烤煙品種中川208特異性指紋圖譜的構建及分析

賈振國 王亞男 羅成剛 張玉 耿銳梅 陳志強 楊愛國 劉國祥 任民

摘? 要：烤煙品種中川208是經雜交選育而成的雄性不育一代雜交種，目前主要在華中和西南地區推廣種植。為了加強對煙草品種的保護和利用，本研究利用中川208及其雙親的重測序數據進行SNP鑒定，并以5161份種質資源的重測序數據為遺傳背景，對SNP位點進行篩選，構建了中川208的特異性指紋圖譜。結果表明，該指紋圖譜由285個SNP位點構成，經可靠性檢驗和實際測序驗證，該指紋圖譜對測序錯誤和位點缺失的容忍度極高，在兼顧可靠性和成本的條件下，可利用2X或3X的WGS測序對待測樣品進行測序和檢驗。綜上，本研究構建的烤煙品種中川208特異性指紋圖譜，可靠性高，實用性強，為中川208的推廣與保護提供了技術支撐，同時為煙草雜交種特異性指紋圖譜的構建提供了方法參考。

關鍵詞：中川208；指紋圖譜；單核苷酸多態性；種質資源；重測序

中圖分類號：S572.03? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文章編號：1007-5119（2023）02-0001-06

Abstract： Flue-cured tobacco variety Zhongchuan208 is a male sterile first-generation hybrid， which is mainly cultivated in central China and Southwest China. In order to enhance the protection and utilization of tobacco varieties， SNP identification was conducted using resequencing data of Zhongchuan208 and its parents， and SNP loci were screened using resequencing data of 5161 germplasm resources as genetic background， and the specific fingerprint of Zhongchuan208 was constructed. The results showed that the fingerprint was composed of 285 SNP loci. After reliability test and actual sequencing verification， the fingerprint had a high tolerance for sequencing errors and locus missing. Under the condition of both reliability and cost， the test samples could be sequenced and tested by 2X or 3X WGS sequencing. In conclusion， the specific fingerprint of flue-cured tobacco variety Zhongchuan208 was successfully constructed in this study. The fingerprint has high reliability and strong practicability， which provides technical support for the promotion and protection of Zhongchuan208， and also provides method reference for the construction of specific fingerprint of tobacco hybrid.

Keywords： Zhongchuan208; fingerprint; single nucleotide polymorphisms; germplasm resources; resequencing

烤煙品種中川208是以雄性不育同型系MS中煙103為母本，烤煙新品系T137為父本通過雜交選育而成的雜種一代品種。中川208綜合評價良好，質量性狀、經濟性狀和抗逆性兼顧，目前主要在西南和華中煙區種植[1]，是近年來選育的優良品種。中川208易感青枯病、赤星病和CMV，感染病害后會產生植株形態的改變；不同的氮素營養水平也會引起中川208植物學性狀和農藝性狀的改變[2]。因此，依靠植株形態鑒定中川208，需要特定的試驗條件，對環境與人員要求高，難以準確簡便地開展，嚴重影響中川208的推廣和保護。利用指紋圖譜對植物品種進行鑒定相較于傳統的形態學鑒定具有鑒定周期短、準確性高等優點，且具有不受環境影響、全生育期均可進行鑒定的優勢。因此，構建中川208的指紋圖譜對該品種的推廣和保護具有重要意義。

煙草指紋圖譜構建主要利用分子標記進行。目前使用較廣泛的是簡單重復序列（simple sequencerepeats， SSR）分子標記。李顯富等[3]在2015年利用SSR分子標記對烤煙K326的突變體品系“片片黃”進行指紋圖譜構建；陳婷婷等[4]在2016年利用SSR分子標記對云煙87突變體品系進行指紋圖譜構建；劉國祥等[5]在2017年利用SSR分子標記對33份曬煙種質資源進行指紋圖譜構建；陳芳等[6]在2019年利用SSR分子標記構建80份煙草種質資源的指紋圖譜；錢雨清[7]在2022年利用SSR分子標記對160份煙草種質資源進行指紋圖譜的構建。但是，由于SSR分子標記存在檢測成本高，多態性低的特點，近年來逐漸被單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism， SNP）分子標記所取代。王琰琰[8]在2021年利用SNP分子標記構建216份雪茄煙種質資源的指紋圖譜；余世洲等[9]在2023年利用SNP分子標記構建可以用于煙草核心種質區分的指紋圖譜。以上研究表明，煙草品種指紋圖譜構建已經成為當前品種鑒定和保護的重要基礎性工作。

目前構建的煙草品種指紋圖譜多為通用性指紋圖譜，多個品種共用一套SSR或SNP位點，開發與應用相對簡便，可以有效區分供試品種與對照品種，但在鑒別供試品種是否為某個特定目標品種時，容易因為個別位點的分型問題而導致鑒定結論錯誤，不利于特定品種的鑒別。因此，針對特定品種的鑒別需要更加有效的特異性指紋圖譜。目前特異性指紋圖譜的研究集中于純系品種，關于煙草雜交種特異性指紋圖譜的構建缺乏報道。本研究利用SNP分子標記，對煙草雜交種中川208進行特異性指紋圖譜構建，并對該套指紋圖譜進行可靠性驗證和使用成本分析，以期為烤煙品種中川208的推廣和保護提供依據，并為后期大范圍開發煙草雜交種特異性指紋圖譜，建立煙草雜交種特異性指紋圖譜數據庫提供方法參考。

1? 材料與方法

1.1? 供試材料

本研究所采用的供試材料為中川208、MS中煙103和T136，種子由國家煙草種質資源中期庫（青島）提供，2021年9月播種于中國農業科學院煙草研究所人工氣候室。待植株生長至大十字期，采集生長狀態良好且無病蟲害單株的葉片，置于?80 ℃超低溫冰箱中保存，用于DNA提取及后續測序。以5161份種質資源的GBS（Genotyping-by- sequencing）簡化基因組測序信息作為遺傳背景，該數據由國家煙草種質資源中期庫提供[10]。

1.2? DNA提取及文庫構建

將獲取的葉片樣品用干冰包埋，寄至北京諾禾致源科技股份有限公司，進行供試材料基因組DNA的提取。將樣品基因組DNA用于文庫構建，測序方法為GBS簡化基因組重測序，由北京諾禾致源科技股份有限公司的Illumina HiSeq PE150測序平臺進行[11-16]。

1.3? 指紋圖譜SNP位點篩選

利用本研究獲得的中川208及其雙親GBS簡化基因組測序數據及前期已有的5161份種質資源GBS簡化基因組測序信息篩選中川208特異性指紋圖譜位點：（1）利用GATK 4.1[17]對中川208及其雙親（MS中煙103和T136）進行SNP位點分析，篩選中川208及其雙親的分型結果均不是缺失的SNP位點。（2）對上述位點進行特異性分析和發掘，篩選MS中煙103和T136中純合且有差異，并在中川208中雜合的位點。（3）進一步分析上述位點對5161份煙草種質資源的群體SNP分型情況，剔除在種質資源群體上質量值（QUAL）小于1000、缺失率高于30%、雜合率高于30%的位點及非二態性位點，得到候選SNP位點。（4）基于5161份煙草種質資源的群體SNP分型數據，計算候選SNP位點的群體多樣性指數（pi）。以1 Mb為統計窗口長度，將候選SNP進行分組（bin），選取每個bin內群體多樣性指數（pi）最小的SNP作為中川208特異性指紋圖譜SNP。群體多樣性指數（pi）利用VCFtools[18]進行計算。

1.4? 數據可視化及分析程序開發

本研究利用R語言對數據進行可視化。中川208特異性指紋圖譜分析程序開發利用python 3.8計算機語言進行。

1.5? 指紋圖譜分析

利用正交設計的方法，設置位點數（檢測到的中川208特異性指紋圖譜位點數）及堿基錯誤率2種因素，探究其對檢測正確率的影響。位點數設計10、20、30直到200個SNP（依次增加10個位點），共計20個水平；堿基錯誤率設計0%、10%、20%、?30%、40%、50%、60%，共計7個水平。2種因素共組成140種組合。在140種組合中對中川208特異性指紋圖譜SNP位點進行10次隨機抽樣，共組成1400種不同的基因型數據。將不同的基因型數據輸入分析程序進行檢驗，統計在不同位點數及不同堿基錯誤率下檢測的正確率。實際測序驗證采用WGS（Whole Genome Sequencing）全基因組重測序，測序深度為5 X，由北京諾禾致源科技股份有限公司的Illumina HiSeq PE150測序平臺[11-16]進行，并從測序數據中隨機分出1～4 X覆蓋度的測序數據。

2? 結? 果

2.1? 建庫測序數據分析

對中川208及其雙親MS中煙103、T136進行GBS簡化基因組重測序，根據得到的測序結果，對測序產出數據、酶捕獲率進行統計，并以煙草品種第3代測序組裝物理圖譜作為參考基因組，將獲取的高質量測序數據與參考基因組進行序列比對，得到定位比例、平均測序深度及覆蓋度，結果如表1所示，3份材料有效數據率均達到99.99%，GC含量接近40%，表明測序數據質量高，無污染；酶捕獲率大于99%，表明酶切效率高；平均測序深度在6.63～7.18之間，覆蓋度在3.53%～4.12%之間，表明測序數據均一性及與參考基因組的相似性較好，可滿足本研究要求。

2.2? 中川208特異性指紋圖譜構建

將中川208及其雙親（MS中煙103和T136）GBS重測序數據中檢測到的42 465個分型結果不是缺失的SNP位點，依據雙親純合且有差異，子代雜合的原則進行篩選，共篩選到1541處位點（不含位于Scaffold上的位點）。基于5161份種質資源的分型情況，剔除質量值（QUAL）小于1000的位點6處，缺失率高于30%的位點21處，雜合率高于30%的位點67處，非二態性位點203處，保留1244處候選SNP位點。基于5161份煙草種質資源的群體SNP分型數據，計算1244處候選SNP位點的群體多樣性指數（pi）（圖1），并以1 Mb為統計窗口長度，將候選SNP分為285個組（bin），選取每個bin內pi值最小的SNP作為中川208特異性指紋圖譜SNP。由此得到構成中川208特異性指紋圖譜的285個高質量SNP位點，位點的詳細信息見文件http：//47.104.13.144： 8686/down/xDn15XZ5FCkR.xlsx。構成中川208特異性指紋圖譜的285個SNP位點分布于24條染色體上，其中Hic_asm_3染色體上SNP位點最多，有51個，各染色體上的SNP分布情況見圖2。

2.3? 指紋圖譜分析程序開發

為方便中川208特異性指紋圖譜的應用，本研究利用python3.8計算機語言，開發中川208特異性指紋圖譜分析程序，源代碼托管于https：//gitee.com/renm79/zc208fp，使用時將樣品測序數據整理為4列，其中第一列為位點編號，第二列為染色體編號，第三列為位置，第四列為該位點的基因型，基因型信息采用國際通用的簡并堿基代碼。利用該程序可方便地計算用戶輸入的遺傳信息與中川208指紋圖譜信息間的遺傳差異，并以煙草種質資源群體為參照，判斷待檢材料是否為中川208，操作顯示頁面見圖3，使用時可根據遺傳距離進行判斷，當檢測樣品與中川208（ZC208）遺傳距離為0時，則可說明該樣品為中川208，反之則不是。

2.4? 指紋圖譜可靠性檢驗及實際測序驗證

在實際測序過程中，供試樣品基因型會在一定程度上存在位點缺失及測序錯誤，本研究利用正交設計的方法針對這2種情況對中川208特異性指紋圖譜的可靠性進行檢驗，并由此獲取1400種基因型數據（具體方法見1.5）。將獲取的1400種基因型數據依次輸入指紋圖譜分析程序進行分析，統計檢驗的正確率，部分試驗結果如圖4所示。該結果表明，在堿基錯誤率高達60%的情況下，只要檢測位點達到任意80個以上時，檢測準確率均可達到100%，而在錯誤堿基的比例不超過10%的情況下，即使只檢測到285個位點中的任意10個位點，也能實現準確檢測。

為進一步對中川208特異性指紋圖譜的準確率進行檢測，降低指紋圖譜使用成本，本文對中川208進行5X覆蓋度的全基因組重測序，測序檢測到的指紋圖譜位點與前期開發時的測序分型結果一致。從測序數據中隨機分出了1X、2X、3X、4X覆蓋度的測序數據。1～5X覆蓋度測序數據輸入分析程序后的檢測結果及成本見表2。表2表明，檢測到的指紋圖譜位點數隨著測序深度增加而增加，1～5X覆蓋度檢測的指紋圖譜位點數均可正確識別中川208，在綜合考慮可靠性和成本的情況下，可在實際使用過程中采用2X或3X的WGS測序獲取樣品的測序信息。

3? 討? 論

大量研究表明，構建指紋圖譜可以有效鑒別煙草品種，對煙草品種的推廣和保護有重要作用[3-9]。中川208作為近年來選育的優良雄性不育雜交一代品種[1]，構建中川208的指紋圖譜，是該品種推廣和利用的重要基礎性工作。

SNP標記作為第3代分子標記，與高通量檢測方法相結合，具有成本低、周期短、準確性高等特點[19]。本研究基于SNP分子標記進行煙草品種指紋圖譜構建，與利用SSR分子標記構建的煙草指紋圖譜技術[3-7]相比，入選分子標記數量顯著增加，構建的指紋圖譜SNP位點分布于全基因組，使指紋圖譜的特異性和分辨力顯著提升。在使用方面，本研究構建的SNP指紋圖譜直接利用高通量測序技術進行檢測，避免了SSR指紋圖譜需要電泳檢測的繁瑣步驟，使指紋圖譜的檢測效率顯著提升。在參考群體方面，本研究以5161份煙草種質資源為對照群體，對照群體數量遠高于現有的煙草指紋圖譜，篩選的指紋圖譜位點能夠更加有效地揭示煙草品種的遺傳特異性。此外，可靠性檢驗表明，本研究開發的中川208特異性指紋圖譜對測序錯誤和位點缺失的容忍度極高，相較于煙草通用性SNP指紋圖譜[8-9]，不會因為1個或幾個SNP位點的分型錯誤導致檢測結果改變。針對煙草SNP指紋圖譜使用成本的問題，本研究利用WGS全基因組重測序技術，對中川208進行5X覆蓋度的全基因組重測序，并從測序數據中隨機分離出1～4X覆蓋度的測序數據，發現在兼顧可靠性和成本的前提下，2X或3X的測序深度是最佳的測序深度。

煙草雜交種可以融合雙親的優良特性，表現出超親雜種優勢，能兼顧較多的重要性狀，是煙草品種選育的重要方法。近年來除中川208以外，不斷有優良的煙草雜交種被選育[20-22]，特異性指紋圖譜可以用于煙草雜交種的準確鑒別，是煙草雜交種推廣和保護的重要基礎性工作。本研究首次利用SNP分子標記對煙草雜交種進行特異性指紋圖譜構建，構建的指紋圖譜可靠性高且經濟、簡便，該方法有望廣泛應用到煙草雜交種特異性指紋圖譜的構建過程中。

4? 結? 論

本研究通過高通量測序技術，基于SNP分子標記構建了由285個SNP位點組成的中川208特異性指紋圖譜。通過可靠性檢驗和實際測序驗證，表明該指紋圖譜具有較高的可靠性和較強的實用性，可以應用于中川208的品種真實性鑒定。本研究構建煙草雜交種特異性指紋圖譜的方法切實可行，可以為其他煙草雜交種特異性指紋圖譜的構建提供方法參考。

參考文獻

[1]張玉，劉楊，王元英，等. 烤煙新品種中川208的選育及特征特性[J]. 中國煙草科學，2019，40（5）：1-7.

ZHANG Y， LIU Y， WANG Y Y， et al. Breeding and characterization of a new flue-cured tobacco variety Zhongchuan208[J]. Chinese Tobacco Science， 2019， 40（5）： 1-7.

[2]羅政剛，高陽，李偉，等. 烤煙品種中川208優質高效栽培配套技術研究[J]. 種子科技，2023，41（4）：27-30，141.

LUO Z G， GAO Y， LI W， et al. Study on high quality and efficient cultivation technology of flue-cured tobacco variety Zhongchuan208[J]. Seed Science & Technology， 2023， 41（4）： 27-30， 141.

[3]李顯富，陳婷婷，安雪琴，等. 烤煙K326突變體新品系‘片片黃的性狀表現及其DNA指紋圖譜構建[J]. 西南農業學報，2015，28（3）：1300-1305.

LI X F， CHEN T T， AN X Q， et al. Characteristics and DNA fingerprint of new flue-cured tobacco strain ‘Pianpianhuang bred from natural mutant of variety K326 by system selection method[J]. Southwest China Journal of Agricultural Sciences， 2015， 28（3）： 1300-1305.

[4]陳婷婷，李顯富，賈春雷，等. 云煙87突變體新品系的特征特性及其DNA指紋圖譜鑒定[J]. 浙江大學學報（農業與生命科學版）， 2016，42（2）：179-189.

CHEN T T， LI X F， JIA C L， et al. Characteristics of new flue-cured tobacco strains developed from Yunyan87 mutants and their DNA fingerprint[J]. Journal of Zhejiang University （Agric. & Life Sci.）， 2016， 42（2）： 179-189.

[5]劉國祥，鄒昆晏，任民，等. 33份曬煙種質資源SSR標記的指紋圖譜構建[J]. 中國煙草學報，2017，23（5）：57-64.

LIU G X， ZOU K Y， REN M， et al. Construction of SSR markers fingerprints of 33 sun-cured tobacco germplasm resources[J]. Acta Tabacaria Sinica， 2017， 23（5）： 57-64.

[6]陳芳，徐世曉，李曉輝，等. 基于SSR標記的80份煙草種質指紋圖譜的構建及遺傳多樣性分析[J]. 作物雜志，2019，188（1）：22-31.

CHEN F， XU S X， LI X H， et al. Construction of molecular fingerprinting and analysis of genetic diversity for 80 tobacco （Nicotiana tabacum） germplasms based on SSR markers[J]. Crops， 2019， 188（1）： 22-31.

[7]錢雨清. 基于SSR標記的煙草DNA指紋圖譜的構建與遺傳分析[D]. 泰安：山東農業大學，2021.

QIAN Y Q. Fingerprints construction and genetic analysis of Nicotiana tabacum based on SSR markers[D]. Taian： Shandong Agricultural University， 2021.

[8]王琰琰. 雪茄煙種質資源SNP指紋圖譜構建及群體遺傳分析[D]. 北京：中國農業科學院，2021.

WANG Y Y. Construction of a SNP fingerprinting database and population genetic analysis of cigar tobacco germplasm resources in China[D]. Beijing： Chinese Academy of Agricultural Sciences， 2021.

[9]余世洲，曹領改，王世澤，等. 煙草種質基因分型核心SNP標記的開發[J]. 生物技術通報，2023，39（3）：89-100.

YV S Z， CAO L G， WANG S Z， et al. Development core SNP markers for tobacco germplasm genotyping[J]. Biotechnology Bulletin， 2023， 39（3）： 89-100.

[10]任民，王志德，牟建民，等. 我國煙草種質資源的種類與分布概況[J]. 中國煙草科學，2009，30（S1）：8-14.

REN M， WANG Z D， MU J M， et al. Overview of species and distribution of tobacco germplasm resources in China[J]. Chinese Tobacco Science， 2009， 30（S1）： 8-14.

[11]LI H， DURBIN R. Fast and accurate short read alignment with burrows-wheeler transform[J]. Bioinformatics， 2009， 25（14）： 1754-1760.

[12]LI H， HANDSAKER B， WYSOKER A， et al. The sequence alignment/map format and SAMtools[J]. Bioinformatics， 2009， 25（16）： 2078-2079.

[13]WANG K， LI M， HAKONARSON H. ANNOVAR： functional annotation of genetic variants from high-throughput sequencing data[J]. Nucleic Acids Research， 2010， 38（16）： e164.

[14]CHEN K， WALLIS J W， MCLELLAN M D， et al. BreakDancer： an algorithm for high-resolution mapping of genomic structural variation[J]. Nature Methods， 2009， 6（9）： 677-681.

[15]ABYZOV A， URBAN A E， SNYDER M， et al. CNVnator： an approach to discover， genotype， and characterize typical and atypical CNVs from family and population genome sequencing[J]. Genome Research， 2011， 21（6）： 974-984.

[16]KRZYWINSKI M， SCHEIN J， BIROL ?， et al. Circos： an information aesthetic for comparative genomics[J]. Genome Research， 2009， 19（9）： 1639-1645.

[17]MCKENNA A， HANNA M， BANKS E， et al. The genome analysis toolkit： a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data[J]. Genome Res.， 2010， 20（9）： 1297-1303.

[18]DANECEK P， AUTON A， ABECASIS G， et al. The variant call format and VCF tools[J]. Bioinformatics， 2011， 27（15）： 2156-2158.

[19]唐立群，肖層林，王偉平. SNP分子標記的研究及其應用進展[J]. 中國農學通報，2012，28（12）：154-158.

TANG L Q， XIAO C L， WANG W P. Research and application progress of SNP markers[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin， 2012， 28（12）： 154-158.

[20]王平平，孫渭，張強，等. 烤煙新品種秦煙201的選育及特征特性[J]. 中國煙草科學，2022，43（2）：7-11.

WANG P P， SUN W， ZHANG Q， et al. Breeding and characterization of a new flue-cured tobacco variety Qinyan201[J]. Chinese Tobacco Science， 2022， 43（2）： 7-11.

[21]常愛霞，卞建鋒，蔡憲杰，等. 烤煙新品種中煙207的選育及特征特性[J]. 中國煙草科學，2022，43（3）：1-6.

CHANG A X， BIAN J F， CAI X J， et al. Breeding and characterization of a new flue-cured tobacco variety Zhongyan207[J]. Chinese Tobacco Science， 2022， 43（3）： 1-6.

[22]李尊強，喬嬋，王春軍，等. 烤煙新品種龍煙101的選育及特征特性[J]. 中國煙草科學，2022，43（3）：14-19.

LI Z Q， QIAO C， WANG C J， et al. Breeding and characterization of a new tobacco variety Longjiang101[J]. Chinese Tobacco Science， 2022， 43（3）： 14-19.