大孔樹脂分離純化紫蘇葉總黃酮的工藝研究

周 泉，唐 愷，張 偶，姚雅薇，楊怡玲，劉 最,2*

（1.衡陽師范學院南岳學院 生命科學系，湖南衡陽 421008；2.衡陽師范學院 生命科學學院，南岳山區生物資源保護與利用湖南省重點實驗室，湖南衡陽 421008）

紫蘇（Perilla frutescensL.）屬于唇形科植物，我國很多地方都有分布，栽培歷史久遠[1]。紫蘇在食品、醫藥、保健品等方面均有廣泛應用。紫蘇的三大器官如種子、葉、莖均可被食用，具有化痰、解表散寒、解毒、利尿和安胎等功效[2]。紫蘇不僅富含多種營養成分，還含有多種生物活性物質，如黃酮類、酚酸類、萜類等。實驗證明這些物質具有多種生物活性，如抗氧化、降血糖、抗菌、抗炎等[3-5]，而這些藥理功效可能主要來自紫蘇葉中的黃酮類成分，但目前涉及紫蘇葉黃酮的分離純化研究較少。大孔樹脂分離純化工藝具有易操作、選擇性強、污染低、穩定性高等多種優點，已被廣泛應用于中草藥植物有效成分的分離純化研究中[6-7]。例如，聶超等[8]用AB-8型樹脂純化倫晚臍橙總黃酮，純度從3.61%提高到33.45%；劉剛等[9]用D101型樹脂純化倫晚臍橙總黃酮，純度從33.72%提高至63.74%。本研究選取紫蘇葉為實驗原料，通過靜態吸附和解吸實驗，對總黃酮的分離純化條件進行優化，以期獲得純度較高的黃酮類化合物，為后續研究該成分的藥理作用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原材料：紫蘇葉購自廣東省揭陽市。大孔樹脂D101、HPD-100、HPD-600、AB-8和ADS-7（北京瑞達恒輝科技有限公司）；蕓香葉苷（上海藍季生物有限公司）；無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁（天津市科密歐化學試劑有限公司）。

1.2 儀器與設備

DHG-9040A電熱恒溫鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）；RE-52A旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；UV- 2550型紫外可見分光光度計（上海尤尼柯儀器有限公司）；H2050R高速冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）；SB25-12DTD超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 黃酮粗提物的制備

稱取紫蘇葉粉末10 g，加入70%的乙醇200 mL，于60 ℃水浴回流提取3次，每次70 min，合并濾液，超聲30 min，旋轉蒸發儀濃縮，備用。

1.3.2 黃酮含量的測定

采用NaNO2-Al(NO3)3比色法進行測定，前期準備得方程A=7.199X-0.0047（R2=0.9996），表現出良好的線性關系。

1.3.3 樹脂的預處理

稱取一定量的5種不同型號的大孔樹脂，將其放入裝有95%乙醇的錐形瓶中，浸泡過夜，用蒸餾水沖洗幾次，直至無醇味；然后分別用3% HCl和3%NaOH溶液浸泡，最后用去離子水洗至中性，備用。

1.3.4 靜態吸附和解析實驗

分別稱取2 g已處理好的5種不同型號的大孔樹脂，裝至具塞錐形瓶中，往瓶中分別加入3 mg·mL-1的樣品液30 mL，置于25 ℃搖床，以150 r·min-1吸附24 h。取濾液測定，按公式計算吸附率。加入70%乙醇50 mL對樹脂進行洗脫，解吸24 h，取濾液測定，按公式計算解吸率。

式中：C0為吸附前黃酮質量濃度，mg·mL-1；C1為吸附后黃酮質量濃度，mg·mL-1；C2為解吸后黃酮質量濃度，mg·mL-1；V1為樣品液體積，L；V2為解吸液體積，L；M為大孔樹脂干質量，g。

1.3.5 紫蘇葉黃酮純化工藝驗證

稱取3份3 g預處理好的D101型大孔樹脂，加入濃度為3 mg·mL-1，pH為4的樣品溶液30 mL，靜態吸附5 h后；使用50 mL 70%乙醇對吸附飽和的樹脂進行洗脫，解吸4 h后，收集洗脫液。將洗脫液60 ℃條件下濃縮，真空冷凍干燥，得到精制品。稱取一定量的精制品，溶解于一定體積70%乙醇中，測定黃酮質量濃度Y，計算黃酮純度為

式中：M為稱取的精制品質量，g；V為溶解精制品的蒸餾水體積，mL；Y為精制品的黃酮質量濃度，g·mL-1。

2 結果與分析

2.1 最佳大孔樹脂的篩選

樹脂的極性和空間結構會影響其吸附效果。本實驗選取5種不同的大孔樹脂進行實驗，從圖1可知，5種樹脂對紫蘇葉中的黃酮均有一定的吸附效果，其中D101樹脂的吸附能力較強，吸附率為79.49%，解吸率為81.84%。說明總黃酮中含有較多的非極性和弱極性化合物，這些化合物的極性與D101極為相近，因而吸附效果最好。綜合考慮，本實驗選取D101型大孔樹脂作為紫蘇葉總黃酮分離純化的最佳樹脂。

圖1 大孔樹脂靜態吸附和解吸效果

2.2 大孔樹脂對紫蘇黃酮靜態吸附和解吸動力學曲線

2.2.1 靜態吸附動力學曲線

從圖2可得，延長吸附時間，大孔樹脂對總黃酮的吸附率逐漸升高，吸附時間達到5 h時，樹脂表面對黃酮的吸附趨于飽和；繼續延長吸附時間，吸附率變化緩慢，達到吸附平衡。因此，將5 h作為最佳吸附時間。

圖2 D101樹脂靜態吸附平衡曲線

2.2.2 靜態解吸動力學曲線

從圖3可發現，延長解吸時間，解吸率逐漸升高，變化迅速；當解吸時間為4 h時，樹脂對黃酮的解吸基本達到平衡；繼續延長解吸時間，解吸率變化不明顯。因此，選取4 h為最佳解吸時間。

圖3 D101樹脂靜態解吸平衡曲線

2.3 靜態吸附條件優化

2.3.1 樣品濃度對吸附效果的影響

從圖4可以發現，吸附率隨著樣液濃度的提高而逐漸降低，吸附量則逐漸增加。這是因為在低濃度條件下，樹脂未達到吸附飽和，吸附量過低；提高樣品的濃度會使單位表面積的樹脂與樣品的接觸量變大，吸附量增加；同時與黃酮競爭吸附位點的雜質也增多[6,10]，造成其吸附率逐漸下降。因此，選取3 mg·mL-1為最佳吸附樣品濃度。

圖4 樣品濃度對吸附效果的影響

2.3.2 樹脂質量對吸附效果的影響

從圖5可以發現，加大樹脂的質量，黃酮的吸附率呈現上升的趨勢，吸附量呈現下降的趨勢。這是因為樹脂質量的增加，一方面會導致吸附表面積增加，吸附位點數目增加，吸附率上升，繼續增加樹脂質量，吸附率逐漸趨于平衡；另一方面可能是分布在單位質量樹脂表面的黃酮濃度降低使得吸附量下降。為保持較高的吸附率和提高大孔樹脂的利用率，確定最佳樹脂質量為3 g。

圖5 樹脂質量對吸附效果的影響

2.3.3 pH對吸附效果的影響

黃酮類化合物的解離程度會受到樣品溶液pH影響，因為黃酮類化合物在不同的pH條件下溶解度和存在形式會有所不同，從而影響大孔樹脂對它的吸附效果[11]。根據圖6可知，隨著pH的增大，吸附率和吸附量均先升高再逐漸降低，當pH為4.0時吸附效果最好，吸附率為93.79%。黃酮類化合物因其分子中具有酚羥基，呈弱酸性，在此條件下溶解度降低，易被吸附；在堿性環境中易分解，不易被樹脂吸附[12]。因此，最佳吸附pH為4。

圖6 pH對吸附效果的影響

2.4 靜態解吸條件優化

2.4.1 乙醇洗脫體積分數對解吸效果的影響

從圖7可知，樹脂中黃酮的解吸率隨著乙醇濃度的增加而逐漸提高，當濃度為70%時，解吸率達到最大；繼續加大乙醇濃度，解吸率反而下降。可能是因為不同體積分數的乙醇，其極性大小也會不同，乙醇濃度越大，其極性越小，導致樹脂上被吸附的其他醇溶性雜質被洗脫下來，而70%的乙醇可能與樣品中的黃酮極性相似，解吸效果最好[11]。因此，最佳洗脫劑濃度為70%。

圖7 洗脫劑體積分數對解吸效果的影響

2.4.2 洗脫劑用量對解吸效果的影響

由圖8可知，當洗脫劑用量＜50 mL時，解吸率隨著洗脫劑用量的增加而增大，可能是洗脫液體積較小時，被大孔樹脂吸附的黃酮未被完全解吸；繼續加大洗脫劑的用量，被洗脫出來的黃酮總量逐漸增大。當洗脫劑用量＞50 mL時，解吸率變化不明顯?？紤]到減少乙醇成本，選取50 mL乙醇進行洗脫。

圖8 洗脫劑用量對解吸效果的影響

2.5 紫蘇葉黃酮純化工藝驗證結果

根據上述實驗得到的分離純化工藝條件，按1.3.5方法測定紫蘇葉總黃酮的純度。結果顯示，在最佳分離純化工藝條件下，紫蘇葉總黃酮的純度由39.22%提高至70.90%。

3 結論

通過比較5種不同類型的大孔樹脂對紫蘇葉總黃酮的分離純化效果，得出D101型大孔樹脂最適用于分離紫蘇葉中的總黃酮。同時，選取考察了5個單因素對總黃酮分離純化的影響，研究發現當樣品質量濃度3 mg·mL-1，樹脂質量為3 g，pH為4，乙醇濃度為70%，乙醇用量為50 mL時，紫蘇葉總黃酮的純度由39.22%提高至70.90%。