全自動固相萃取-高效液相色譜法測定食品中紅曲色素

王思媛，段鵬雪

（慶陽市疾病預防控制中心，甘肅慶陽 745000）

紅曲色素產生于紅曲霉菌的代謝過程，是一類聚酮體化合物的混合物質，紅曲色素在食品生產領域的應用相當廣泛[1-2]。《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》（GB 2760—2014）中規定，紅曲色素作為食品著色劑應用于酒、熟肉制品、糖果和腐乳中時可按需添加[3]。

高效液相色譜-質譜聯用法[4-5]、高效液相色譜法[6]、分光光度法[7]和近紅外光譜法[8]等檢測方法已成為分析紅曲色素的主要手段，其中高效液相色譜法是檢測紅曲色素最常使用的方法。本文利用全自動固相萃取技術對樣品完成凈化，采用高效液相色譜法進行檢測分析，建立了食品中紅曲素、紅曲紅素、紅曲紅胺定性定量的分析方法，為食品中的紅曲色素成分的快速檢測提供了實踐參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1200高效液相色譜儀，配有二極管陣列檢測器（DAD）；Reeko Fotector-06c全自動固相萃取儀；高速冷凍離心機；Milli-Q超純水系統；HLB型固相萃取柱（200 mg/6 mL）；SB5200DTDN超聲波儀；Flex-MVP全自動真空濃縮儀。

標準品：紅曲素（98.9%）、紅曲紅素（98.0%），紅曲紅胺（98.3%）；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純；實驗用水為超純水。

1.2 試驗方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：40 ℃；紅曲紅素、紅曲素檢測時波長設定為390 nm；紅曲紅胺檢測時波長設定為264 nm；進樣量20 μL；流速1.0 mL·min-1。流動相為甲醇-乙酸銨溶液（pH=5），流動相比例和梯度洗脫見表1。

表1 流動相比例和梯度洗脫

1.2.2 溶液配制

（1）單標準儲備溶液的配制。稱取紅曲素5 mg、紅曲紅素100 mg、紅曲紅胺10 mg，分別用甲醇定容至100 mL、20 mL、100 mL。其中紅曲素質量濃度為50 μg·mL-1、紅曲紅素為5000 μg·mL-1、紅曲紅胺為100 μg·mL-1，于4 ℃條件下冷藏保存。

（2）混合標準工作液的配制。分別吸取上述標準儲備液0.50 mL、1.00 mL、2.00 mL、5.00 mL和10.00 mL于25 mL容量瓶中，用甲醇定容，于4 ℃保存。混合工作液質量濃度分別為紅曲紅胺2 mg·L-1、4 mg·L-1、8 mg·L-1、20 mg·L-1、40 mg·L-1，紅曲素1 mg·L-1、2 mg·L-1、4 mg·L-1、10 mg·L-1、20 mg·L-1，紅曲紅素100 mg·L-1、200 mg·L-1、400 mg·L-1、1000 mg·L-1、2000 mg·L-1。

1.2.3 提取

分別稱取醋、醬油、料酒、冷凍飲品、調制乳等液體樣品5.00 g置于燒杯中，用無水乙醇進行溶解后，定容至50 mL，待凈化。

分別稱取熟肉制品、腌制蔬菜、調味品、膨化食品、發酵乳和煉乳等固體半固體樣品5.00 g置于50 mL離心管中，用20 mL 80%的乙醇溶液渦旋混勻后，超聲提取15 min，在4 ℃條件下，于4500 r·min-1離心5 min，取上清液，并用20 mL 80%的乙醇溶液復提1次，將兩次提取液合并于50 mL容量瓶中，用無水乙醇定容，待凈化。

1.2.4 凈化

取1.2.3項下合并后的提取液20 mL于50 mL離心管內，并加入乙醇10 mL，在（60±2）℃下，真空濃縮達到近干狀態，用2 mL 20%的甲醇溶解殘渣2次，將其全部轉移至10 mL進樣瓶中，用全自動固相萃取儀凈化富集，程序見表2。收集的洗脫液進行真空濃縮近干后，用2 mL 20%的甲醇溶解，待測液過0.45 μm有機濾膜后，進行測定。

表2 凈化富集程序

2 結果與分析

2.1 色譜分離效果

按照上述實驗方法對紅曲素10 mg·L-1、紅曲紅素2000 mg·L-1、紅曲紅胺20 mg·L-1的混合標準溶液進行實測。由圖1可知，在264 nm波長下紅曲紅胺的出峰時間為9.599 min，在390 nm波長下紅曲素和紅曲紅素出峰時間依次為10.862 min、11.502 min。

圖1 紅曲色素混合標準溶液色譜圖

2.2 色譜柱的選擇

紅曲素、紅曲紅素和紅曲紅胺均為弱極性物質，在C18色譜柱上都有較好的保留，因紅曲素、紅曲紅素和紅曲紅胺的化學結構具有相似特征，因此出峰時間較為相近。本試驗選用C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱進行檢測，通過調整流動相比例和梯度洗脫，使紅曲素、紅曲紅素和紅曲紅胺可以完全分離。

2.3 流動相選擇

用于分離紅曲類色素的流動相有磷酸溶液pH=2.5±0.3和乙腈[6]、乙腈和水[4]、甲醇和1%乙酸[9]、甲醇和乙酸銨（pH=5）[10]等。試驗發現，以上4種流動相中甲醇和乙酸銨（pH=5）能夠較好地分離出紅曲紅胺、紅曲素和紅曲紅素。同時試驗采用的梯度洗脫程序用時18 min與《食品安全國家標準 食品中紅曲色素的測定》（GB 5009.150—2016）用時30 min相比，檢測樣品所需時間更短，更適合批量檢測。

2.4 標準曲線和檢出限

根據3倍信噪比（3S/N）計算檢出限[11]，紅曲素、紅曲紅素和紅曲紅胺的檢出限分別為0.146 mg·kg-1、5.770 mg·kg-1、1.880 mg·kg-1，均低于GB 5009.150—2016中規定的檢出限要求（紅曲素0.30 mg·kg-1、紅曲紅素30 mg·kg-1和紅曲紅胺3.0 mg·kg-1），滿足分析要求。

將1.2.2配制成的混合標準曲線工作液，依照色譜要求完成檢測，以質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。由表3可知，紅曲素、紅曲紅素和紅曲紅胺的線性方程相關系數均在0.999以上，且線性關系良好。

表3 標準曲線和檢出限

2.5 精密度和回收實驗

取紅曲色素混合標準溶液，按照低、中、高3個濃度水平進行加標回收試驗，加標樣品平行測定7次，計算3種紅曲色素回收率及相對標準偏差，見表4。3種紅曲色素的平均回收率在82.9%～106.0%，RSD在0.52%～2.38%，表明該方法精密度良好，能夠滿足測定要求。

表4 精密度和回收率（n=7）

3 結論

本試驗采用高效液相色譜法對食品樣品中的3種紅曲色素進行分析，此方法具有精度高、操作便捷、強重現性以及應用范圍廣的特點，可以在大批量樣品檢測時使用，為食品中紅曲色素的快速測定供了技術參考。