肺腺癌胸腔積液DNA倍體異常與EGFR突變的關系及其對患者預后的影響

劉 穎，王 蕊，郭 曉，董律吏，張 艷，趙銀環，杜 蕓

(河北醫科大學第四醫院癌檢中心，河北石家莊 050011)

肺癌是導致癌癥相關死亡的主要原因[1-2]，肺腺癌是肺癌中最常見的病理類型。晚期肺腺癌患者往往具有胸腔積液轉移，轉移性腫瘤細胞惡性程度越高，染色體越不穩定，DNA倍體異常細胞越多。應用計算機輔助DNA 倍體分析可以測定腫瘤細胞核的DNA 含量，計數胸腔積液中DNA倍體異常細胞。肺腺癌中最常見的驅動基因突變是表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)，在亞洲人中EGFR突變率為40%～62%[2]。EGFR突變狀態與肺腺癌生物學行為及預后相關，然而研究結果并不一致。DNA倍體異常通常用于輔助細胞病理學的診斷，已有研究表明DNA 倍體異常可能影響肺腺癌患者的預后[3]，DNA 倍體異常與腫瘤增殖密切相關，腫瘤細胞增殖一般伴有染色體數量和結構異常[4]，但對于DNA 倍體異常與EGFR突變之間的關系卻少見報道。本研究將肺腺癌患者胸腔積液中的肺腺癌細胞用于DNA倍體分析和基因檢測，分析癌細胞的DNA 倍體異常和EGFR突變之間的關系，并探究其對患者預后的影響。

1 材料與方法

1.1 病例收集

本研究采用回顧性分析來自河北醫科大學第四醫院2012年1月—2019年12月期間439例肺腺癌患者的臨床資料。患者的入選標準包括：①經細胞病理學診斷及免疫細胞化學確診為胸腔積液肺腺癌轉移；②單發肺癌；③有明確的DNA 倍體分析及EGFR基因突變檢測結果。所有患者均隨訪至死亡或研究截止日期(2019年12月31 日)，統計患者的總生存期(overall survival，OS)，即確診肺腺癌至患者出現死亡或本研究截止日期。本研究經過河北醫科大學第四醫院倫理委員會批準(批準文號2019MEC102)，且臨床資料收集均已獲得患者知情同意書。吸煙史定義為入院前平均每天吸煙≥1支，且持續時間超過6個月。

1.2 胸水的處理

用一次性細胞采集器富集胸腔積液中的腫瘤細胞，制作涂片，進行HE 染色。并采用免疫細胞化學法[5]，選擇NapsinA、TTF1、P40、P63、Syn、CD56、CEA、WT1等抗體診斷肺腺癌胸腔積液轉移。本實驗所有抗體均為即用型抗體，均購自福州邁新公司。

1.3 計算機輔助DNA倍體分析

制作胸腔積液涂片進行Feulgen 染色，使用購自武漢蘭丁的計算機輔助DNA圖像定量分析系統(DNAICM)檢測染色細胞核的集成光密度(integrated optical density，IOD)來測定細胞核DNA 含量，用DNA 指數(DNA index，DI)來表示DNA含量[6]。DI為腫瘤細胞核DNA均值與正常細胞DNA均值的比值，它反映了腫瘤細胞總DNA含量的相對水平。DI計算公式如下：

正常細胞的DI 是2c(1c 為正常G0/G1 組DNA 含量的一半，因此G0/G1 細胞為2c 細胞，即二倍體細胞)。大于5c 細胞(5 倍體細胞)被判斷為DNA 倍體異常細胞。計算大于5c 細胞的百分比，即DNA 含量大于5c的細胞數量/DNA 含量大于2c 的細胞數量×100%；大于9c 細胞的數目，即前20 個細胞中大于9c 的細胞數；大于5c 細胞的平均DI 值，即前20 個細胞中大于5c細胞的平均DI值。

非整倍體細胞峰為在2c以后可出現大量非整倍體細胞，并形成峰，根據形成峰的多少可分為無峰、單峰、雙峰和多峰。

1.4 EGFR突變檢測

利用人類EGFR基因突變檢測試劑盒(廈門艾德公司)，通過ABI 7500熒光定量PCR儀(美國Thermofisher公司)，采用擴增受阻突變系統-PCR 技術(amplification refractory mutation system，ARMS)對從胸腔積液腫瘤細胞中提取的DNA 進行擴增，檢測EGFR基因突變類型。PCR 反應條件：95 ℃、5 min；95 ℃、25 s，64 ℃、20 s，72 ℃、20 s，15 個循環；93 ℃、25 s，60 ℃、35 s，72 ℃、20 s，36個循環。

1.5 統計學分析

應用SPSS 21.0 軟件進行統計分析。采用卡方檢驗比較分類變量組間分布差異，計數資料用百分比表示，采用秩和檢驗、卡方檢驗和Kendall's taub系數評價DNA 倍體異常與EGFR突變的相關性，單因素生存分析用Kaplan-Meier 法及Log-rank 檢驗，多因素生存分析采用Cox 比例風險模型。以α=0.05 為檢驗水準。用R語言的最優截斷算法來確定連續參數的截斷值，選擇在生存分析中意義最大的截斷值作為最優截斷值。

2 結 果

2.1 EGFR基因突變與臨床病理指標的相關性

439例肺腺癌患者中，共有244例(55.58%)檢測出EGFR突變。其中外顯子19缺失100例(40.98%)，外顯子21突變113例(46.31%)，其他突變31例(12.7%)。如表1所示，EGFR突變與患者年齡無明顯相關關系。男性、有吸煙史、大于5c 細胞的百分比＜14%、大于9c細胞的數目＜8、最大DI 值＜6、大于5c 細胞的平均DI值＜5的患者，其EGFR基因突變率降低(P＜0.05)。非整倍體細胞峰的不同分組間EGFR突變率不同(P＜0.01)，兩兩比較發現單峰和雙峰EGFR突變率高于無峰患者，而多峰患者與其他各峰間EGFR突變率的差異無統計學意義(P＞0.05)。

表1 EGFR基因突變與肺腺癌患者臨床病理指標的相關性

2.2 DNA倍體異常與EGFR基因突變的相關性

如表2 所示，Mann-WhitneyU檢驗結果顯示，EGFR突變患者大于5c細胞的百分比、大于9c細胞的數目、最大DI 值、大于5c 細胞的平均DI 值、非整倍體細胞峰數的平均秩次高于EGFR野生型患者(P＜0.01)。Kruskal-WallisH檢驗結果顯示，EGFR各突變組間大于5c 細胞的百分比、最大DI 值、大于5c 細胞的平均DI值、非整倍體細胞峰數間的差異無統計學意義(P＞0.05)，而EGFR不同突變組大于9c細胞的數目經Bonferrni 法校正后兩兩分析比較發現，21號外顯子突變的大于9c 細胞的數目的平均秩次高于其他突變組(P=0.049)。采用Kendall's tau-b相關系數評價DNA 倍體異常和EGFR突變的關系，大于5c 細胞的百分比、大于9c 細胞的數目、最大DI 值、大于5c 細胞的平均DI 值、非整倍體細胞峰數均和EGFR突變均存在較弱的正相關關系(P＜0.05)，Kendall's tau-b分別為0.186、0.153、0.110、0.156、0.148，說明EGFR突變率隨DNA倍體異常比例增加而升高。

表2 DNA倍體異常與EGFR基因突變的相關性(平均秩次)

2.3 DNA 倍體異常與EGFR 突變對肺腺癌患者預后的影響

本實驗采用OS 作為主要結局指標。如表3 所示，單因素生存分析結果顯示，≤62 歲、女性、不吸煙的患者預后好于大于62歲、男性、吸煙的患者；大于5c細胞的百分比≥14%、大于9c細胞的數目≥8的患者預后好于大于5c 細胞的百分比＜14%、大于9c 細胞的數目＜8的患者；EGFR突變型患者的預后較EGFR野生型患者更好。而多因素生存分析結果顯示，大于5c細胞的百分比(P=0.171)、大于9c細胞的數目(P=0.176)及性別(P=0.799)與晚期肺腺癌患者預后無明顯相關關系；EGFR突變是患者的正向獨立預后影響因素，年齡、吸煙是患者的負向獨立預后影響因素，如表4所示。

表3 439例肺腺癌患者臨床及病理指標的單因素生存分析

表4 439例肺腺癌患者臨床及病理指標的多因素生存分析

3 討論

計算機輔助DNA倍體分析在細胞病理學診斷中發揮重要作用[7-10]，DNA 倍體異常代表腫瘤細胞染色體不穩定，與腫瘤發生發展相關[4]。EGFR是一種酪氨酸激酶受體，屬于ErBb 家族，EGFR基因突變與肺腺癌的發生發展及預后有著密切關聯。研究肺腺癌腫瘤細胞DNA 倍體異常與EGFR突變及預后的關系可以為肺腺癌患者個體化治療提供重要預測信息。

隨著人工智能的發展，越來越多的研究者發現基于病理圖像可以預測腫瘤相關指標，包括基因突變、分子亞型、治療效果等[11-13]。王荃等[14]的研究結果顯示非小細胞肺癌的病理圖像可以預測EGFR基因突變。DNA倍體分析作為一種低級別人工智能，本研究探索了基于DNA 倍體異常預測EGFR基因突變的可能性。有研究表明DNA 異倍體與EGFR基因突變狀態有關，EGFR突變患者DNA 異倍體比例較野生型患者更高[15]。在本研究中，在大于5c細胞的百分比、大于9c細胞的數目、最大DI 值、大于5c 細胞的平均DI 值不同組別中，高值組的患者EGFR突變率高于低值組的患者，與文獻[15]報道結果一致。與EGFR野生型患者相比，EGFR突變型的大于5c 細胞的百分比、大于9c細胞的數目、最大DI 值、大于5c 細胞的平均DI 值和非整倍體細胞峰數的平均秩次更高。在EGFR不同突變組間，21號外顯子突變的大于9c細胞的數目平均秩次高于其他突變組，而在其他DNA 倍體異常指標中EGFR不同突變組間無明顯差異。EGFR突變與各DNA倍體異常指標均存在較弱的正相關關聯。這表明DNA倍體異常與EGFR基因突變有著一定的相關性，在一定程度上可以用來預測EGFR基因突變。

在一項有關96例I～IIIA期手術切除NSCLC患者的研究中[16]，在單因素分析中大于5c 細胞的百分比＜5%患者較大于5c 細胞的百分比≥5%患者有更高的OS，而在多因素分析后結果表明大于5c細胞的百分比并不能作為一個獨立預后因素。單因素分析結果與本研究中的結果相反，可能與患者的臨床分期和大于5c細胞的百分比分界值不同有關，而多因素分析結果與本研究結果一致。在本研究中，單因素生存分析結果顯示，大于5c細胞的百分比≥14%、大于9c細胞的數目≥8的患者預后好于大于5c細胞的百分比＜14%、大于9c 細胞的數目＜8 的患者，EGFR突變型患者預后好于EGFR野生型患者。但多因素生存分析結果顯示，DNA倍體異常與晚期肺腺癌患者OS無關，EGFR基因突變組OS 的HR=0.576(95% CI 為0.465～0.714，P＜0.05)，這表明EGFR基因突變是肺腺癌患者的獨立預后因素，而DNA倍體異常并不是肺腺癌患者的獨立預后因素。DNA倍體異常與預后的關系在單因素和多因素分析中結果不同，這可能是因為DNA 倍體異常與EGFR基因突變關聯密切有關，DNA 倍體異常作為一個混雜因素在多因素生存分析中被剔除。

一項薈萃分析[17]表明，在肺癌手術患者中，與EGFR野生型患者相比，EGFR突變患者OS 更長。此外，一項關于5780例早期非鱗狀NSCLC 患者的回顧性研究[18]發現EGFR突變患者的無復發生存期和OS 比野生型患者均顯著延長。這與本研究結論相符，在本研究中，晚期肺腺癌患者EGFR突變組的OS優于非突變組。而許麗莉等[19]的研究結果顯示在早期肺腺癌患者中，EGFR突變狀態與患者術后無病生存期及OS無顯著相關性，不是影響患者預后的獨立因素，但相比EGFR外顯子21 L858R 突變患者，EGFR外顯子19 缺失患者的術后復發風險更高。Ito等[20]的一項多中心回顧性分析發現在病理分期IA～IB 期的高度惡性亞型和病理分期ⅡA～ⅢA期病例中，單因素和多變量分析顯示EGFR突變患者的5年無復發生存率低于EGFR野生型患者。EGFR突變狀態在肺癌患者中的預后影響存在明顯爭議，可能是由于肺癌患者的分期及組織學亞型不同，或者患者攜帶有其他驅動基因突變，這些因素均會影響研究結果。

本研究中年齡和吸煙史與晚期肺腺癌患者預后有關，年齡＜62 歲患者預后好于年齡≥62 歲的患者；無吸煙患者預后好于吸煙患者，與文獻[21]報道相符。但本文僅隨訪了患者OS，并未統計患者的無進展生存時間，可能會使結果存在一定的局限性，后續研究中我們將進一步擴大樣本量，延長隨訪時間，增加患者無進展生存時間指標，進一步分析DNA 倍體異常與EGFR基因突變對患者預后的影響。

晚期肺腺癌患者常常較難獲得組織學標本，本研究采用胸水細胞學標本進行DNA 倍體異常與EGFR突變檢測，將DNA 倍體異常與EGFR突變進行相關性分析，并用COX單因素和多因素生存模型分析兩者與預后的關系，為晚期肺腺癌患者的預后及精準治療提供了依據。

總而言之，晚期肺腺癌患者中EGFR基因突變與DNA 倍體異常存在關聯，DNA 倍體異常是預測EGFR基因突變的潛在指標。DNA倍體異常不是晚期肺腺癌患者的獨立預后影響因素，而EGFR基因突變患者預后好于野生型患者，可作為晚期肺腺癌患者預后的預測因子。