miR-495通過抑制RNF113A的表達調控食管鱗癌細胞惡性表型

付 靜，劉 清，于海葉，王 磊

(新疆醫科大學第一附屬醫院消化內科，新疆烏魯木齊 830011)

中國是食管癌發病率最高的國家，食管癌患者的5年總生存率通常低于20%，晚期食管癌患者的5年總生存率低于10%[1-2]，預后較差。環境和遺傳因素均可導致食管癌的發生。有特殊飲食和生活方式的人，如經常食用腌制食品、熱食品，長期飲酒和大量吸煙，更容易患食管癌[3-4]；攜帶某些突變基因的人對腫瘤的易感性更高[5-6]。外科手術是食管癌的常用治療方法，但治療效果欠佳[7]，因此，尋求早期食管癌特異性的診斷和治療靶點具有重要意義[8-9]。

微小RNA(miRNA，miR)是一種能與靶基因mRNA的3′-非翻譯區(3′-untranslated region，3′-UTR)結合的內源性單鏈小分子RNA，長度約為22 nt 且不編碼蛋白質，其通過在轉錄后水平降解mRNA 或抑制翻譯來調節基因的表達[10]。miRNAs影響癌細胞的生物學行為，包括增殖、遷移、侵襲、細胞周期和凋亡，并在腫瘤的發生和發展中發揮作用[11-13]。miR-495作為較常見的miRNA，在多種腫瘤中異常表達，在食管癌中miR-495 表達下調，發揮抑癌基因的作用。目前，miR-495與其靶基因RNF113A在食管癌中的作用及調控機制尚不清楚。因此，本文將miR-495轉染入人食管鱗癌細胞Eca109，探討miR-495對食管鱗癌細胞惡性表型的影響及其分子機制。

1 材料與方法

1.1 細胞系及試劑

人食管鱗癌細胞系Eca109購自武漢大學細胞典藏中心，DMEM(高糖)培養基、胰酶、青霉素-鏈霉素雙抗購于Gibco 公司，胎牛血清(FBS)購于Excell Bio公司，CCK-8 細胞增殖/毒性檢測試劑盒和BCA 蛋白定量試劑盒購于全式金生物公司，miRNA 熒光定量PCR 試劑盒和蛋白預染Marker 購于上海生工公司，Lipofectamin RNAiMAX 購于Thermo Fisher 公司，TRIzolTMReagent 購于Ambion 公司，Transwell 小室購于Corning 公司，RIPA 裂解液和蛋白酶抑制劑購于博士德公司，β-actin Loading Control Antibody購于義翹神州，Anti-RNF113A購于Abcam公司。miR-495模擬物(miR-495 mimics) 和miR-49 抑制劑(miR-495 inhibitor)購于通用生物公司。

1.2 細胞分組處理

Eca109 采用DMEM 培養基添加10%胎牛血清和1%青-鏈霉素雙抗溶液置于37 ℃、飽和濕度、CO2體積分數為5%的培養箱中培養，待細胞匯合率達70%時使用Lipofectamin RNAiMAX試劑進行轉染。細胞分為模擬物對照組(mimics NC)、miR-495 模擬物組、抑制劑對照組、miR-495 抑制劑組，具體操作按照試劑說明書進行。

1.3 實時熒光定量PCR 檢測細胞中miR-495 的表達水平

提取各組細胞中總RNA，將RNA 逆轉錄為cDNA，根據實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)試劑盒說明書的操作步驟進行擴增檢測miRNA 的表達，miR-495 以U6 為內參，采用2-ΔΔCT法計算miR-495的相對表達量。

1.4 CCK-8試劑盒檢測細胞增殖

將各組Eca109 細胞按照5×104個/mL 的濃度分別接種至96 孔板，每孔100 μL，于37 ℃、CO2體積分數為5%的培養箱中培養48 h，每孔加入100 μL濃度為10%的CCK-8 溶液，在培養箱中孵育1 h 后，采用酶標儀測定各孔450 nm處吸光度值。

1.5 流式細胞術檢測細胞周期和細胞凋亡

將Eca109 細胞調整為1×105個/mL 的單細胞懸液，接種至6 孔板中，每孔2 mL，然后胰酶消化細胞，PBS 沖洗，用預冷PBS 重懸細胞，將一部分細胞懸液加入到3.5 mL 預冷的80%乙醇中，4 ℃固定過夜，離心、沉淀細胞。用預冷的PBS 洗滌，加入500 μL PI/RNase 染色緩沖液(staining buffer)重懸細胞并獲得單細胞懸液。4 ℃避光孵育30 min 后流式細胞術(flow cytometry，FCM)檢測細胞周期變化。另一部分細胞懸液，每管加入10 μL 的7-氨基放線菌素D(7-aminoactinomycin D，7-AAD)和5 μL 膜聯蛋白V-PE(Annexin V-PE)，4 ℃避光孵育5 min，在30 min 內檢測細胞凋亡率。

1.6 Transwell實驗檢測細胞遷移與侵襲

將基質膠稀釋后加入Transwell 小室的上層，37 ℃溫育5 h，用無血清培養基懸浮細胞，調整濃度為3×105個/mL，取100 μL 細胞懸液加入到Transwell小室的上層，將600 μL DMEM 完全培養基加入到Transwell下層，培養72 h，PBS沖洗，用4%甲醛固定20 min，結晶紫染色后于顯微鏡(×100)下隨機取5個視野統計細胞侵襲的數量。細胞遷移實驗無需預鋪基質膠，將無血清細胞懸液接種到Transwell小室，其余步驟同上。

1.7 下游靶基因RNF113A mRNA 和蛋白表達的檢測

RNF113A 以β-actin 為內參，采用qPCR 檢測RNF113A mRNA 的表達，方法同1.3。采用Western blot 檢測RNF113A 蛋白的表達。蛋白提取步驟：待培養皿中細胞匯合度達到80%～90%時，向細胞樣本加入200 μL RIPA 裂解液(已按1∶100 比例加入蛋白酶抑制劑和廣譜磷酸酶抑制劑)，充分混勻，4 ℃環境下設5 min 渦旋振蕩1 次，連續5 次后，以12000 r/min、4 ℃離心15 min 收集上清。加入1/3 體積的4×上樣緩沖液(loading buffer)，100 ℃金屬浴加熱處理10 min，使蛋白充分變性，-20 ℃凍存備用。用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離提取的總蛋白，后進行電泳、轉膜和封閉，在4 ℃的環境中一抗孵育過夜。抗體β-actin(1∶3000)和RNF113A(1∶1000)稀釋。TBST漂洗，加入稀釋后的二抗，山羊抗鼠IgG H&L(HRP)(1∶15000 稀釋)和山羊抗兔IgG H&L(HRP)(1∶5000稀釋)室溫孵育1 h，TBST漂洗，采用化學發光儀進行檢測、拍照。

1.8 統計學方法

應用SPSS 19.0 軟件進行統計學分析，數據采用xˉ±s表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組細胞中miR-495的表達水平

空白對照組、模擬物對照組、miR-495 模擬物組、抑制劑對照組和miR-495 抑制劑組細胞miR-495的相對表達水平分別為1.013±0.186、1.030±0.212、1.423±0.231、1.055±0.158和0.602±0.157。與模擬物對照組相比，轉染miR-495模擬物組miR-495 mRNA水平顯著升高；與抑制劑對照組相比，轉染miR-495抑制劑組miR-495 mRNA水平顯著降低，差異均有統計學意義(P＜0.05)，見圖1。

圖1 各組細胞中miR-495的表達水平

2.2 miR-495對Eca109細胞增殖的影響

模擬物對照組、miR-495 模擬物組、抑制劑對照組和miR-495 抑制劑組培養48 h 后的D(450)值分別為0.871±0.046、0.831±0.050、0.866±0.060 和0.884±0.026，miR-495過表達或抑制劑干擾對食管癌Eca109細胞增殖均無顯著影響。各組細胞間增殖能力均無顯著變化(F=1.962，P=0.139)，見圖2。

圖2 miR-495對Eca109細胞增殖的影響

2.3 miR-495對Eca109細胞周期和細胞凋亡的影響

模擬物對照組、miR-495 模擬物組、抑制劑對照組、miR-495 抑制劑組G0/G1 期細胞比例分別為(48.073±0.665)%、(56.280±0.563)%、(48.950±1.470)%和(50.413±0.437)%；S 期細胞比例分別為(25.850±1.296)% 、 (15.223 ± 0.754)% 、 (26.123 ± 2.456)% 和(31.150±1.532)%；細胞凋亡率分別為(3.300±0.854)%、(5.800±1.136)%、(3.433±0.577)%和(2.733±0.513)%，與模擬物對照組相比，轉染miR-495 模擬物后G0/G1 期細胞顯著增多、S期減少、G2/M期增多、細胞凋亡顯著增多(P＜0.01)，說明miR-495 阻滯細胞分裂停留在G0/G1期；與抑制劑對照組相比，轉染抑制劑后S期顯著增多、G2/M期顯著減少。凋亡細胞顯著減少，差異均具有統計學意義(P＜0.01)，說明抑制miR-495后細胞DNA合成活躍，大量細胞進入S期，見圖3和圖4。

圖3 miR-495對Eca109細胞周期的影響

圖4 miR-495對Eca109細胞凋亡的影響

2.4 miR-495對Eca109細胞遷移和侵襲能力的影響

模擬物對照組、miR-495 模擬物組、抑制劑對照組和miR-495 抑制劑組細胞遷移數量分別為(95.3±6.3)、(63.8±5.2)、(96.9±4.9)和(104.9±5.3)個；侵襲數量分別為(93.6±6.4)、(63.7±6.1)、(94.3±5.8)和(105.8±7.1)個。與模擬物對照組比較，轉染模擬物后遷移和侵襲細胞數均顯著減少(P＜0.01)；與抑制劑對照組相比，轉染抑制劑后遷移和侵襲細胞數均顯著增多，差異均具有統計學意義(P＜0.01)，見圖5和圖6。

圖5 miR-495對細胞遷移能力的影響

圖6 miR-495對細胞侵襲能力的影響

2.5 miR-495 對細胞中RNF113A mRNA 和蛋白表達的影響

模擬物對照組、miR-495模擬物組、抑制劑對照組和miR-495抑制劑組RNF113A mRNA相對表達水平分別為1.126±0.219、0.967±0.142、1.084±0.222和1.202±0.291；RNF113A 蛋白相對表達水平分別為0.600±0.010、0.380±0.050、0.700±0.010 和0.810±0.040。轉染miR-495模擬物和抑制劑后，RNF113A mRNA表達水平無明顯變化(F=0.833，P=0.520)；而轉染模擬物后，RNF113A 蛋白表達水平較對照組下降(P＜0.05)；轉染抑制劑后RNF113A 蛋白表達水平較對照組升高，差異具有統計學意義(P＜0.05)，見圖7和圖8。

圖7 miR-495對細胞中RNF113A mRNA相對表達水平的影響

圖8 miR-495對細胞中RNF113A蛋白相對表達水平的影響

3 討論

miR-495 位于14 號染色體14q32.31 上[14]，參與實體腫瘤和血液腫瘤細胞的增殖、侵襲、轉移和化學敏感性的變化[15]。已有研究證實miR-495 在多種惡性腫瘤中表達失調，包括非小細胞肺癌[16]、胰腺癌[17]、卵巢癌[18]、腎癌[[19]、胃癌[20]、肝細胞癌[21]、膽囊癌[22]。miR-495 作為抑癌基因或癌基因在不同類型的腫瘤中發揮不同的作用[23-24]。例如miR-495 在乳腺癌干細胞中高表達，可直接抑制E-cadherin 的表達從而促進腫瘤發展[25]。而在大多數實體腫瘤中，miR-495 發揮抑癌基因的作用，例如miR-495可抑制神經膠質瘤細胞的增殖、凋亡和侵襲[26]；在胃癌組織中，miR-495 的表達與磷酸酶-3(PRL-3)的上調有關，PRL-3 是miR-495 的下游靶點，轉染miR-495 模擬物可抑制胃癌細胞的侵襲和轉移[27]。本研究顯示miR-495 在食管鱗癌細胞中表達下調，轉染miR-495模擬物可抑制食管鱗癌細胞的侵襲和遷移，促進食管鱗癌細胞凋亡，發揮抑癌基因的作用。

miR-495 在食管癌中的研究較少，在食管鱗癌進展中的具體功能及分子機制仍不清楚。Mao 等[28]在食管鱗癌的研究中發現，與正常食管組織相比，miR-495 在食管鱗癌組織中表達水平降低，miR-495可通過調控上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)及RACα 絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(RAC-alpha serine/threonine-protein kinase)信號通路影響細胞周期來抑制食管癌細胞增殖、侵襲和遷移，同時miR-495的異常表達與食管癌患者的預后、淋巴結轉移和TNM分期有關。miR-495通過靶向ATP酶銅轉運α(ATPase copper transporting alpha，ATP7A)基因抑制食管癌細胞的順鉑耐藥和血管生成[29-30]。

在本研究中，miR-495 過表達或抑制干擾對食管鱗癌Eca109 細胞增殖無顯著影響，Mao 等[28]的研究結果與此不同，他們通過集落形成實驗發現miR-495過表達可抑制Eca109和TE-1細胞系的增殖，因此miR-495 對食管癌細胞增殖的影響尚需進一步驗證。本研究發現過表達miR-495抑制了Eca109細胞遷移和侵襲能力，并促進了細胞凋亡，相反抑制miR-495后促進了細胞的侵襲和遷移能力，并抑制了細胞凋亡，改變了食管鱗癌細胞周期的分布。環指蛋白113A(ring finger protein 113A，RNF113A)作為RING 家族的一員，具有泛素連接酶功能，其主要位于Xq24-q25 號染色體上，可編碼一種蛋白質，其中包含兩個與DNA烷基化修復和精子RNA拼接有關鋅指域[31]。RNF113A在結構上具有特異性，主要依靠其結構特征來發揮作用，其結構主要由兩個鋅離子整合形成特征性的環形結構，形似一把鉗子，可以鉗住相應的靶蛋白，從而參與調解許多靶蛋白的周轉和活性[27]。miR-495 和很多環指蛋白密切相關，環指蛋白的結構組具有高度的保守性，而RNF113A作為其中的一員，因此我們推測miR-495與RNF113A之間可能存在某種關系。為進一步確認miR-495 對RNF113A 的調控，我們進行了qPCR 及Western blot 實驗，結果顯示與對照組比較，轉染miR-495 模擬物組RNF113A 蛋白表達水平下調，轉染miR-495 抑制劑組RNF113A 蛋白表達水平上調，但RNA水平未見顯著變化，說明miR-495可能通過轉錄后修飾以負向調控RNF113A蛋白的表達。既往研究顯示miR-495可與多種靶基因結合，通過調控靶基因的表達進而調控腫瘤細胞的生物學行為。例如miR-495 作為腫瘤抑制因子，在非小細胞肺癌中被下調，腫瘤轉移基因3(MTA3)是公認的非小細胞肺癌淋巴結轉移的危險因素。miR-495 可以通過靶向MTA3 mRNA 降解影響非小細胞肺癌的轉移[32]。miR-495 在結腸癌中表達下調，miR-495通過調控膜聯蛋白A3基因抑制結腸癌細胞的增殖和侵襲[33]。有研究發現，miR-495通過靶向Akt1抑制細胞周期轉換和EMT信號通路，從而抑制食管癌細胞增殖、遷移和侵襲[26]。本研究結果顯示，Eca109細胞過表達miR-495后，細胞凋亡增加，侵襲和遷移能力下降，與上述研究結果一致，但該研究未進行miR-495 與RNF113A 關系的探討，本研究首次發現miR-495可以負向調控RNF113A的蛋白表達，從而調控食管鱗癌細胞惡性表型。

綜上，miR-495對Eca109細胞增殖能力無顯著影響，但可促進細胞凋亡，抑制其遷移和侵襲能力，并調控細胞周期分布，同時miR-495 可通過抑制RNF113A 的蛋白表達調控Eca109 細胞惡性表型。本研究表明miR-495在食管鱗癌發生發展中起著關鍵作用，有望成為食管鱗癌診斷及治療的新靶點。然而，由于靶基因調控具有多樣性，miRNA-495調控食管癌細胞惡性表型是否通過與其他靶基因的相互作用，還需要進一步探索。