CRISPR/Cas9技術在卵巢癌轉移中的研究進展

朱姣姣 魏林珍 陳凡 丁瑤瑤 張倩倩 秦天生

[摘要]?由成簇規律間隔短回文重復序列（clustered?regularly?interspaced?short?palindromic?repeats，CRISPR）及其相關蛋白9（CRISPR?associated?nuclease，Cas9）介導的基因編輯技術已被廣泛用于探究癌癥相關基因的功能、建立癌癥動物模型和探測物藥靶點，是一種高效、快速和位點特異性的工具。近年來，卵巢癌發病率逐年增加，嚴重威脅女性健康。目前多采用手術、放療、化療或聯合治療等方法延緩疾病的進展，但效果不佳，是臨床迫切需要解決的一大問題。因此，利用CRISPR/Cas9技術靶向致病基因、篩選相關功能基因及尋找新的藥物靶點為卵巢癌的治療帶來了希望。本研究對既往CRISPR/Cas9技術在卵巢癌轉移中的研究應用進行綜述，希望對該領域未來的研究奠定理論基礎，也為腫瘤特別是卵巢癌的治療提供新的參考。

[關鍵詞]?CRISPR/Cas9；基因編輯；卵巢癌；轉移

[中圖分類號]?R737??????[文獻標識碼]?A??????[DOI]?10.3969/j.issn.1673-9701.2023.11.027

CRISPR/Cas（clustered?regularly?interspaced?short?palindromic?repeat/CRISPR-associated）系統是細菌和古細菌抵抗外源入侵的防御系統。2012年有研究發現其能在體外切割雙鏈DNA[1]，從而開啟了基因編輯技術的新格局，成為當前最熱門的基因編輯技術，并于2020年獲得諾貝爾化學獎[2]。與其他基因編輯技術相比，CRISPR/Cas9技術操作流程簡單，成本低、效率高。近年來被越來越多的用于基因定點編輯、基因組篩選、建立疾病動物模型和篩選藥靶點等，為疾病的診療提供了新的選擇。

卵巢癌是一種具有高度轉移性的惡性腫瘤，早期癥狀不明顯，大多數患者在就診初期已發現腹腔播散等轉移情況，目前與卵巢癌轉移相關的基因組學仍不清楚，患者的治療選擇有限，且耐藥機制在很大程度上導致治療現狀并不樂觀。隨著技術的發展，CRISPR/Cas9技術為腫瘤的治療帶來了新的可能性。因此，本文對既往CRISPR/Cas9技術在卵巢癌轉移中的研究進展進行綜述，便于有關卵巢癌轉移的后續研究。

1??CRISPR/Cas9概述及作用機制

原核生物為抵御噬菌體或病毒及外源質粒DNA侵襲進化出一種適應性免疫防御系統，稱為成簇規律間隔短回文重復序列（clustered?regularly?interspaced?short?palindromic?repeats，CRISPR）。1987年，日本學者對一段大腸桿菌染色體進行測序，發現了一段由重復片段和非重復片段間隔連接的保守短序列[3]。Jansen等[4]在2002年介紹了一組基因組的存在，被命名為CRISPR，且該系統由CRISPR和一系列相關蛋白Cas（CRISPR-associated?proteins，Cas）共同組成。2007年，有學者證明CRISPR系統是一種具有預防作用的免疫系統[5]，這是原核生物CRISPR系統具有適應性的實驗證據。2008年，Shen等[6]發現，在CRISPR序列中，前間隔序列鄰近基序（protospacer?adjacent?motif，PAM）有著重要作用。2013年，有研究發現Ⅱ型CRISPR/Cas系統實現了對哺乳動物細胞內源性基因組位點的精確編輯[7]。2016年，CRISPR/Cas9基因編輯工具首次應用于臨床[8]。此后，許多基于CRISPR/Cas9的基因編輯方法出現，極大地提高了基因組編輯的精度，并擴大了其應用范圍。

目前，CRISPR/Cas系統可Class1和Class2兩類，根據效應蛋白的結構和功能又分不同的亞型，Class1包括Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅳ型，Class2包括Ⅱ型、Ⅴ型、Ⅵ型，其中Ⅱ型CRISPR/Cas9系統構成簡單，主要由內切酶（Cas9）、CRISPR?RNA（crRNA）和反式激活crRNA（tracrRNA）3部分組成，是目前應用最廣的基因編輯方法。

作為原核生物的免疫防御系統，CRISPR主要通過3個步驟發揮作用。①當噬菌體或病毒首次感染細菌時，將自身遺傳物質導入菌體，菌體中的CRISPR系統將入侵病毒基因組DNA序列前間隔序列，整合到自身的CRISPR陣列，成為間隔序列鄰近基序（proto-spacer-adjacent?motifs，PAM）。②當噬菌體或病毒再次感染細菌時，該外源片段被轉錄加工為成熟的crRNA并與Cas蛋白結合。③crRNA與外源病毒基因組DNA或RNA通過堿基互補配對引導Cas蛋白對其切割。斷裂的雙鏈啟動自身修復機制修復，如非同源末端連接（non-homologous?end?joining，NHEJ）和同源重組修復（homology?dependent?repair，HDR）機制，前者在沒有修復模板的情況下使用非同源DNA修復途徑，DNA末端被重新連接，通常導致引入小的插入或刪除而導致突變；HDR可機制利用同源模板與斷裂的雙鏈末端形成互補，使末端被連接，以實現基因敲除或精確基因的插入。

2??CRISPR/Cas9在癌癥中的應用

近年來，隨著對基因編輯技術的深入研究，CRISPR/Cas9不斷地被用于敲除腫瘤致病基因、建立腫瘤基因編輯模型、打破機體免疫耐受、基因治療、聯合文庫篩選功能基因及耐藥靶點、表觀遺傳學等方面的研究。

2.1??敲除腫瘤致病基因

編輯癌基因、抑制特定蛋白表達，是研究腫瘤形成、發展和治療過程的關鍵策略。Olaizola等[9]研究擬泛素化修飾在膽管癌發生、發展中的作用，利用CRISPR/Cas9介導的NAE1基因敲除，在體外和體內模擬膽管癌中的NAE1抑制劑的效應。Chou等[10]研究信號轉導和轉錄激活因子1（signal?transducer?and?activator?of?transcription?1，STAT1）在結直腸癌腫瘤生長中的作用，利用CRISPR/Cas9系統分別在結直腸癌細胞系及異種移植小鼠模型中敲除STAT1，發現STAT1敲除可降低細胞的生長，證實STAT1在結直腸癌中的致癌作用。轉錄因子MondoA與癌細胞代謝應激有關，利用CRISPR/Cas9和RNA干擾等技術，Sipol等[11]研究結果顯示，MondoA耗盡可在體外降低急性B淋巴細胞白血病細胞的轉化能力，并在體內小鼠模型中顯著抑制了惡性潛能。細胞甲酸結合蛋白Ⅱ（cellular?retinoic?acid?binding?protein?2，CRABP-Ⅱ），在所有胰腺導管腺癌（pancreatic?ductal?adenocarcinoma，PDAC）中都過表達，采用CRISPR/Cas9基因編輯方法建立CRABP-Ⅱ基因敲除細胞系，并評估吉西他濱的體外敏感性，發現CRABP-Ⅱ缺失使PDAC細胞對吉西他濱誘導的細胞凋亡敏感，為克服PDAC耐藥提供了一個新的選擇[12]。Chen等[13]將放療技術與CRISPR/Cas9基因敲除相結合阻斷巨噬細胞免疫檢查點通路CD47-SIRPα，提高荷瘤小鼠的生存率，降低腫瘤干細胞，改善預后，為膠質母細胞瘤的治療提供了新的思路。

2.2??表觀遺傳

癌癥是由遺傳和表觀遺傳共同引起的。CRISPR/Cas9被用于識別可能在腫瘤發生及治療耐藥機制中發揮作用的異常遺傳和表觀遺傳，例如近期在前列腺癌中的研究[14]。將CRISPR/Cas9技術與下一代測序（next-generation?sequencing，NGS）相結合，可能加快目標位點的識別、驗證和定位。NGS診斷結果可作為CRISPR/Cas9工具編輯突變基因的基礎[15]。采用CRISPR/Cas9誘導染色體整體重排可以重塑人類細胞的基因組和轉錄組，為表觀遺傳和細胞基因表達的研究提供參考[16]。Wang等[17]通過CRISPR/Cas9文庫進行篩選，結合細胞水平及臨床樣本的驗證，確定了低表達的肝癌源性生長因子2與多發性骨髓瘤細胞對蛋白酶體抑制劑類藥物的低敏感度密切相關。這為CRISPR/Cas9技術在表觀遺傳學中的研究提供了理論基礎與實驗依據。

2.3??基因治療

CRISPR/Cas9技術因其高效的編輯效率及靶向不同的靶點等優勢，已被用于腫瘤、造血系統疾病，以及聯合免疫療法用于腫瘤免疫等疾病的基因治療。Kwon等[18]開發了一種名為CINDELA（cancer-specific?indel?attacker）的腫瘤療法，利用CRISPR/Cas9靶向癌癥特異性插入或缺失（insertions?and?deletions，InDel）突變，導致多處發生DNA雙鏈斷裂，從而實現對腫瘤細胞的特異性殺傷。在基于T細胞的免疫療法中，CRISPR/Cas9技術的應用正在探索中，以改善T細胞效應的功能和持久性，減少治療相關毒性。Stadtmauer等[19]在Ⅰ期臨床試驗中研究了多重CRISPR/Cas9編輯的安全性和可行性，以提高3名患有多發性骨髓瘤和轉移性肉瘤患者的人類T細胞的天然抗癌能力，證明CRISPR基因編輯用于癌癥免疫治療的可行性。嵌合抗原受體T細胞免疫療法（chimeric?antigen?receptor?T-Cell?immunotherapy，CAR-T）的臨床療效已經在人類癌癥中得到證實，基于CRISPR/Cas9的基因組編輯的CAR-T細胞技術，為腫瘤免疫相關研究提供了參考，如利用CRISPR/?Cas9篩選將NOXA鑒定為B細胞惡性腫瘤對嵌合抗原受體CAR-T細胞療法耐藥的關鍵調節因子[20]。

2.4??全基因組篩選

目前，基于CRISPR/Cas9的全基因組篩選方式利用基因組規模的sgRNA文庫在人或小鼠細胞中進行基因敲除篩選，已經篩選到了一系列潛在的治療靶點、功能基因以及與藥物協同作用產生耐藥性的基因為創新癌癥療法開辟了新的前景。

為識別伯基特淋巴瘤（Burkitt?lymphoma，BL）中的缺陷和腫瘤抑制因子，對3個BL細胞系進行全基因組CRISPR/Cas9功能缺失篩選，確定SHMT2為治療靶點[21]。通過全基因組CRISPR/Cas9篩選發現蛋白精氨酸甲基轉移酶1（protein?arginine?methyltransferase?1，PRMT1）是前列腺癌中雄激素受體表達及信號傳導的關鍵調節因子[22]。CRISPR/Cas9的全基因組篩已被廣泛用于急性髓性白血病（acute?myelogenous?leukemia，AML）篩選治療靶點[23]，但既往大多在體外細胞系中開展相關研究，往往忽略了體內微環境對靶點篩選的影響。在代表不同分子亞型的多個小細胞肺癌（small?cell?lung?carcinoma，SCLC）細胞系中，利用1個針對已知藥物靶標基因的sgRNA文庫進行CRISPR/Cas9篩選，確定核輸出蛋白1作為SCLC的一個新治療靶點，抑制它可以顯著提高腫瘤對一線和二線化療的敏感性[24]。結合生物信息學，利用CRISPR/Cas9敲除文庫篩選功能基因，最終富集了一批可能影響三陰乳腺癌（triple?negative?breast?cancer，TNBC）轉移的候選基因，并表明DGKZ基因是TNBC潛在的促轉移基因[25]。

未識別亞型的肝細胞癌患者適于二甲雙胍治療，Feng等[26]采用CRISPR/Cas9文庫篩選發現DOCK1的缺失可增強肝細胞癌細胞對二甲雙胍的敏感性，并利用細胞、類器官、小鼠原位肝細胞癌等多種模型等方法驗證了DOCK1水平，決定二甲雙胍的抗腫瘤作用。DOCK1是二甲雙胍在HCC中的合成致死靶點，為二甲雙胍在肝細胞癌中的精準應用提供了理論依據。基于CRISPR/Cas9的篩選系統可用于識別與抗癌藥物療效相關的基因，Chen等[27]通過一系列CRISPR/Cas9庫篩選、RNA轉錄組測序技術和代謝組學分析發現，硒半胱氨酸生物合成的關鍵中間物是肝細胞癌細胞對化療耐藥的關鍵介質。

2.5??構建癌癥動物模型

當前CRISPR/Cas9技術已被運用于建立各種小鼠癌癥模型，如胰腺癌、頭頸部鱗狀細胞癌、卵巢癌等。小鼠模型在評估腫瘤進展和治療反應方面有獨特優勢。腫瘤細胞異位移植是評估靶細胞系體內致瘤潛能最簡單的方法，將細胞植入免疫缺陷小鼠皮膚下，評估腫瘤增殖、治療等反應。Loesch等[28]通過使用Cre-Lox或腺相關病毒載體介導的CRISPR/Cas9方法生成肝細胞特異性和可誘導小鼠模型，但異位移植模型不能很好地反應腫瘤微環境以及復雜的免疫細胞調控等。Qin等[29]使用全基因CRISPR/Cas9基因敲除，篩選在小鼠原位模型中調節卵巢癌腹膜擴散的候選基因。Guo等[30]為研究SF3B1R625H突變在泌乳素瘤進展中的生物學作用，使用CRISPR/Cas9基因編輯系統獲得了一個雜合的Sf3b1R625H突變大鼠細胞系。建立癌癥小鼠在了解癌癥的發生和進展方面是必要的，這些模型可以在體內研究基因功能并闡明參與腫瘤發生的途徑。

3??CRISPR/Cas9在卵巢癌轉移中的應用

對于已出現轉移的卵巢癌患者，化療、靶向治療等的臨床效果有限，晚期患者的5年生存率較低。目前對于卵巢癌轉移和化療耐藥的分子機制尚不清楚，因此利用CRISPR/Cas9技術尋找新的靶點、耐藥基因或建立卵巢癌轉移模型，對早期診斷和開發新藥改善卵巢癌治療具有重要意義。Xu等[31]利用CRISPR/Cas9全基因組敲除文庫成功構建小鼠卵巢癌轉移模型，通過篩選提示細胞毒性淋巴細胞相關基因ITK預測卵巢癌遠處轉移患者的預后。同樣，Li等[32]為系統識別卵巢癌腹膜轉移調控的關鍵基因，利用CRISPR/Cas9基因敲除文庫對原位卵巢癌鼠模型進行全基因組基因敲除篩選，發現白細胞介素20受體亞基α在卵巢癌腹膜轉移過程中顯著下降，是卵巢癌經體腔轉移的有效抑制劑。

在研究轉移機制方面，Zhang等[33]使用全基因組CRISPR/Cas9技術對可能參與卵巢癌轉移和失巢凋亡抗性的基因進行全面篩選，發現蛋白質-L-異天冬氨酸（D-天冬氨酸）O-甲基轉移酶與卵巢癌的失巢凋亡抗性的相關性最高，是卵巢癌轉移的關鍵驅動因子。

在腫瘤進展過程中，有多種因素參與了上皮細胞-間充質轉化（epithelial-mesenchymal?transition，EMT）過程。EMT有助于腫瘤轉移和促進化療耐藥性，但卵巢癌中調節EMT過程的機制尚不清楚。Yin等[34]使用CRISPR/Cas9技術敲除過表達TNNC1的SKOV-3-13卵巢癌細胞中的TNNC1基因，可抑制卵巢癌細胞的增殖、遷移和侵襲，同時TNNC1缺陷細胞通過Akt/GSK-3β/Snail信號通路抑制EMT，并通過抑制F-肌動蛋白聚合抑制細胞運動。EIF5A2在幾種癌癥中具有致癌活性并有助于腫瘤轉移，為研究其在腫瘤中的作用，使用基于慢病毒載體介導的的?CRISPR/Cas9技術及過表達方法，證明EIF5A2通過TGFβ通路促進EMT，從而控制卵巢腫瘤的生長和轉移[35]。Liu等[36]使用CRISPR/Cas9技術敲除AMIGO2表達，對體外和體內功能進行分析。AMIGO2的敲除改變了卵巢癌細胞的微球形成潛力，減少了體外黏附和侵襲，并顯著減弱了腹膜內轉移，強調AMIGO2是抗轉移治療方法的新靶點，旨在阻斷轉移性腫瘤球的凝聚力、存活和黏附。網膜是卵巢癌細胞的首選轉移部位，大多數被診斷患有高級別漿液性卵巢癌的女性存在網膜轉移。為證明網膜巨噬細胞通過分泌與趨化因子受體1（CC?chemokine?receptor?1，CCR1）相互作用的趨化因子配體可促進卵巢癌細胞向網膜的遷移和定植，Krishnan等[37]利用CRISPR/Cas9技術發現抑制CCR可減少卵巢癌的定植。以上研究結果均有助于更好地理解導致卵巢癌轉移的分子機制。

4??小結

綜上所述，卵巢癌轉移是多步驟并具有高度選擇性的過程，包括腫瘤細胞從原發灶分離、非錨定生長、凋亡逃逸、細胞遷移、周圍組織浸潤等。CRISPR/Cas9技術作為精準的基因治療方法，靶向癌細胞的多個位點或特異性突變序列，使腫瘤特異性治療成為可能，對卵巢癌轉移的后續研究臨床意義重大，為未來的相關研究提供了新的思考與幫助。

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