紅酸湯自然發酵中番茄紅素順反異構變化及影響因素相關性分析

周艷　李會　宋小娟

摘要：為了探究紅酸湯在自然發酵過程中番茄紅素構型的變化及可能的影響因素，采用高效液相色譜法測定發酵不同時間紅酸湯的番茄紅素順反式異構體種類及其含量，分析pH值、滴定酸度、有機酸與總番茄紅素之間的相關性。結果表明，在整個自然發酵過程中，有機酸會引起番茄紅素的異構化，且蘋果酸對順式番茄紅素總量、（13Z）-番茄紅素含量、（5Z）-番茄紅素含量呈顯著相關（P<0.05）。

關鍵詞：紅酸湯；番茄紅素；異構體；有機酸

中圖分類號：TS205.5文獻標志碼：A 文章編號：1000-9973（2023）06-0173-05

Abstract： In order to explore the changes of lycopene configuration during the natural fermentation of red sour soup and the possible influencing factors， high performance liquid chromatography is used to determine the types and content of cis-trans isomers of lycopene in red sour soup at different fermentation time， and the correlation among pH value， titratable acidity， organic acids and total lycopene. The results show that organic acids can cause the isomerisation of lycopene throughout the natural fermentation process and malic acid is significantly correlated with total amount of cis-lycopene， the content of （13Z）-lycopene and （5Z）-lycopene （P<0.05）.

Key words： red sour soup; lycopene; isomer; organic acids

收稿日期：2022-12-30

基金項目：貴州省科技計劃項目（黔科合基礎[2019]1254號）；貴州省高等學校工程研究中心（黔教合KY字[2021]008）

作者簡介：周艷（1987－），女，副教授，博士，研究方向：食品營養。

*通信作者：宋小娟（1990－），女，講師，碩士，研究方向：食品微生物與發酵。

紅酸湯是以番茄作為主要原料經發酵而成的民族特色食品[1]，其中以凱里紅酸湯最為出名[2]，其鮮紅的顏色與原料中的番茄紅素有關。研究表明，順式番茄紅素更有利于被人體的腸細胞吸收[3]，人類血清中58%～73%的番茄紅素是順式番茄紅素，前列腺組織中順式番茄紅素更是高達79%～88％[4]。順式構型的番茄紅素易溶于烹飪過程中的油，且此過程中全反式番茄紅素更多地向順式番茄紅素轉化[5]。Honda M等[6]對近4萬名中老年婦女進行長期測試發現攝入更多番茄與油混合的食物有益于心血管疾病的防治。

如何提高番茄制品中順式番茄紅素的含量也成為近些年的研究熱點。才美慧等[7]對千禧番茄中鑒定出的8種番茄紅素進行了研究，發現隨著濃縮時間的延長，其順式番茄紅素總含量增加了1%左右。余佳浩[8]研究發現洋蔥的添加能顯著地促進番茄紅素順式異構化，洋蔥中的含硫化合物如二烯丙基二硫（DADS）是起作用的主要成分。王雪松等[9]采用直接光化學合成技術得到73%含量的順式異構體。孫清瑞[10]利用I-TiO2作為催化劑，以乙酸乙酯為溶劑，在番茄紅素濃度為1 mg/mL、75 ℃條件下反應2 h，番茄紅素順式占比可達75%以上。除此之外，張環偉[11]采用超聲-微波法處理番茄紅素5 h后，順式異構體占比均可以達到54%。除了熱處理、光處理、催化劑的影響，酸類也能影響番茄紅素的構型組成，研究表明，胃內利用胃酸的pH影響番茄紅素的異構化，這是順式番茄紅素在人體吸收中大幅度上升的主要原因[12-13]。紅酸湯是一種自然發酵類食品，湯慶莉等[14]對凱里紅酸湯的特征性成分進行分析，發現紅酸湯中含有多種有機酸，其中以乳酸含量最高。熊瑛等[15]用高效液相色譜法對不同酸湯中的有機酸進行檢測，同樣發現酸湯中的有機酸主要有酒石酸、乳酸、乙酸、檸檬酸和丁二酸。

課題組前期對凱里地區8種品牌的紅酸湯進行分析，發現番茄紅素的滴定酸度與番茄紅素總量、順式番茄紅素總量、全反式番茄紅素含量及（13Z）-番茄紅素含量都顯著性相關（R>0.6）[16]，說明番茄紅素含量及構型的變化與酸有關，酸可以促進全反式番茄紅素轉化為順式構型。因此，在發酵過程中番茄紅素存在構型轉化，且可能與有機酸有關。鑒于此，本研究以自然發酵紅酸湯為對象，探究自然發酵過程中有機酸的種類和含量與番茄紅素順反異構體間的轉化是否具有相關性，探索富含順式番茄紅素的紅酸湯的加工工藝條件，為貴州紅酸湯產業的發展提供了理論支撐。

1 材料與方法

1.1 原料

番茄：貴陽永輝超市。

1.2 實驗儀器與設備

PHS-3C型pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司；Agilent 1100型高效液相色譜儀 美國安捷倫有限公司；Legend Micro 21R型高速離心機 Thermo Fisher Scientific公司；SHP-160型智能生化培養箱 上海三發科學儀器有限公司；1510型酶標儀 賽默飛世爾科技有限公司；TS-5000Z型折光儀 日本INSENT公司。

1.3 實驗試劑

氫氧化鈉（分析純）：江蘇吉利鼎生物科技公司；甲醇（色譜純）、甲基叔丁基醚（色譜純）、乙酸乙酯（分析純）、冰醋酸（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 發酵紅酸湯制作工藝及操作要點

自然發酵：選材→洗凈→晾干→破碎→加入6%食鹽→拌勻→裝罐→發酵。

操作要點：取6 000 g無病害番茄清洗，晾干，破碎后加入60 g食鹽混合裝壇，置于30 ℃條件下發酵。每次取樣前，對取樣工具進行清洗、消毒滅菌處理。采集的酸湯樣品發酵時間分別為1，3，7，14，21，28，42 d。樣品測定指標前均置于－20 ℃保存。

1.4.2 檢測指標

總酸的測定[17]：采用酸堿滴定法；pH的測定：采用pH計；可溶性固形物的測定：參考GB/T 10786—2006《罐頭食品的檢驗方法》[18]。

有機酸的測定：采用高效液相色譜法，吸取適量上述濾液，經0.22 μm濾膜過濾裝入進樣瓶中，流動相B為pH 2.4、濃度0.01 mol/L的磷酸二氫銨溶液，流動相C為色譜級甲醇溶液。B和C的比例為99∶1，流速為0.5 mL/min，等度洗脫，柱溫為25 ℃，時間為15 min，進樣量為10 μL，波長為210 nm。所測標準曲線見表1。

1.4.3 番茄紅素順反異構體

1.4.3.1 番茄紅素異構體鑒別

從高效液相色譜圖中提取各組分峰值最高點的全波長掃描圖，鑒別番茄紅素異構體并截取270～600 nm的特征區域。然后根據其光譜信息計算Q值，即在361～362 nm附近出現的順式特征吸收峰與最大吸收波長的主吸收峰強度的比值，再結合特征吸收峰位置及單峰保留時間具體鑒別番茄紅素異構體。

1.4.3.2 番茄紅素順反異構體液相條件設定

采用高效液相色譜法。流動相C為乙腈∶甲醇為3∶1的混合溶液，流動相D為甲基叔丁基醚，所用溶液均為色譜級。梯度條件：0～45 min時，C相30%，D相70%；55～65 min時，C相由30%增加到80%，D相由70%減少到20%；65～67 min時，維持C相80%，D相20%，流速為0.8 mL/min，柱溫為25 ℃，進樣量為20 μL，DAD測定波長為472 nm。吸取適量上述濾液，經0.45 μm濾膜過濾備用。標準曲線：y=181 882x－150.07，R2=0.999。

1.4.4 數據處理

每組樣品重復測定3次取平均值，結果以平均值±標準差（x±s）呈現。滴定酸度、有機酸和番茄紅素各構型含量采用SPSS 20軟件進行相關性分析，使用Origin 2021軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 發酵過程中紅酸湯pH值、滴定酸度和可溶性固形物的變化

由圖1可知，在初始發酵階段，pH值在整體呈下降趨勢，這是因為紅酸湯在發酵中，滲透壓的作用造就了乳酸菌有利的生長環境[19]，加入的食鹽也能在發酵初期抑制腐敗菌的生長。整個發酵過程中，紅酸湯的pH值范圍在3.18～4.11。在發酵進行1～3 d內，pH值從3.86～4.11小幅度上升，這可能是因為此時的乳酸菌在發酵前期還不是優勢菌種。從第3天開始，pH值逐漸下降。最終停留在3.18左右。發酵后期，乳酸菌成為優勢菌種，快速利用番茄中的營養物質產生乳酸是pH值下降的主要原因。而當乳酸菌利用完罐中的有機物質時，發酵過程中會產生其他有機代謝產物胺與氨等含氮的堿性物質，與有機酸進行中和，pH值的下降減緩[20]；紅酸湯的可溶性固形物含量則逐漸下降，由初始的8 °Bx下降到6.7 °Bx，發酵第21天后趨于穩定，最終為6.73 °Bx；在實驗的發酵周期內，紅酸湯的滴定酸度呈現上升趨勢，在發酵7～14 d之后，總酸含量陡增，從56.67 mmol/L增加至116.44 mmol/L，發酵罐中的酸度開始積累，說明發酵酸湯中的微生物大量繁殖，開始利用糖肽物質進行產酸，使得紅酸湯中的總酸含量增加。在發酵進行到第21天時，酸度達到最高值，21 d后由于酸湯中微生物所需的營養物質被過量消耗，微生物的生長受到限制，使得酸湯中的總酸含量逐漸降低，這與pH值的變化一致，含量在27.98～137.67 mmol/L內，含量變化較大，這也間接表明酸湯含有的有機酸種類和含量差異可能比較大。

2.2 發酵過程中紅酸湯4種有機酸的含量變化

由圖2可知，在發酵過程中，樣品的乳酸含量在1.79～21.78 g/kg范圍內呈先上升后下降又上升的趨勢，在2021年黔東南州凱里酸湯產業發展協會團體標準[21]中指出，酸湯中乳酸的理化指標范圍≥8.0 g/kg，在發酵0～3 d內，乳酸含量下降，說明此時的乳酸菌并不是發酵的優勢菌種，與滴定酸度含量變化一致；而對比此時乙酸的含量一直處于上升態勢，乳酸含量則在發酵1周之后開始大幅上升。乳酸含量變化比乙酸含量變化明顯，乳酸經過1周的發酵就能達到評價指標所需的含量，從這一點標示，此次罐中酸湯發酵進程開始進入成熟階段。氣相色譜法檢測出的樣品的乙酸含量在1.71～3.16 g/kg，含量變化呈上升趨勢，且趨勢逐漸變緩。乙酸含量沒有乳酸含量積累的多，這也符合在對酸湯評價過程中，以乳酸計的總酸含量是酸湯產品的特征之一[22]。有機酸是酸湯發酵中重要的呈味物質，本次發酵還檢測出兩種微量有機酸——蘋果酸和檸檬酸，蘋果酸含量和檸檬酸含量在發酵21 d后趨于平穩，乳酸含量在21～28 d也趨于穩定，說明本次發酵在21 d后進入完成階段。

2.3 發酵過程中紅酸湯番茄紅素各構型及其含量變化

由表2可知，隨著發酵時間的延長，番茄紅素的含量呈先升高后緩慢降低最后又升高的過程。在大量有益菌的作用下[23]，第14天以后均呈現增加趨勢，發酵第42天時，微生物代謝產物達到最大，發酵液中營養物質被大量消耗[24]。全反式構型番茄紅素含量在發酵第1天時為（2.91±0.11） mg/kg，在發酵第42天時，含量升高至（3.54±0.13） mg/kg。順式構型番茄紅素在發酵第1天時，初期含量為（0.41±0.07） mg/kg，在發酵末期第42天時，含量升高至（0.77±0.05） mg/kg。

通過高效液相色譜圖定性可知，在樣品中測定出3種順式構型番茄紅素，分別為（5Z）-番茄紅素、（13Z）-番茄紅素2種已知構型的番茄紅素和1種未知構型的番茄紅素。3種番茄紅素中，（5Z）-番茄紅素構型的含量相對較高，為0.19～0.28 mg/kg，其含量占順式構型番茄紅素總含量的41%，是最豐富的Z-順式異構體。（13Z）-番茄紅素構型含量在0.16～0.24 mg/kg，未知構型番茄紅素含量在0.18～0.25 mg/kg。全反式番茄紅素含量在2.78～3.54 mg/kg。對比紅酸湯發酵初期與末期各構型含量，順式構型含量大幅上升，這可能與發酵酸湯中富含的有機酸有關。

2.4 發酵過程中紅酸湯番茄紅素順反異構化可能性因素的相關性分析

天然番茄紅素是含有2個非共軛雙鍵和11個共軛雙鍵的長鏈開環結構。長鏈多共軛雙鍵和烯烴分子結構富含電子，易受親電子試劑攻擊。當番茄紅素分子從反式構型轉變為順式構型時，顏色變淺[25]。在pH對番茄紅素穩定性研究中，發現pH越小，番茄紅素的吸光度越小，且在pH＜6（有機酸）條件下，番茄紅素不穩定，酸性越強，穩定性越弱。在檸檬酸為2.26 μg/mL和0.92 μg/mL條件下測定番茄紅素的吸光度，可知在2.26 μg/mL下吸光度下降更大，說明溶液中氫離子濃度的較大變化可能會導致其構型的變化[26]。有機酸是弱酸，能夠游離出氫離子，進而影響番茄紅素分子結構從反式構型向順式構型轉化。同樣，Vidmantiene等[27]研究表明番茄的乳酸發酵會提高番茄紅素的生物利用率，同時會提高順式番茄紅素的含量。

紅酸湯自然發酵周期中，各項指標均出現坡度變化，例如有機酸積累出現在發酵的后半程，這與番茄紅素順式構型和全反式構型的含量變化一致。在此發酵環境下，對滴定酸度、總番茄紅素、有機酸（乳酸、乙酸、蘋果酸和檸檬酸）、pH值與番茄紅素各構型進行相關性分析（P<0.05），結果見圖3。

結果表明，滴定酸度與乳酸、檸檬酸含量高度相關，相關系數分別為0.80，0.81；與乙酸和檸檬酸含量顯著相關，相關系數分別為0.72，0.67；與順式番茄紅素總量、（13Z）-番茄紅素、（5Z）-番茄紅素和順式占比的含量顯著相關，相關系數分別為0.60，0.59，0.57，0.50。

乙酸含量與順式番茄紅素總量、（13Z）-番茄紅素、（5Z）-番茄紅素和順式占比的含量顯著相關，相關系數分別為0.59，0.52，0.59，0.54；乳酸含量與順式番茄紅素總量、（13Z）-番茄紅素、（5Z）-番茄紅素和順式占比的含量呈低相關，相關系數分別為0.50，0.49，0.41，0.42。乙酸對番茄紅素順反式異構化的作用大于乳酸，這符合前期研究結論。

檸檬酸對順式番茄紅素總量、（13Z）-番茄紅素含量呈低相關，相關系數分別為0.43，0.48，與（5Z）-番茄紅素、順式占比的含量呈低相關，說明檸檬酸對在酸湯發酵過程中發生的番茄紅素順反式異構化作用小。蘋果酸與順式番茄紅素總量、（13Z）-番茄紅素含量、（5Z）-番茄紅素含量顯著相關，相關系數分別為0.73，0.57，0.70，且蘋果酸與總番茄紅素含量、順式、全反式、（13Z）-番茄紅素、（5Z）-番茄紅素和未知構型番茄紅素的含量都具有顯著相關性（R＞0.5，P＜0.05），說明蘋果酸對其異構化作用較突出。

未知構型番茄紅素與順式番茄紅素總量、（5Z）-番茄紅素含量顯著相關，相關系數分別為0.77，0.65；與（13Z）-番茄紅素含量呈低相關，相關系數為0.45。說明檢測出的未知構型番茄紅素為順式構型番茄紅素。（5Z）-番茄紅素與順式番茄紅素總量相關系數為0.88，呈高度相關，這也與（5Z）-番茄紅素含量占順式構型番茄紅素總量的比例最高相符。

3 結論

通過測定番茄自然發酵42 d過程中pH值、可滴定酸、有機酸以及番茄紅素順反異構體含量，結果表明紅酸湯自然發酵過程中存在番茄紅素的順反異構化現象，順式構型番茄紅素以（5Z）-番茄紅素為主，未知構型番茄紅素為順式構型番茄紅素。有機酸引起番茄紅素的順反異構化，其中蘋果酸對番茄紅素反式構型向順式構型轉化的作用大于乳酸、乙酸和檸檬酸。

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