SCAMP2在結直腸癌中的表達及其意義

喬業華 郭棟 王璐 曲婷婷 張翔雁 邢曉明

(1 青島大學基礎醫學院病理學系,山東 青島 266071; 2 青島大學附屬醫院胃腸外科; 3 青島大學附屬醫院病理科)

目前,結直腸癌(colorectal cancer,CRC)是世界上人群中發病率、致死率位列前3位的惡性腫瘤[1］。隨著醫療技術的提高,臨床上多采用化療聯合放療和免疫療法,以提高治療效果,但是仍有部分患者治療后出現復發或轉移,嚴重影響患者的生活質量,因此尋找更有效的CRC治療的靶點尤為重要。分泌載體膜蛋白(SCAMPs)是具有4個跨膜結構的載體蛋白,參與高爾基體與后高爾基體循環的轉運,SCAMPs保守蛋白包括SCAMP1～SCAMP5 5個亞型[2-3］。目前關于SCAMP2的研究主要限于其在囊泡轉運、胞吞胞吐中的作用。而且研究發現,與癌旁正常組織相比較,SCAMP2在胰腺癌腫瘤組織以及血液系統腫瘤之中高表達[4-5］,但尚未有研究揭示SCAMP2在CRC組織中的表達情況。本研究通過免疫組織化學法檢測SCAMP2在CRC中的表達水平,并且通過臨床病理分析探討SCAMP2在CRC發生發展中的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2014年1月—2016年8月青島大學附屬醫院309例原發性CRC患者術中的CRC組織和癌旁正常組織標本,納入標準為術前未行放、化療者。同時收集患者的年齡、性別、淋巴結轉移情況以及腫瘤分化程度、大小、TNM分期、浸潤程度、微衛星不穩定性(MSI)、KRAS和NRAS突變情況等一般臨床資料。電話隨訪患者生存時間、生存狀態等信息,隨訪截至2022年12月3日。

1.2 方法

1.2.1組織芯片的制備及免疫組織化學染色 將309例石蠟包埋的CRC組織和癌旁正常組織標本,使用組織儀分別制備成2.0 mm孔徑、4 μm厚的組織芯片。將CRC以及癌旁正常組織的芯片依次放入盛有二甲苯、梯度乙醇的玻璃缸中脫蠟、水化,之后放入檸檬酸鈉抗原修復液中,加熱至100 ℃后持續2 min,冷卻至室溫,置于30 g/L過氧化氫溶液中浸泡20 min后,滴加山羊血清于取出的組織芯片上,室溫下反應30 min。然后滴加SCAMP2一抗稀釋液(1∶800,北京中杉金橋生物科技有限公司,TA506991,OTI3C2)于組織芯片上,同時將僅滴加抗體稀釋液的組織芯片(北京中杉金橋生物科技有限公司,ZLI-9029)作為陰性對照,4 ℃過夜。滴加通用型二抗(北京中杉金橋生物科技有限公司)至組織芯片中并室溫反應2 h,滴加DAB顯色液,蘇木素溶液復染,氨水分化后脫水,滴加中性樹膠封片,置于光學顯微鏡下對染色結果進行評分。

1.2.2免疫組織化學染色結果判讀 由2名病理醫師隨機選擇至少5個高倍視野評價SCAMP2染色情況,選取的高倍視野染色情況存在差異時則以占比多的染色結果為準,2位醫師結果不同時由第三名病理醫師重新進行評分。SCAMP2陽性評定標準為細胞核或細胞漿染色為棕黃色。染色強度評分標準:0分為無著色,1分為淡黃色,2分為棕黃色,3分為棕褐色。以染色強度≥2分為SCAMP2高表達,以染色強度<2分為SCAMP2低表達[6］。

1.3 統計學處理

采用SPSS 23.0軟件對數據進行統計學處理。SCAMP2在CRC組織與癌旁正常組織中的表達評分比較采用t檢驗,與臨床病理特征的關系分析采用Pearsonχ2檢驗;生存分析采用Log rank檢驗以及Kaplan-Meier法,采用Graphpad Prism 7軟件繪制生存曲線。以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 兩種組織中SCAMP2表達水平比較

免疫組織化學染色結果顯示,SCAMP2在癌旁正常組織中呈高表達,在CRC組織中呈低表達(圖1)。309例CRC組織中SCAMP2高表達者120例,低表達者189例;309例癌旁正常組織樣本中SCAMP2呈高表達者232例,低表達者77例,CRC組織及癌旁正常組織中SCAMP2的表達水平差異具有顯著性(t=5.042,P<0.05)。

2.2 SCAMP2與CRC患者臨床病理特征的關系

SCAMP2表達水平與患者腫瘤大小、MSI有關(χ2=6.953、4.923,P<0.05),而與年齡、性別、分化程度、淋巴結是否有轉移、TNM分期、浸潤程度、KRAS及NRAS突變情況無相關性(P>0.05)。見表1。

A:癌旁正常組織,B:CRC組織,200倍

表1 SCAMP2表達水平與患者臨床病理特征的關系[例］

2.3 SCAMP2表達與CRC患者預后的關系

依據SCAMP2在CRC組織中的表達水平情況,將所有患者分為SCAMP2高表達組120例和SCAMP2低表達組189例,Kaplan-Meier生存分析顯示,SCAMP2高表達組與低表達組患者的總體生存期分別為(91.481±3.634)、(81.312±2.145)月;SCAMP2高表達組與低表達組患者的無病生存期分別為(34.792±0.708)、(35.860±0.487)月,兩組患者的上述兩個指標比較,差異均無顯著統計學意義(P>0.05)。

3 討 論

CRC是臨床上常見的惡性腫瘤,多由腺瘤發展而來[7-9］。盡管診斷、治療CRC的技術不斷提高,但部分患者的治療效果仍不理想,常規治療難以改善患者預后[10-13］。因此探索CRC發生發展的分子機制,尋找相關的分子標記物在臨床上具有重要意義。SCAMPs家族共享四個疏水跨膜結構域(TMD1～4),N端由TMD1連接,高度保守的親水性E肽序列的兩端為TMD2與TMD3[14］。SCAMPs蛋白主要參與細胞膜轉運、內吞作用以及囊泡循環[15-17］。最近有研究顯示,SCAMP家族的表達水平及其變化會影響腫瘤的發生發展。YANG等[18］研究表明SCAMP1可以促進膽囊癌與胰腺癌細胞遷移與侵襲。VENUGOPALAN等[19］研究顯示,SCAMP3或可作為肺腺癌進展的負性調節因子。GE等[20］研究表明,原發性膠質瘤SCAMP4的低表達與患者的良好預后顯著相關,提示SCAMP4是腫瘤潛在的癌基因。MAO等[4］研究表明,SCAMP1、SCAMP5在胰腺癌中高表達,且具有作為診斷、預后因子的潛在臨床價值。上述研究提示,SCAMP家族蛋白在調節腫瘤的增殖、轉移等惡性表型方面發揮重要作用,但SCAMP2作為SCAMP家族中的關鍵蛋白在腫瘤中的研究較少,其作用機制也尚不明確。本研究通過免疫組織化學法檢測SCAMP2在CRC中的表達水平,探討其與CRC發生發展的關系。

SCAMP2的結構主要為4個高度保守的跨膜區域以及多個N端NPF重復的序列,EH結構域蛋白與NPF相互作用,進行囊泡的轉運[15］。BLONDEAU等[21］研究發現SCAMPs與參與物質運輸的網格蛋白共定位,提示SCAMP2同樣參與了細胞內物質轉運過程。本研究的免疫組織化學染色結果顯示,SCAMP2在細胞質以及細胞間質中均有分布,這可能與其轉運功能相關;同時病理特征分析結果表明SCAMP2的表達與腫瘤體積具有相關性,SCAMP2在CRC中低表達,且SCAMP2低表達患者腫瘤體積較大,提示SCAMP2可能與CRC的發生有關系,但還需進一步明確其在CRC中的具體作用機制。本研究顯示SCAMP2的表達水平與患者的年齡、性別、淋巴結轉移情況以及腫瘤分化程度、TNM分期、浸潤程度、KRAS和NRAS突變情況無明顯相關性,分析原因可能與本研究選用的標本全為CRC與癌旁正常組織,因此制作成的組織芯片中陽性細胞占比為100%。可見僅僅以染色強度作為唯一標準進行評價,SCAMP2表達水平與淋巴結轉移、腫瘤TNM分期等指標沒有表現出明顯的相關性。

中國CRC診療規范推薦將MSI以及KRAS、NRAS基因的篩查結果作為臨床上CRC復發、轉移和免疫用藥等的參考依據,因此,研究SCAMP2表達水平與MSI、KRAS和NRAS基因間的關系,探討SCAMP2的表達水平能否作為CRC復發以及用藥的參考依據,還是具有比較重要的臨床實際意義[22］。微衛星高度不穩定多發于Lynch綜合征患者,并且是CRCⅡ期患者預后良好的指標及氟尿嘧啶耐藥的靶點[23］。本研究結果顯示SCAMP2在CRC組織中高表達與存在MSI有關系,因此推測SCAMP2也可能是檢測Lynch綜合征的指標以及氟尿嘧啶化療耐藥的靶點。YUE等[5］研究發現,與健康人群相比較,急性髓系白血病患者的外周血中SCAMP2 mRNA的表達水平相對較高,且急性髓系白血病患者預后不良與SCAMP2 mRNA的高水平表達相關,提示SCAMP2是急性髓系白血病的潛在致病基因。MAO等[4］研究還發現,SCAMP1～SCAMP4在胰腺癌組織中的表達高于正常組織,但SCAMP2高表達與胰腺癌患者預后不良無關,這與本研究中SCAMP2在CRC組織中低表達結論相反,由此推測SCAMP2在不同組織器官中的表達水平可能與組織的生物學特性有關,即使是同一種蛋白在不同腫瘤組織的功能也會不同,如SCAMP3在肺腺癌組織中低表達,發揮抑癌因子的作用;而在胰腺癌組織中高表達,發揮促癌因子的作用。

綜上所述,SCAMP2在CRC組織中低表達,可能與CRC的發生發展具有相關性,其高表達可能與CRC腫瘤大小、MSI有關。但SCAMP2在CRC中發揮作用的分子機制還需進一步探討,SCAMP2能否作為早期診斷CRC的生物標志物尚待明確。

倫理批準和知情同意：本研究涉及的所有試驗均已通過青島大學附屬醫院醫學倫理委員會的審核批準(文件號QYFYWZLL27662)。所有試驗過程均遵照《全國臨床檢驗操作規程》的條例進行。受試對象或其親屬已經簽署知情同意書。

作者聲明：喬業華、郭棟、王璐、曲婷婷參與了研究設計;喬業華、張翔雁、邢曉明參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發表該論文。所有作者均聲明不存在利益沖突。