新型Hsp90/HDAC雙靶點抑制劑對乳腺癌細胞MDA-MB-231增殖、侵襲和遷移的影響及其機制

高笑 吳清蘭 鄧林 宋軍瑩 張麗 欒業鵬 張金平 侯琳

(1 青島大學基礎醫學院生物化學與分子生物學系,山東 青島 266071; 2 青島大學藥學院; 3 中國人民解放軍海軍第971醫院)

乳腺癌是全世界女性最常見的惡性腫瘤,盡管在診斷和治療方面取得了重大進展,但晚期乳腺癌患者的預后仍然非常不理想[1-3］。由于乳腺癌具有高度異質性,單一靶點藥物通常會出現敏感性差、毒副作用大、易產生耐藥性等問題[4-5］。因此,新型雙靶點小分子化合物的研發為解決這一問題提供了新的希望。

熱休克蛋白90(Hsp90)是一種常見的分子伴侶蛋白,與腫瘤的增殖、侵襲、轉移和凋亡等生物學行為密切相關,且在乳腺癌細胞中顯著高表達[6-7］。另外,負責調控組蛋白乙酰化過程的去乙酰化酶(HDAC)也在乳腺癌的發展過程中起著非常重要的作用[8］。大量研究顯示,HDAC抑制劑與Hsp90抑制劑聯合用藥對多種腫瘤的治療有效[9-12］,但目前在乳腺癌治療中的研究未見報道。有研究發現新型Hsp90/HDAC雙靶點抑制劑FXX-W-12-4對乳腺癌細胞具有顯著的抑制作用[13］。在此基礎上,本研究通過探討FXX-W-12-4對乳腺癌細胞MDA-MB-231抗腫瘤的作用及機制,旨在為Hsp90/HDAC雙靶點抑制劑的研發以及乳腺癌的治療提供有益的參考價值。

1 材料與方法

1.1 主要材料

人乳腺癌細胞系MDA-MB-231由青島大學基礎醫學院生物化學與分子生物學實驗室提供;CCK-8試劑盒以及BCA蛋白質定量試劑盒(北京索萊寶生物科技有限公司);GAPDH抗體、ac-H3抗體以及Hsp70抗體(武漢愛博泰克生物科技有限公司);Akt抗體、p-Akt抗體、mTOR抗體、p-mTOR抗體(上海賽信通生物試劑有限公司)。

1.2 細胞培養

將細胞培養于含體積分數0.12胎牛血清及體積分數0.01青鏈霉素混合溶液的高糖DMEM培養基中,置于37 ℃、含體積分數0.05的CO2恒溫培養箱中培養,待細胞生長至對數生長期且密度適宜時,用于后續實驗。

1.3 實驗方法

1.3.1CCK-8實驗檢測FXX-W-12-4對MDA-MB-231細胞活力的影響 取對數生長期的MDA-MB-231細胞,加入胰酶消化后接種至96孔板中,每孔約2 000個細胞。24 h后細胞貼壁且生長密度適宜時,將原培養液吸出,更換為含有不同濃度FXX-W-12-4(0、20、40、100、200、400、800 nmol/L)完全培養基。邊緣孔中加入無菌的PBS,防止培養基蒸發。將96孔板放入37 ℃、含體積分數0.05 CO2的恒溫培養箱中培養48 h后,每孔加入CCK-8試劑10 μL繼續孵育2 h。用酶標儀測定波長450 nm處各孔吸光度值,并計算細胞活力及半致死濃度(IC50),作為后續實驗中濃度設定的參考值。

1.3.2劃痕實驗檢測FXX-W-12-4對MDA-MB-231細胞遷移能力的影響 將處于對數生長期的MDA-MB-231細胞接種于6孔板中,每孔約5 000個細胞。待細胞融合度達到80%～90%時,使用1 000 μL槍頭垂直于培養板進行劃痕。使用無菌PBS洗去刮下的懸浮細胞后,每孔加入2 mL不含血清的培養基。將6孔板放入培養箱當中繼續培養12 h后,根據前面計算獲得的IC50的參考值,加入FXX-W-12-4終濃度為0、100、200、300 nmol/L(分別為A、B、C、D組)的無血清培養基繼續培養,各組細胞分別在培養第0、12、24、48 小時時用普通倒置顯微鏡拍照,并計算劃痕面積。

1.3.3Transwell實驗檢測FXX-W-12-4對MDA-MB-231細胞侵襲能力的影響 取Transwell小室放入24孔板中,將Matrigel基質膠鋪于Transwell上室中,置于培養箱中孵育1 h使其凝固。取對數生長期的MDA-MB-231細胞,胰酶消化后用無血清培養基重懸后,鋪于Transwell上室中,每孔約20 000個細胞,同時上室加入200 μL無血清培養基,下室加入800 μL完全培養基。于上室與下室中同時加入FXX-W-12-4使其終濃度為0、100、200、300 nmol/L(分別為A、B、C、D組)。將24孔板置于37 ℃、含體積分數0.05 CO2的恒溫培養箱中培養48 h后,取出小室。用棉簽輕輕擦去上室中的細胞和基質膠,PBS輕輕沖洗3次。40 g/L的多聚甲醛固定后,采用0.1%的結晶紫染液染色下室中細胞,顯微鏡下觀察,隨機選取5個100倍的視野進行拍照,并計算細胞侵襲率。

1.3.4Western Blot實驗法檢測FXX-W-12-4對MDA-MB-231細胞中ac-H3、Hsp70、Akt、mTOR、p-Akt及p-mTOR蛋白質相對表達量的影響 將MDA-MB-231細胞采用終濃度分別為0、100、200、300 nmol/L的FXX-W-12-4(分別為A、B、C、D組)處理48 h,PBS清洗3次,洗去懸浮細胞和雜質。加入RIPA蛋白裂解液充分裂解細胞后提取細胞總蛋白,BCA法測蛋白濃度。蛋白樣品于SDS-PAGE上電泳, PVDF轉膜后,以50 g/L的脫脂奶粉溶液常溫封閉2 h,TBST清洗3次,一抗4 ℃下孵育過夜,TBST清洗4次,二抗常溫孵育1 h。用ECL發光液按說明書進行孵育,成像儀顯影并進行拍照。以GAPDH的條帶結果為內參,將目的蛋白的條帶與內參條帶進行比較,并計算目的蛋白的相對表達量。

1.4 統計學處理

2 結 果

2.1 FXX-W-12-4對MDA-MB-231細胞活力的影響及其IC50值

CCK-8實驗檢測結果顯示,以終濃度為0、20、40、100、200、400、800 nmol/L的FXX-W-12-4處理MDA-MB-231細胞48 h后,MDA-MB-231細胞活力分別為(99.46±0.56)%、(91.38±0.79)%、(78.46±0.88)%、(74.59±0.93)%、(45.50±1.02)%、(41.69±0.79)%、(37.47±1.05)%。隨著FXX-W-12-4濃度的遞增,MDA-MB-231細胞的活力逐漸下降(F=2 663.00,P<0.05)。通過計算得出FXX-W-12-4作用MDA-MB-231細胞48 h后的IC50值為309.80 nmol/L。小于IC50值的濃度對細胞無毒性,因此選用0、100、200、300 nmol/L為后續實驗的濃度。

2.2 各組MDA-MB-231細胞遷移能力的比較

重復測量設計的方差分析結果顯示,組別、時間及其交互作用對MDA-MB-231細胞的遷移能力均具有顯著性的影響(F組別=242.53,F時間=341.78,F組別*時間=152.14,P<0.05)。單獨效應分析結果顯示,隨著時間的延長,A～D組MDA-MB-231細胞的遷移能力逐漸增強(F=34.14～153.46,P<0.05);與A組相比,B～D組細胞在第12、24、48小時時的遷移能力明顯降低(F=86.47～212.59,P<0.05)。見表1。

2.3 各組MDA-MB-231細胞侵襲能力比較

Transwell實驗的結果顯示,A～D組的細胞侵襲率分別為(89.99±6.12)%、(62.84±2.34)%、(30.07±4.62)%、(12.24±2.27)%。隨著FXX-W-12-4濃度的升高,MDA-MB-231細胞侵襲能力逐漸降低(F=68.67,P<0.05)。各組間兩兩比較差異具有顯著統計學意義(t=4.14～11.92,P<0.05)。見圖1。

表1 各組MDA-MB-231細胞遷移率比較

2.4 各組MDA-MB-231細胞中ac-H3、Hsp70及p-Akt、p-mTOR蛋白相對表達量比較

Western Blot實驗檢測結果顯示,與A組相比較,B～D組ac-H3、Hsp70蛋白相對表達量隨FXX-W-12-4濃度增加明顯升高(F=645.60、1 017.00,P<0.05)。而p-Akt、p-mTOR蛋白相對表達量隨FXX-W-12-4濃度的升高則明顯降低(F=480.30、14.32,P<0.05);各組間兩兩比較差異均具有顯著性(t=9.43～45.38,P<0.05)。見表2。

3 討 論

乳腺癌作為女性常見的全身性惡性腫瘤,具有增殖能力強、易侵襲和易轉移的特點,這是多數乳腺癌患者死亡的重要原因,且晚期患者5年生存率相對較低[14］。近年來,腫瘤靶向治療已經成為治療領域的熱點方向,也為乳腺癌治療帶來了新的希望。與傳統的手術、放化療、激素治療等方法相比較,靶向治療可以精準地作用于腫瘤細胞而不影響正常細胞[15］。但是,單一靶點藥物往往會出現治療范圍有限、副作用大、易產生耐藥性等問題。多靶點藥物可以同時作用于多個靶點,發揮多重抗腫瘤作用,顯著減少單一靶點或聯合用藥的局限性。因此,多靶點小分子化合物的研發對腫瘤的治療有重要意義。

A～D分別為A～D組,結晶紫染色法,100倍

表2 各組MDA-MB-231細胞中ac-H3、Hsp70、p-Akt、p-mTOR蛋白相對表達量比較

Hsp90是細胞內一種重要的分子伴侶蛋白,它可以與其他蛋白結合并協助它們完成正確折疊、維持功能和降解[6-7］。然而,Hsp90的過度表達和功能紊亂會影響多個細胞信號通路和多種生物學行為,從而導致惡性腫瘤的發生和發展[16-17］。研究表明,Hsp90在乳腺癌中表達異常升高,并且與腫瘤的惡性程度和預后密切相關[18-19］。因此,Hsp90已經成為乳腺癌治療中備受關注的靶點之一。另外,表觀遺傳修飾在乳腺癌的發生發展中也發揮著重要的作用[8］。其中,組蛋白的乙酰化和去乙酰化是最常見的修飾方式,由組蛋白乙酰轉移酶和HDAC共同調節[20］。在乳腺癌等多種疾病中,HDACs的表達異常升高,成為治療癌癥的熱門分子靶點之一[21］。通過抑制HDAC的活性,可以促進組蛋白的去乙酰化修飾,從而恢復基因的正常表達,抑制腫瘤的生長和轉移[22］。研究顯示,HDAC抑制劑與Hsp90抑制劑聯合用藥量有協同抗腫瘤作用[23-27］。目前的研究發現,LMK235(HDAC抑制劑)以及NVP-HSP990(Hsp90抑制劑)聯用可以顯著性抑制卵巢癌細胞A2780中Hsp90和HDAC雙靶點的活性,從而誘導細胞凋亡的發生[28］。此外,LMK235和NVP-HSP990聯合治療還可顯著降低A2780細胞對鉑類藥物的獲得性耐藥,從而實現鉑類藥物的逆轉作用。17-DMAG(Hsp90抑制劑)與PTACH(HDAC抑制劑)聯用能夠增加細胞內質網應激,從而誘導肺癌A549細胞凋亡,并使細胞遷移能力幾乎喪失[29］。因此Hsp90和HDAC可作為比較理想的篩選雙靶點抗腫瘤藥物的關鍵靶點。然而,Hsp90/HDAC雙靶點抑制劑在乳腺癌中的研究尚未見報道。

針對乳腺癌增殖能力強、易侵襲和轉移的特質,本研究對FXX-W-12-4在乳腺癌細胞MDA-MB-231中的抑制作用進行了深入探究。通過CCK-8實驗檢測FXX-W-12-4對MDA-MB-231細胞活力的影響,結果顯示隨著FXX-W-12-4濃度的升高,MDA-MB-231細胞活力逐漸下降,FXX-W-12-4顯著抑制了MDA-MB-231細胞的增殖。本研究采用劃痕實驗、Transwell實驗分別檢測FXX-W-12-4對MDA-MB-231細胞遷移和侵襲能力的影響,結果顯示梯度濃度的FXX-W-12-4作用于MDA-MB-231細胞后,細胞遷移率和侵襲率均明顯下降,這表明FXX-W-12-4顯著抑制了MDA-MB-231細胞的遷移和侵襲的能力。為了探討FXX-W-12-4是否通過抑制Hsp90和HDAC雙靶點的活性,從而對于MDA-MB-231細胞增殖、侵襲與遷移發揮作用,本研究通過Western Blot實驗檢測了FXX-W-12-4作用MDA-MB-231細胞以后Hsp70和ac-H3蛋白的相對表達量,結果顯示,經FXX-W-12-4處理后,MDA-MB-231細胞中Hsp70、ac-H3蛋白的相對表達量均顯著增加,同時p-Akt和p-mTOR蛋白的相對表達量顯著降低。這表明FXX-W-12-4對MDA-MB-231細胞增殖、侵襲和遷移的抑制作用可能是通過抑制Hsp90和HDAC雙靶點的活性,從而影響Akt/mTOR通路實現的。

綜上所述,本研究以新型Hsp90/HDAC雙靶點抑制劑FXX-W-12-4為研究對象,發現該小分子化合物對乳腺癌MDA-MB-231細胞的增殖、侵襲和遷移具有顯著的抑制作用,其抑制作用可能是通過調節Akt/mTOR通路實現的。FXX-W-12-4有望成為一種治療乳腺癌的新的有效化合物,具有樂觀的臨床應用前景。本研究為小分子雙靶點藥物的研發提供了有力的實驗依據。

作者聲明：高笑、吳清蘭、鄧林、宋軍瑩參與了實驗的研究設計工作;高笑、張麗、欒業鵬、張金平、侯琳參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發表該論文。所有作者均聲明不存在利益沖突。