煙草鐮刀菌根腐病抗性鑒定方法研究

李雪君 郭敬 孫計平 孫煥 李芳芳 平文麗 李建華 俎煥新 李旭輝 侯詠 耿勝娜

摘? 要：為獲得不同煙草品種鐮刀菌根腐病抗性的鑒定方法，采用鐮刀菌粗毒素幼芽接種、孢子懸浮液培養、帶菌菌谷接種、離體葉片菌餅接種、草酸局部注射等5種方法對4個品種（小黃金1025、中煙100、長脖黃、664-01）的鐮刀菌抗病性進行了研究。結果表明，鐮刀菌毒素液脅迫法可以鑒定品種的抗感程度，適宜體系毒素濃度為8%，處理時間6 d；鐮刀菌孢子懸浮液接種法可以鑒定品種的抗感程度，適宜體系孢子液濃度為107個/mL，處理時間4 d；帶菌菌谷接種也可以鑒定品種的抗感程度，適宜體系菌谷比例為20%，處理時間9 d；離體葉片用菌餅和草酸液處理，能區分品種的抗感性，但不能區分品種的抗感程度。研究結果認為孢子懸浮液接種法和帶菌菌谷接種與其他3種方法相比可以準確評價品種對鐮刀菌根腐病的抗感性。

關鍵詞：煙草；鐮刀菌根腐病；毒素；孢子液；菌餅；抗病性

中圖分類號：S435.72? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文章編號：1007-5119（2023）02-0043-09

Abstract： To obtain suitable identifying methods of tobacco root rot resistance in different tobacco varieties（Xiaohuangjin1025， Zhongyan100， Changbohuang， 664-01）， the inoculation crude toxin of tobacco seedlings， spore suspension culture， inoculation of grain culture with fungi， inoculation mycelial cake of detached leaf and local injection of oxalic acid were investigated. The results showed that crude toxin stress could identify the resistance degree of tobacco varieties， and the suitable system was treated within 6 d at 8% toxin concentration. The inoculation spore suspension could identify the degree of resistance of different varieties and the suitable system was treated within 4 d and with 107 spores per mL. The inoculation of grain culture with fungi could also identify the degree of resistance of tobacco varieties， and the suitable system was treated within 9 d at the toxin concentration of 20% pathogenic fungus grain culture. The treatment of detached leaf with mycelial cake oxalic acid could distinguish the resistance of varieties， but could not differentiate the degree of resistance. The results showed that the spore suspension inoculation method and the fungal wheat culture inoculation method could accurately evaluate the resistance of varieties to Fusarium root rot compared with the other three methods.

Keywords： tobacco; Fusarium root rot; toxin; spore liquid; mycelial cake; disease resistance

煙草是我國重要的經濟作物，播種面積在200萬hm2以上[1]。煙草病害對煙葉產量和質量都會產生嚴重影響[2-3]。近年來，隨著煙葉生產耕作模式的變化，大片連方種植使輪作倒茬十分困難，導致根莖類病害逐年加重[4-5]，其中煙草鐮刀菌（Fusarium）根腐病[2，6-7]發展極為迅速，在河南[6，8]、山東[9]、福建[10]、安徽[11]等地均有發生，特別是在黃淮煙區，鐮刀菌根腐病已經上升為主要病害，重茬煙田發病率高達30%[12-13]，嚴重地塊甚至絕收。引起鐮刀菌根腐病的菌源有多種，如尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）、茄病鐮刀菌（F. solani）、木賊鐮刀菌（F. equiseti）、層出鐮刀菌（F. proliferatum）等[14]，不同地方報道的主要病原菌有所差異，河南[14]、湖北[15]、云南[16]煙區的主要致病菌均為尖孢鐮刀菌，在河南煙區該致病菌占81.25%[14]。由于真菌對殺菌劑抗性的不斷增強和環境因子的影響[17-18]，化學防治、生物防治收效甚微，選育和應用抗病品種是控制煙草鐮刀菌根腐病的首選措施。在抗病品種的培育過程中，鐮刀菌根腐抗病種質、后代材料的篩選需要準確有效的抗性鑒定方法。

目前，對品種鐮刀菌根腐病抗性的鑒定方法主要有菌谷接種法、孢子懸浮液蘸根法、毒素法[19-20]等，但是尚未有鑒定方法的系統比較，缺乏全國統一標準，也沒有明確的抗病感病對照。不同鑒定方法采取不同的抗感對照[11，15，19]，很難確定材料的真實抗性水平。從統一抗感對照入手，比較不同的接種鑒定方法，對育種材料的篩選和鑒定有著非常重要的意義。

本文以優勢菌種尖孢鐮刀菌為研究菌種，利用5種接種方法對尖孢鐮刀菌接種鑒定并進行對比，對4個初步篩選的抗感材料進行接種鑒定，旨在探索出一套快速、簡便鑒定鐮刀菌根腐病抗性的方法，為鐮刀菌根腐病抗性煙草品種的選育及抗感對照的選取提供參考。

1? 材料與方法

1.1? 試驗材料

供試煙草品種包括中煙100、長脖黃、小黃金1025、664-01，均由河南省農業科學院煙草所種質資源庫提供。

1.2? 病原菌的分離與鑒定

1.2.1? 病原菌的分離? 根據組織分離法，選取有鐮刀菌根腐癥狀的病株，剪取煙苗根部病健交接處3 mm左右的組織塊，使用70%酒精消毒30 s，3% NaClO溶液消毒30 s，無菌水沖洗3次，按壓在含青霉素和硫酸鏈霉素的PDA平板上，在25 ℃光照培養箱中培養。

1.2.2? 形態學鑒定? 觀察菌落形態及色素產生情況，并使用光學顯微鏡觀察孢子形態。

1.2.3? 分子生物學鑒定? 采用CTAB法提取鐮刀菌基因組DNA，使用真菌ITS-rDNA通用引物ITS1/ITS4：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'，5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'進行PCR擴增，擴增產物送往上海生工生物工程有限公司測序，測序結果登陸NCBI進行BLAST比對分析，選擇匹配值前100序列中的不同菌株序列作為參考序列。多序列比對使用Clustal W，采用默認值，基于泊松模型、均勻模式、成對缺失的鄰接法（Neighbor-Joining）和1000次botstrap重復，利用MEGA X軟件構建系統發育樹，小于50的引導值被隱藏。

1.2.4? 致病性測定? 參考邱睿等[19]的方法，將帶菌麥粒培養物接種到小黃金1025，于接種后10、20 d觀察植株發病情況。接種10 d后按照1.2.1的方法分離病原菌，并按照1.2.2和1.2.3的方法進行形態學鑒定和分子生物學鑒定，鑒定結果一致則說明該病原菌為致病菌。

1.3? 接種病原菌的制備

1.3.1? 鐮刀菌粗毒素的制備? 尖孢鐮刀菌在PDA平板上培養7 d后，在菌落邊緣打取直徑6 mm的菌餅，在裝液量100/250 mL的PD培養液接種2塊，28 ℃、180 r/min搖培3 d后，使用8層紗布過濾，6500 r/min離心20 min，保留上清液作為毒素原液，置于4 ℃冰箱備用。

1.3.2? 孢子懸浮液的制備? 尖孢鐮刀菌培養液的制備同1.3.1，培養液經8層紗布過濾后，使用血球計數板調節孢子濃度分別為1×105、1×106、1×107個/mL。

1.3.3? 帶菌麥粒培養物的制備? 參照邱睿等[19]的方法，在活化7 d的尖孢鐮刀菌平板上打取直徑6 mm的菌餅，挑取2塊接入裝有含1/3煮熟麥粒培養基的培養瓶中，25 ℃光照培養7 d，每12 h搖晃培養瓶保證菌絲均勻生長。

1.4? 煙草品種抗性鑒定

1.4.1? 萌發期毒素脅迫培養? 煙草種子經70%酒精消毒30 s，1% NaClO溶液消毒30 s，無菌水沖洗5次后，在溫度28 ℃光周期為8 h/d的光照培養箱中萌發3 d至露白。在鋪有無菌濾紙的培養皿中分別加入5 mL 4%、8%、12%、16%、20%的毒素液，對照加入5 mL無菌水，每皿放入20粒正常露白種子，每個處理重復3次，在28 ℃、光周期為8 h/d條件培養3～5 d后，測定種子死亡率及存活種子根長抑制率。

種子死亡率=（3次毒素處理死亡平均值/每皿點種總數）×100%

根長抑制率=（對照品種根長-毒素處理品種根長）/對照品種根長×100%

1.4.2? 鐮刀菌孢子懸浮液接種鑒定? 挑選長勢一致的5葉期煙苗，分別在裝入45 mL左右（以不沒過煙苗莖部為宜）105、106、107個/mL孢子懸浮液的50 mL離心管中培養，每個處理重復3次，每個重復處理10株煙苗，置于28 ℃、光周期8 h/d的培養箱中，培養3 d后根據GB/T 23222—2008《煙草病蟲害分級及調查方法》調查發病情況，計算病情指數。

1.4.3? 帶菌麥粒接種鑒定? 帶菌麥粒培養物與無菌基質按10%、20%的比例混合，選取長至4～5片真葉的苗栽種到混合基質中，每個處理10株煙苗，將等比例未接菌的麥粒培養基與無菌基質混合作為對照，試驗重復3次，光周期為8 h/d條件下培養9 d，觀察并統計發病情況。

1.4.4? 離體葉片接種鐮刀菌? 挑選大小均勻的葉片，使用無菌注射器針頭在葉片上制造傷口，將尖孢鐮刀菌菌餅按壓在傷口上，用濕潤的無菌脫脂棉包裹住葉柄，在28 ℃光周期為8/16 h的培養箱中培養9 d后，觀察葉片是否出現病斑。

1.4.5? 草酸處理模擬鐮刀菌試驗? 參考劉勝毅等[21]的草酸浸葉法適當調整，使用40 mmol/L濃度的草酸溶液注射葉片，注射6 d后觀察并統計葉片壞死的結果。

1.5? 煙草品種抗性評價

病情調查與抗性評價參考黑脛病分級標準按照GB/T 23222—2008規定的標準進行。以株為單位分級調查。根據調查結果計算并統計煙株病情指數。病情指數＝∑（各級病株數×該病級值）/（調查總株數×最高病級值）×100。按照GB/T 23224—2008的規定進行抗性標準評價。高抗或免疫（I），病情指數為0；抗病（R），病情指數為0.1～20.0；中抗（MR），病情指數為20.1～40.0；中感（MS），病情指數為40.1～60.0；感病（S），病情指數為60.1～80.0；高感（HS），病情指數為80.1～100.0。

1.6? 數據分析

利用Excel 2007軟件對試驗數據進行處理，采用DPS軟件對不同鑒定方法之間的相關數據進行分析。

2? 結? 果

2.1? 鐮刀菌種類鑒定

2.1.1? 形態學鑒定? 菌落在PDA培養基上呈淡紫色（圖1），小型分生孢子橢圓形，單孢或偶有1～2個隔膜，大型分生孢子鐮刀狀，3～5個隔膜。

2.1.2? 分子生物學鑒定? 用真菌ITS-rDNA通用引物ITS1/ITS4進行PCR擴增后得到的DNA片段大小約為550 bp。由生物公司進行測序，測序結果（Seq data）經NCBI網站BLAST分析比對，利用MEGA-X軟件構建多基因系統發育樹，結果表明，Seq data與尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum在同一發育分支，且序列相似性高達100%（圖2），因此確定此菌種為鐮刀菌屬尖孢鐮刀菌。

2.1.3? 致病性測定? 小黃金1025接種尖孢鐮刀菌10 d后，與對照相比長勢明顯變弱，根部變黃發黑，須根變少，葉片由下至上變黃、枯萎；接種20 d后，煙株枯死（圖3）。對病原菌分離純化后，使用電子顯微鏡觀察孢子形態，符合圖1中尖孢鐮刀菌特征；送上海生工生物工程有限公司測序后比對結果與2.1.2相符，說明供試菌株具有致病性。

2.2? 煙草品種抗性鑒定

2.2.1? 鐮刀菌毒素液脅迫? 對萌發煙草種子采用不同濃度尖孢鐮刀菌毒素處理發現（表1、圖4），4種供試煙草品種對鐮刀菌根腐病的抗性有明顯差異，隨著毒素處理濃度的提高，4個品種表現出相應程度的發病現象，煙草幼芽主根變黃變黑，葉片萎蔫變黃，死亡率隨之升高。

4%毒素接種后2 d，除小黃金1025發病外，其余3個品種均未發病；接種至6 d時，小黃金1025死亡率為44.93%，中煙100死亡率為14.56%，長脖黃和664-01死亡率為8.01%和7.12%，抗感材料死亡率差異不明顯。初步認為4%毒素處理用于抗性鑒定不是最佳選擇。毒素處理6 d后，12%、16%、20%的3個處理種子死亡率均≥60%，抗感材料因毒素濃度過大而死亡率過高，故12%、16%、20%也不適用于抗性鑒定。

8%尖孢鐮刀菌毒素脅迫6 d后，小黃金1025和中煙100幼芽死亡率分別為63.68%和49.67%，容易感病；長脖黃和664-01，死亡率分別為13.45%和11.88%，抗性較好，因此認為煙草品種受8%毒素處理后的抗病感病程度有顯著差異，比較適合鐮刀菌抗性鑒定。對發病較輕的長脖黃和664-01的胚根長度進行測量后發現（圖5），使用8%尖孢鐮刀菌毒素脅迫處理長脖黃，種子萌發后胚根生長受到明顯抑制，抑制率為62.89%；664-01根長抑制率為18.96%，胚根生長受毒素影響較小。

2.2.2? 鐮刀菌孢子懸浮液接種鑒定? 尖孢鐮刀菌孢子懸浮液處理煙苗發現，供試品種對尖孢鐮刀菌的抗性有明顯差異（表2、圖6）。而且隨著孢子懸浮液濃度的提高，煙苗發病程度越來越高，表現為葉片萎蔫、枯萎，根部變黃、變褐、腐爛等。

用濃度為105、106個/mL尖孢鐮刀菌孢子懸浮液處理煙苗4 d后，抗感品種的病情指數均<60，不適合抗性鑒定。濃度為1×107個/mL的孢子懸浮液處理3 d后，煙苗發病程度差異顯著。小黃金1025和中煙100感尖孢鐮刀菌，病情指數分別為62.96、66.67，長脖黃對尖孢鐮刀菌中抗，664-01表現為抗病。

2.2.3? 帶菌菌谷接種鑒定? 對4個品種進行帶菌麥粒接種，分別設置10%、20%兩個比例。在10%濃度處理下，與對照相比，4個品種均無明顯發病情況（表3、圖7）；在20%濃度處理下，小黃金1025和中煙100根部出現腐爛（圖8），依據GB/T 23224—2008 《煙草品種抗病性鑒定》標準，煙草品種的抗性測定結果表明，小黃金1025、中煙100表現感病；長脖黃表現為中抗；664-01表現為抗（表3、圖7）。

2.2.4? 離體葉片鐮刀菌菌餅接種? 如圖9所示，在煙草離體葉片接種尖孢鐮刀菌菌餅9 d后，因為有菌餅的覆蓋，所有材料均有淡黃色枯斑，小黃金1025枯斑出現明顯擴散，中煙100病斑也有擴散痕跡，長脖黃和664-01沒有病斑擴散。說明長脖黃和664-01對該病菌有抵抗性，小黃金1025和中煙100對尖孢鐮刀菌易感。

2.2.5? 離體葉片草酸注射? 通過向葉片注射40 mmol/L的草酸，根據病斑大小（圖10）可以得出，小黃金1025葉片壞死最嚴重，其次是中煙100，可以初步認為是感病品種；長脖黃的葉片受損壞死最少，664-01次之，表現出較好的抗性。初步認為利用草酸模擬，可以從一定程度上區分不同品種對鐮刀菌的抗感性。

2.2.6? 尖孢鐮刀菌5種接種方法比較? 從表4可以看出，第1種處理方法毒素脅迫所需時間最短，省去了培養苗的時間，一共16 d，其余幾種方法都是用5葉期的幼苗，培養苗的時間一致，試驗處理所需時間差異不大，但培養苗的時間是毒素脅迫的4倍，明顯長于第1種方法。

從處理后抗性鑒定的效果上來看，以上5種方法均能區分出品種的抗、感性，前3種方法能區分出抗感程度，后2種方法不能區分出抗感程度。前3種處理方法較復雜，后2種處理方法直接處理離體葉片，處理方法比較簡單，尤其是最后一種，省去了病菌的培養，處理最為簡單。

3? 討? 論

煙草品系的抗性鑒定與評價是抗病育種最為關鍵的一環。接種體系簡單高效、接種結果穩定可靠對煙草抗病材料的鑒定與篩選非常重要。

本研究對鐮刀菌毒素脅迫和孢子懸浮液接種鑒定這兩種方法進行了不同濃度和處理時間的研究。鐮刀菌毒素脅迫試驗中，同一品種經不同濃度尖孢鐮刀菌毒素液處理后受損程度不同，隨毒素濃度提高，受損加重；不同品種對相同濃度毒素液敏感程度也不同，這與趙杰等[21]的研究結果一致，初步說明用鐮刀菌毒素進行抗性鑒定的方法是可行的。從發病情況來看，采用8%的濃度處理6 d能區分出供試抗感品種。從種子胚根生長狀態看，2個抗病品種的抗病機理不相同，在同樣發病較輕的情況下，長脖黃胚根受毒素抑制較大，664-01胚根受抑制比較小，幾乎不影響其生長。因此，這2個抗性材料的抗病機理上應該存在一定差異，有待進一步研究。

孢子懸浮液接種試驗中，1×105、1×106個/mL尖孢鐮刀菌孢子懸浮液處理煙苗不能明顯區分抗感品種，1×107個/mL孢子懸浮液處理3 d后可以顯著區分，小黃金1025和中煙100為感病品種，長脖黃和664-01為抗病品種，這與劉利佳[20]通過大型分生孢子接種的結果一致。批量制備孢子懸浮液過程同大型分生孢子相比，耗時短并且操作簡單，在生產上高效便捷。

本研究接種菌谷的鑒定結果與邱睿等[19]的報道不完全一致，小黃金1025為感病品種，這個基本一致；中煙100本研究鑒定結果為感病，文獻[19]中為中抗，根據圖片來看，推測原因可能是接種時期和接菌量不一致導致的，邱睿等的研究中接種時苗齡較大，接菌量比較小，所以發病程度偏輕。

離體葉片接種法在煙草黑脛病和青枯病鑒定方面已有報道[22-23]，還未見于鐮刀菌根腐病的研究中。本研究通過離體葉片接種菌餅發現，長脖黃和664-01對尖孢鐮刀菌具有抗性，小黃金1025和中煙100表現為易感。

核盤菌、灰霉菌屬于子囊菌門，都可以分泌草酸，在致病過程中起到重要作用，寄主抗草酸能力越強，抗病能力也越高[24-25]。尖孢鐮刀菌有性態時期也屬于子囊菌門，但是草酸對鐮刀菌的致病機理還鮮有報道。本研究采用草酸注射法發現，感病品種小黃金1025和中煙100出現病斑擴散，抗病品種則沒有出現病斑。說明用該種方法，可以快捷地鑒定出品種多鐮刀菌的抗感能力。至于抗感程度和抗病機理，目前尚在研究中。

在本研究中多種方法接種鑒定認為，長脖黃為“中抗-抗”尖孢鐮刀菌，與資料中的鑒定結果“中感”差異較大，至于具體原因，尚不明確。不同品種在大田接種尖孢鐮刀菌接菌后的實際發病情況，本研究在嘗試后沒有得到抗感性鑒定結果，因為在大田中，鐮刀菌根腐病和黑脛病往往是混合發生，大田土壤中黑脛病病菌很難分離出去。尖孢鐮刀菌在苗期接種鑒定，優點是能確定生長基質或營養液的病菌純度，確保發病癥狀是該種病菌引起的。幾種鑒定方法是否與大田后期發病相一致，還需要進一步研究。

本研究利用的鐮刀菌根腐病2個感病品種小黃金1025、中煙100和2個抗病品種長脖黃、664-01，經過多種方法多次鑒定，抗感性結果一致性較高，初步認為可以作為煙草鐮刀菌根腐病抗性鑒定的抗感對照品種。值得重視的是，這4個品種，對煙草鐮刀菌根腐病的抗感性與黑脛病的抗感性差異較大，對黑脛病的抗感性分別是：小黃金1025感病[26]，中煙100抗病[27]，長脖黃感病[28]，664-01抗病。因大田發病鐮刀菌根腐病和黑脛病經常混合發生，建議大田鑒定鐮刀菌根腐病時，最好用中煙100作為感病對照，664-01作為抗病對照，可以減少黑脛病病菌對鐮刀菌鑒定結果的影響。

4? 結? 論

本研究采取5種方法對煙草品種進行鐮刀菌根腐病抗性鑒定，得出的結果大致相同，小黃金1025和中煙100為感病品種，長脖黃和664-01為抗病品種。為降低大田黑脛病對鐮刀菌根腐病的影響，本研究認為可選擇中煙100作為感病對照、664-01作為抗病對照。

8%尖孢鐮刀菌毒素液處理煙草種子6 d可以鑒定煙草種子的抗感水平，該方法操作簡單，不受季節影響，所需時間短，適合大批量材料的篩選。1×107個/mL孢子懸浮液培養煙苗3 d適合篩選煙草抗感品種，該方法準確度較高，感病品種發病較快、較明顯，處理時間短。20%麥粒培養物培養10 d可以鑒定煙苗抗感水平，該方法能準確、直觀地觀察出煙苗發病情況，但與孢子懸浮液接種法相比受溫濕度影響較大，所需時間長，操作較繁瑣。葉片接菌餅法和草酸模擬注射法不能區分煙草品種抗感程度，可用來初步鑒定品種抗感性，兩種方法均不受季節限制，操作簡單便捷。因此，從鑒定結果準確直觀來比較，認為孢子懸浮液接種法和帶菌菌谷接種法最適合用于煙草品種鐮刀菌根腐病抗性鑒定。

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