體外定點突變體或CRISPR/Cas9介導的敲入突變體快速篩選方法的建立

宋春林 張雨晴 翟玉靜 張剛 王穎

(青島大學,山東 青島 266071 1 腫瘤精準醫學研究院; 2 公共衛生學院)

通過引入突變進行基因功能的研究是常用的實驗方法,基因突變可以發生在細胞內或細胞外。目前,鑒定突變體的通用方法是通過聚合酶鏈式反應(PCR)擴增含有突變位點的基因組DNA片段,然后進行DNA測序以確定突變是否成功,實際操作成本高且耗時長[1］。使用傳統方法在基因組上實現基因突變的難度很高,近年來CRISPR/Cas9系統在基因編輯中的成功應用為實現基因突變提供了更快捷精準的手段[2-5］。然而,CRISPR/Cas9系統介導的基因組定點突變的效率受到多種因素影響,包括細胞類型、基因拷貝數、突變類型以及基因組位點等[6-8］,科研成本相對較高。

為了解決基因定點突變的鑒定問題,本研究旨在構建一種使用突變引物進行PCR擴增的突變體篩選方法,即在引物3′端的1～3個堿基處引入與突變序列相匹配的核苷酸,分別檢驗它們對細胞外和細胞內突變的檢測效率。相較于傳統的測序方法,該方法可快速高效地檢測正確的體外定點突變體或CRISPR/Cas9介導的敲入突變體,可簡化實驗步驟,達到有效提高篩選效率和節省實驗成本的目的。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

HCT116和LN299細胞購自中國科學院蘇州生物研究創新中心;DH5α大腸桿菌細胞購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司;胎牛血清購自美國BI公司;胰蛋白酶、DMEM培養基、青鏈霉素混合液和轉染試劑Lipofectamine 2000購自美國Ther-mo Fisher Scientific公司;單鏈寡核苷酸(ssODN)購自美國IDT公司。

1.2 細胞培養

DH5α大腸桿菌細胞培養于含50 mg/L氨芐青霉素的LB培養基中,置于37 ℃恒溫培養箱中培養。HCT116和LN299細胞培養于含體積分數0.1的胎牛血清和含有抗生素(青霉素10 kU/L,鏈霉素0.01 g/L)的DMEM培養基中,置于37 ℃、含體積分數0.05 CO2的恒溫培養箱中常規培養,以備后續實驗使用。

1.3 體外定點突變體的構建

使用含有突變位點的引物對于包含有目標基因的質粒進行定點突變PCR。PCR反應的總體積為25 μL:0.5 μL模板(質量濃度5×10-5g/L),1 μL引物(每條,摩爾濃度為10 μmol/L),2 μL dNTPs, 1.5 μL MgSO4,2.5 μL 10×PCR Buffer,0.5 μL KOD-Plus-Neo(TOYOBO,日本)和16 μL ddH2O。反應條件為:94 ℃預變性3 min;然后98 ℃變性15 s,51 ℃退火30 s,68 ℃延伸4 min,共進行34個循環;最后68 ℃延伸5 min。PCR反應結束后加入1 μL DpnI,37 ℃孵育1 h以消化PCR反應體系中的質粒模板,后將PCR產物轉化大腸桿菌感受態細胞DH5α涂平板后,于37 ℃恒溫培養箱過夜培養至形成單菌落,次日挑選單菌落進行菌落PCR,鑒定正確突變體。本研究所用引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成,引物序列見表1。

1.4 體外定點突變體的篩選

菌落PCR反應的總體積為7 μL:1 μL引物(每條,濃度為10 μmol/L),3.5 μL的2×Taq Plus Master Mix II(Vazyme,中國)和1.5 μL的ddH2O。反應條件為:94 ℃預變性3 min;然后 94 ℃變性30 s,62 ℃退火30 s,72 ℃延伸2 min,共進行34個循環;最后72 ℃延伸5 min。PCR反應產物進行瓊脂糖凝膠電泳觀察是否有DNA擴增條帶。引物序列見表1。

1.5 CRISPR/Cas9介導的敲入突變體的構建

以PX459為載體構建靶向c-Jun外顯子1的質粒。以單鏈寡核苷酸為模板DNA,在基因組中引入P244A突變。首先將飽和度40%的HCT116細胞接種于6孔板上;次日將PX459和模板DNA各2 μg加入到Lipofectamine 2000中進行細胞轉染;24 h后加入1 mg/L嘌呤霉素進行篩選,篩選48 h后用普通DMEM培養基繼續培養細胞至形成單克隆,以備用于后續基因組DNA提取。同樣的方法也應用于LN299細胞HDAC1的Y87F突變。

1.6 基因組DNA的提取

收集約100 000個LN299或者HCT116細胞,PBS緩沖液洗滌以后重懸于150 μL的5 mmol/L Tris-HCl (pH 8.8)中,95 ℃孵育10 min。細胞裂解液冷卻至室溫后,加入30 μg蛋白酶K,56 ℃孵育30 min以后,95 ℃孵育10 min。以13 000 r/min離心2 min,將含有基因組DNA的上清液轉移到新的離心管中,于-20 ℃保存,以備用于后續的基因組PCR鑒定。

1.7 CRISPR/Cas9介導的敲入突變體的篩選

以200 ng HCT116或LN299基因組DNA為模板,使用3′端最后1、2或3個核苷酸與突變序列相匹配的篩選引物(HDAC1-1、HDAC1-2、HDAC1-3)進行基因組PCR。反應體系為12 μL:2 μL模板,1 μL引物(每條,濃度為10 μmol/L),6 μL的2×Taq Plus Master Mix II和2 μL的ddH2O。反應條件為:94 ℃預變性3 min;然后94 ℃變性30 s,64 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,共進行34個循環;最后72 ℃延伸5 min。基因組PCR反應產物進行瓊脂糖凝膠電泳觀察是否有擴增條帶。其后通過提高退火溫度和在引物的3′端引入新突變的方法進一步優化HDAC1-1引物的檢測特異性。引物序列見表1。

1.8 DNA測序

按照1.6中的方法提取HCT116或LN299細胞基因組DNA,使用位于預期敲入位點的上游和下游約200 bp處的引物進行PCR擴增,對擴增產物進行測序。引物序列見表1。

1.9 不同DNA聚合酶擴增效率的檢驗

分別使用普通Taq酶2×Hieff?PCR Master Mix with dye(YEASEN公司,中國)、2×Taq Plus Master Mix II dye plus(Vazyme公司,中國),高保真DNA聚合酶2×Hieff Canace?Plus PCR Master Mix with dye(YEASEN公司,中國)、2×Phanta Flash Master Mix dye plus(Vazyme公司,中國)、KOD OneTM PCR Master Mix(TOYOBO公司,日本)對突變體進行PCR檢測,通過比較擴增條帶的強度確定不同DNA聚合酶的擴增效率。

2 結 果

2.1 細胞外突變的檢測結果

使用3′端包含突變基因序列的正向引物和下游DNA序列的反向引物,分別檢測了構建在pcDNA5/FRT/To載體上3個基因的定點突變。第一個是VRK1基因發生了抗RNA干擾突變:分別以正確突變基因和未成功突變基因的菌落為模板,使用3′端與第1個突變位點(A→G)匹配的正向引物(5′-CATGGCAAAAAAGGAG-3′)和下游DNA序列的反向引物進行菌落PCR反應,正確突變基因的PCR反應產物進行瓊脂糖凝膠電泳顯示有大小約為1 100 bp的強DNA擴增條帶,未成功突變基因則沒有擴增條帶(圖1A、B);第2個是BubR1基因發生L669A/I672A突變:分別以正確突變基因以及未成功突變基因的菌落為模板,使用3′端與突變位點(CT→GC)匹配的正向引物(5′-TCAGCATCAAGAAGGC-3′)和下游DNA序列的反向引物進行菌落PCR反應,正確突變基因的PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳,顯示有大小約1 300 bp的強信號條帶,未成功突變基因則沒有擴增條帶(圖1C、D);第3個是Cdc20基因發生C165E突變:分別以正確突變基因和未成功突變基因的菌落為模板,使用3′端與突變位點(TGT→GAA)匹配的正向引物(5′-CAGCCGCAAAACGGAA-3′)和下游DNA序列的反向引物進行菌落PCR反應,正確突變基因的PCR反應產物進行瓊脂糖凝膠電泳,顯示有大小約1 000 bp的強信號條帶,未成功突變基因則沒有擴增條帶(圖1E、F)。

2.2 細胞內突變的檢測結果

當使用只有一個核苷酸匹配突變序列的引物HDAC1-1時,親本基因組擴增得到弱信號條帶,同時敲入基因組擴增出強信號條帶;使用HDAC1-2、HDAC1-3時,只有敲入突變基因組產生強信號的條帶,親本基因組無擴增(圖2A、B)。進一步優化HDAC1-1引物的檢測特異性發現,升高退火溫度,敲入突變基因組與親本基因組條帶的強度比不斷增加,當退火溫度設置為70 ℃時,兩者的擴增均告失敗(圖2C)。

進一步優化實驗顯示,在只有1個核苷酸與突變序列匹配的引物的3′端倒數第2、3和4位分別引入新的突變,也能夠提高反應的特異性(圖3)。

最后,采用該方法成功地篩選出在HCT116細胞的c-Jun基因上發生P244A(CCC→GCT)敲入突變成功的克隆(圖4A、B)。

A:HDAC1野生型(頂部)與突變型(底部)的序列比對;B:野生型HDAC1的親本細胞基因組(第1、3、5泳道)和HDAC1 Y87F敲入突變細胞基因組(第2、4、6泳道)PCR結果,1與2,3與4、5與6泳道的反應分別使用HDAC1-1、HDAC1-2、HDAC1-3引物;C:優化HDAC1-1引物的退火溫度的結果,第1、3、5、7、9和11泳道為野生型HDAC1,第2、4、6、8、10和12泳道為突變型HDAC1

野生型HDAC1的親本細胞基因組(第1、3、5、7、9泳道)和HDAC1 Y87F敲入突變基因組(第2、4、6、8、10泳道)的PCR擴增結果;1與2、3與4、5與6、7與8、9與10泳道分別使用HDAC1-1,HDAC1-1-2、HDAC1-1-3、HDAC1-1-4和HDAC1-1-5(倒數第5位引入新突變)引物

A:野生型(頂部)與突變型c-Jun(底部)的DNA序列比對;B:使用3′端含有4個突變核苷酸的反向引物,對32個細胞株(1～32泳道)進行基因組PCR,33～35泳道分別為親本細胞、敲入后的混合細胞和c-Jun陽性對照的PCR擴增結果

2.3 不同DNA聚合酶檢測效率的比較

為提高該方法的擴增效率,本研究比較了5種不同DNA聚合酶對于突變體檢測的效率,結果表明普通的Taq酶較高保真DNA聚合酶,更適用于突變克隆的篩選(圖5)。

3 討 論

DNA突變是研究基因功能的常用方法,但通過DNA測序找到正確的突變體往往需要耗費大量時間和金錢,尤其是在突變成功率偏低的情況下。隨著CRISPR/Cas9介導的敲入突變方法越來越廣泛地應用,這個問題變得越來越突出。因此,設計新的方法以提高突變克隆鑒定效率具有極高的應用價值。例如,可以在引入目的突變的同時引入限制性內切酶識別位點,從而間接識別陽性克隆。然而,大多數基因無法在引入限制性內切酶識別位點的同時保持所編碼的氨基酸不變,從而極大地限制了該方法的應用。

泳道1、3、5、7、9使用HCT116 c-Jun野生型細胞基因組DNA為模板,泳道2、4、6、8、10為HCT116 c-Jun P244A敲入突變細胞基因組DNA為模板;第1、2和9、10泳道使用YEASEN和Vazyme的普通Taq酶,第3～8泳道分別使用YEASEN、Vazyme和TOYOBO的高保真DNA聚合酶

本研究借鑒了疾病診斷中常用的基于PCR反應的突變檢測方法,并進行了針對性的優化,來快速篩選帶有目的突變的陽性克隆。本研究中首先使用克隆在質粒上的含有定點突變的VRK1、BubR1和Cdc20基因來檢測該方法能否有效鑒定細胞外突變。VRK1參與包括細胞周期的起始、G2/M期的染色質濃縮、高爾基體斷裂和有絲分裂中的核膜組裝等多個過程,多種腫瘤中均能夠檢測到其過度表達[9-11］。BubR1和Cdc20是介導紡錘體組裝檢查點激活的關鍵成分,在哺乳動物中高度保守,其表達水平與紡錘體組裝檢查點功能之間存在劑量依賴性效應[12-15］。本研究在引物的3′端分別設計了與突變序列相匹配的第1、2、3個堿基,菌落PCR結果顯示該方法可有效擴增攜帶有突變型的質粒,而野生型無PCR產物。

本研究進一步使用了HDAC1 Y87F和c-JunP244A敲入突變細胞系以驗證該方法檢測基因組DNA敲入突變的效率。HDAC1基因編碼的蛋白質屬于組蛋白脫乙酰酶家族,在真核基因表達的調控中起著關鍵作用[16-17］。c-Jun參與包括細胞增殖、凋亡、存活、腫瘤發生和組織形態發生等多種細胞活動。有研究表明細胞外信號可以誘導c-Jun的翻譯后修飾,從而導致轉錄活性和靶基因表達的改變[18-20］。為了保護供體DNA不會被Cas9內切酶重復切割,在不改變編碼氨基酸的情況下,分別對模板DNA上的PAM序列進行了同義突變(TCG→AGT,TC→AG)。結果顯示,在引物的3′端引入與突變序列相匹配堿基可有效區分親本和敲入突變基因組。

以上結果證實無論是細胞內還是細胞外突變,該方法只需要增加一步菌落PCR或者基因組PCR即可成功篩選陽性克隆,對一個或幾個陽性克隆進行測序即可獲得所需的突變體,顯著地提高了突變體篩選的效率。本研究還進一步優化了PCR的退火溫度,引入額外的突變位點增加該方法的特異性,并考察了不同DNA聚合酶的應用效果。

基于本研究的結果,為提高該方法的擴增效率和特異性,我們提出以下建議:①使用普通的Taq酶。②盡量使用3′端含有2或3個甚至更多的與突變序列匹配的引物進行克隆的快速篩選。如果只能使用含有1個突變核苷酸的引物,則可通過提高退火溫度或在引物3′端的倒數第2至第4個核苷酸中的任意一個位點引入單個突變堿基,以減少假陽性的產生。③在使用CRISPR/Cas9進行敲入突變時,需要將DNA模板的PAM位點進行突變來避免模板被Cas9識別切割。我們建議在設計引物時將突變后的PAM位點的DNA序列也引入引物中,從而提高篩選的特異性。④需要注意的是,該方法僅適合于敲入細胞系的篩選。對于CRISPR/Cas9介導的基因敲除,由于基因敲除結果不可預測,無法使用該方法來篩選基因敲除細胞。

綜上所述,本研究建立并且優化了一種通過一步PCR就能夠快速地篩選出體外定點突變體或者CRISPR/cas9介導的敲入突變體的方法,簡化了突變體的鑒定過程,有效降低了實驗成本,提高了工作效率。

作者聲明：宋春林、張剛、王穎參與了研究設計;宋春林、張雨晴、翟玉靜完成了實驗操作和數據整理;宋春林、張剛、王穎完成了數據分析和論文的寫作;宋春林、張雨晴、翟玉靜完成了論文的校對。所有作者均閱讀并同意發表該論文。所有作者均聲明不存在利益沖突。