基因的缺失并不影響紅曲菌的生長繁殖。AS△Ku70菌株的菌落形態與出發菌株相比無明顯差距,說明Ku70基因的缺失并不影響紅曲菌的菌體結構。

(A)紅曲菌轉化子Ku70缺失片段的PCR驗證。M:DL2000;泳道1:轉化子;泳道2:AS34384;泳道3:pCAMBIA-△Ku70質粒。(B)紅曲菌轉化子同源交換片段PCR驗證。M:λ-HindⅢ;泳道1～3:轉化子、AS34384、pCAMBIA-△Ku70質粒,擴增Ku705’端同源交換片段;泳道4～6:轉化子、AS34384、pCAMBIA-△Ku70質粒,擴增Ku703’端同源交換片段。

2.4.2 紅曲菌的孢子產量

將AS3.4384和AS△Ku70菌株在MES平板上培養16 d后,收集其孢子并使用血球計數板計數,同時測定菌絲體干重,將紅曲菌產孢能力用每克菌絲體能夠產生的孢子數量來衡量。如圖6B所示,AS3.4384的產孢能力為2.26×107個·g-1,AS△Ku70的產孢能力為2.41×107個·g-1。表明AS△Ku70菌株與出發菌株AS3.4384相比其產孢能力和生長繁殖能力幾乎無差距,Ku70基因的缺失并不影響紅曲菌的產生孢子的能力和生長繁殖,可將AS△Ku70菌株作為出發菌株進一步敲除紅曲菌其他基因。

2.4.3 紅曲色素產量比較

將AS3.4384和AS△Ku70菌株接種到大米培養基中,28 ℃靜置培養,每天混勻兩次,在第6、8、10、12、14、16和18 d取0.5g樣品,以紅曲米提取液在420、470、505 nm下的吸光值來分別計算紅曲菌株產黃色素、橙色素和紅色素的產量,如圖6C所示,培養18 d后,AS3.4384菌株的總色素產量為1304 U·g-1,AS△Ku70菌株的總色素產量為1 330 U·g-1,無明顯差異。因此Ku70基因缺失不會影響紅曲色素的生物合成。

(A)菌落形態比較

(B) 產孢能力

(C) 色素產量圖6 Ku70基因缺失菌株的生物學特性分析Fig.6 Analysis of biological properties of Ku70 gene deletion strain

2.5 同源重組效率比較

以AS△Ku70菌株為起始菌株,AS3.4384菌株為對照菌株,使用相同的方法,分別敲除Rab6和Rab17基因,同源重組效率如表2所示。使用AS△Ku70菌株進行Rab6和Rab17基因敲除,轉化子數量相對AS3.4384菌株減少約58%～65%,同源重組效率從0%～2.7%提高至15%～18.7%左右,提高了約6倍以上。

表2 AS3.4384和AS△Ku70的同源重組效率Tab.2 Homologous recombination efficiency of AS3.4384 and AS△Ku70

3 討論

紅曲菌作為傳統的藥食同源微生物,可產生多種有益的代謝產物和具有毒性的桔霉素[27]。構建基因敲除工程菌是研究紅曲菌代謝途徑和改造紅曲菌株的有效方法[13-15]。紅曲菌基因工程菌的構建過程包括打靶載體的構建、紅曲菌的制備、轉化和陽性轉化子篩選及驗證。該方法存在以下障礙:打靶載體復雜導致構建時間長、紅曲菌含有剛性的細胞壁導致的轉化效率低和同源重組發生概率低等。

打靶載體的常規構建方法是采用酶切酶連的克隆技術,該方法受限于酶切位點而不能隨意在載體上插入目的基因,且實驗周期長。本研究使用無縫克隆技術構建載體具有如下優勢:可以不受載體酶切位點限制,將目的基因插入在所需要的位置;載體線性化可不依賴限制性內切酶,通過PCR的方式即可獲得;連接載體與目的片段時不需要使用連接酶,直接用同源重組的方法20 min即可完成;陽性率高,減少了篩菌工作[28]。本研究構建打靶載體時需要借助無縫克隆不受載體酶切位點限制的優勢,將Ku70 5’-hph-Ku70 3’融合片段與pCAMBIA1300載體上原有的hph基因進行置換。與普通克隆相比,本研究選擇無縫克隆的方法構建pCAMBIA-△Ku70打靶載體縮短實驗周期,提高工作效率。

常見的絲狀真菌轉化方法有聚乙二醇介導的原生質體轉化、農桿菌介導的轉化和電穿孔轉化。聚乙二醇介導的轉化和電穿孔轉化都需要原生質體作為受體細胞,且對原生質體的質量要求高[29-30]。電穿孔轉化還需要昂貴的儀器設備[31]。農桿菌介導的轉化使用分生孢子即可,還具有高轉化頻率、高基因替換頻率、T-DNA單拷貝整合等優點[32]。

本研究構建Ku70基因缺失菌株時曾嘗試使用原生質體介導的原生質體轉化,但由于得到的原生質體質量不佳、轉化技術不到位等原因,重復若干次實驗,原生質體再生率僅20%左右。轉化后得到的轉化子質量差,有的轉化子產生紅色色素卻生長的氣生菌絲較少,有的轉化子鋪滿整個平板無法篩選出單菌落。改用農桿菌介導的轉化后,僅做了兩次實驗便成功得到了陽性菌株。第一次實驗失敗的原因是篩選培養基中頭孢霉素添加不足導致轉膜后農桿菌泛濫生長抑制了紅曲轉化子的生長,第二次實驗便成功得到了113個轉化子,隨機選取36個轉化子進行分離鑒定成功篩選到陽性克隆子。故本研究選擇農桿菌介導的轉化也是提高紅曲菌基因敲除效率的有效途徑。

基因敲除效率與紅曲菌體內的HR和NHEJ兩種DNA雙鏈斷裂修復有關。由于HR僅在存在相同染色體作為模板的時候發生,而NHEJ不需要同源染色體,所以NHEJ是生物體內修復DNA雙鏈斷裂的主要途徑,HR相對來說發生概率比較低[33]。有研究發現,Ku70蛋白是細胞核中的基于NHEJ途徑的DNA修復因子,且NHEJ與HR在生物體內具有競爭性,可通過抑制NHEJ途徑來提高HR途徑的發生概率[34]。本研究構建了Ku70基因缺失菌株AS△Ku70,且分析AS△Ku70與AS3.4384的表現型及主要的代謝產物色素的產量的差異分析結果,證實Ku70基因的缺失對紅曲菌的菌落形態、大小、產孢能力及紅曲色素的代謝都幾乎沒有影響(圖6)。分析AS△Ku70與AS3.4384的同源重組效率發現,Ku70基因缺失菌株的轉化子數量減少約58%～65%,且同源重組效率提高約6倍以上。該結果可能與Ku70基因參與紅曲菌的NHEJ途徑相關,AS△Ku70中,發生NHEJ的效率降低,打靶載體隨機插入的轉化子數量減少,發生HR的轉化子相對增加。后續可以通過優化轉化條件提高AS△Ku70中的同源重組效率。

4 結論

本研究采用無縫克隆的技術手段,以橙色紅曲菌AS3.4384為出發菌株,hph為抗性基因,構建了pCAMBIA-△Ku70打靶載體。借助農桿菌轉化法將打靶載體轉入出發菌株中,得到驗證正確的突變體AS△Ku70。通過分析AS△Ku70菌株與AS34384菌株在菌落形態、產孢能力、代謝產物的產量及同源重組效率,得知Ku70基因并不參與紅曲菌生長發育繁殖、初級代謝途徑和次級代謝途徑,且敲除Ku70基因同源重組效率提高6倍以上。AS△Ku70有望成為研究紅曲菌代謝途徑的優良菌株,為后續構建紅曲菌的基因敲除工作提供便利。