甲硝唑片的質量分析

張秉華?牛龍青?衷紅梅?杜亞俊?鄧玉龍?周志云

摘要：目的 評價國內不同企業生產的甲硝唑片的質量。方法 按照現行質量標準檢驗結合探索性研究，包括有關物質方法的測定、亞硝酸鹽含量的測定、溶出行為一致性及溶出度方法考察、微生物限度方法適用性實驗及分析，綜合評價產品質量及現行質量標準對產品質量的可控性。結果 抽取的130批樣品，按法定標準檢驗合格率為100.0%。探索性研究結果表明，本品的雜質水平主要與原料藥有關，不同企業的雜質檢出情況差異不明顯；不同企業樣品均檢出亞硝酸鹽，但均符合ICH限度要求；各企業樣品15 min的溶出度均大于85%；微生物限度試驗結果顯示甲硝唑片對需氧菌總數均有不同程度的抑制作用。結論 目前甲硝唑片總體質量較好；現行標準需進一步提高，建議現行標準增加有關物質和亞硝酸鹽含量的檢測方法。

關鍵詞：甲硝唑片；質量評價；藥品標準；有關物質；亞硝酸鹽；溶出行為

中圖分類號：R917文獻標志碼：A

Abstract? ? Objective To evaluate the quality of metronidazole tablets from different manufactures. Methods The quality and standard controllability of metronidazole tablets was evaluated by researching on the original standard and the exploratory experiments including the determination of related substances and nitrite， dissolution behavior consistency and dissolution method inspection， and microbial limit method suitability test and analysis. Results? ? The qualified rate was 100.0% for the 130 batches of samples extracted according to the original standard. The exploratory research results showed that the impurity level of this product was mainly related to the API， and the difference of impurity detection among different enterprises was not obvious. Nitrite was detected in samples from different enterprises， which met the ICH limit requirements. The dissolution of samples from all enterprises in 15 min was more than 85%. The results of microbial limit test showed that metronidazole tablets had different degrees of inhibition on aerobic bacteria. Conclusion? ? The quality of metronidazole tablets was good at present and the current standard should be further improved. It was proposed that the related substance method and the nitrite method should be added.

Key words Metronidazole tablets; Quality evaluation; Drug standard; Related substance; Nitrite;

Dissolution behavior

甲硝唑為第一代硝基咪唑類抗感染藥物，對厭氧菌具有較強是抗菌作用，其抗菌原理是其硝基被易感生物激活還原成一種高活性的自由基陰離子，以蛋白質和DNA分子為靶點，抑制細菌的DNA合成，從而干擾細菌的生長、繁殖，最終導致細菌死亡。甲硝唑由GD SEARLE公司（輝瑞子公司）研發，1960年甲硝唑片在法國上市，商品名“FLAGYL”，1981年在中國境內上市。目前國內上市的制劑包括片劑（主要規格為0.2 g，另外還有0.1 g、0.25 g和0.5 g上市）、膠囊、注射液、溶液劑、凝膠劑、栓劑等。現行的USP、JP及ChP均收載有甲硝唑原料和甲硝唑片。

甲硝唑片為2022年國家質量評價抽驗品種，共抽到35個生產企業的130批樣品，涉及全國31個省、自治區和直轄市的藥品生產、經營和醫療單位，其中93批抽自經營單位，6批抽自醫療機構，31批抽自生產企業，可較客觀地反映國內該品種的質量現狀。本文按現行質量標準對130批樣品進行檢驗，并針對其中發現的問題開展相應的探索性研究，進而從有效性、安全性角度對該產品目前的質量現狀進行評價，并對完善制劑的質控標準提出建議。

1 儀器及試藥

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀（島津LC-2030 3D）、離子色譜色譜儀（22176-6000）、RC1208D型溶出度儀（天津天大天發科技公司）、UV-2600型紫外-可見分光光度計（日本島津公司）、電子分析天平（瑞士梅特勒XPE205）、高純水機（美國Millipore公司）、臥式矩形壓力蒸汽滅菌器（上海華成醫用核子儀器公司）、霉菌培養箱（重慶四達實驗儀器廠）、OLYMPUS.CH型三目顯微鏡（日本奧林巴斯公司）、pH酸度計（賽多利斯科技（北京）有限公司）。

甲醇（色譜純，美國SIGMA-ALORICH公司）、氫氧化鉀（分析純）、鹽酸（分析純）。

1.2 對照品

2-甲基-5-硝基咪唑對照品：批號100191-20180，純度100.0%，中國食品藥品檢定研究院。亞硝酸鈉對照品：批號E003013，純度99.0%，北京曼哈格生物科技有限公司。

1.3 菌株

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B） 26 003]、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC（B） 10 104]、枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis）[CMCC（B）63 501]，大腸埃希菌（Escherichia coli）[CMCC（B） 44 102]、白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC（F） 98 001]、黑曲霉（ Aspergillus niger）[CMCC（F） 98 003]。

1.4 樣品

甲硝唑片為2022年國家抽驗樣品，共130批，樣品涉及35個生產企業，個別企業未提供原輔料，部分企業提供了近效期樣品。

2 實驗方法

2.1 法定檢驗

分別按照《中國藥典》2020年版標準及各企業注冊標準對130批甲硝唑片進行檢驗。

2.2 探索性研究

2.2.1 有關物質測定

篩選并優化已通過一致性評價的企業G和企業H有關物質HPLC方法，并對所有企業樣品及部分近效期樣品有關物質進行考察[1-2]。色譜方法為：Welch

（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；流動相：甲醇：水（20：80， V/V）；柱溫：30℃；流速：1.0 mL/min；檢測波長315 nm；進樣量：20 μL。

2.2.2 亞硝酸鹽測定

篩選并優化已通過一致性評價兩家企業標準中的亞硝酸鹽IC方法，并對部分企業的亞硝酸鹽含量進行考察[3-4]。色譜條件：色譜柱AS11-HC RFICTM；柱溫：30℃；淋洗液：氫氧化鉀溶液；進樣量：10 μL，梯度洗脫表見表 1。

2.2.3 溶出行為一致性及溶出度方法考察

考察35家廠家的樣品在15 min時的溶出度，同時對兩種溶出度計算方式進行比較[5-6]。

2.2.4 微生物限度方法適用性實驗及分析

根據《中國藥典》附錄“微生物限度檢查法”對甲硝唑片進行需氧菌總數的檢驗，分別采用平皿傾注（直徑90 mm，1 mL/皿）法和中和培養基稀釋法對需氧菌總數和控制菌大腸埃希菌進行適用性試驗[7]。平皿傾注法適用性試驗，試驗組菌落數減去供試品對照組菌落數的值與菌液對照組菌落數的比值均應在0.5～2范圍內，即方法有效。中和培養基稀釋法適用性試驗分別設立試驗組、陽性組和陰性組，革蘭染色鏡檢試驗組和陽性組均應檢出大腸埃希菌革蘭陰性菌直短桿菌，兩端鈍圓，無芽孢），陰性組應無任何菌落生長。

3 結果與討論

3.1 法定檢驗結果

按現行質量標準檢驗，130批甲硝唑片全部合格，合格率為100.0%。

比較不同企業法定檢驗執行的質量標準差異，主要區別：①是否設置有關物質和亞硝酸鹽檢查項目；②亞硝酸鹽限度存在差異；③溶出度計算方式存在差異。

3.2 探索性研究結果

3.2.1 有關物質測定結果

對不同企業的甲硝唑片進行有關物質考察，典型色譜圖見圖1。從典型色譜圖可以看出，不同廠家甲硝唑片主要檢出4個雜質，查詢文獻，同時利用中國食品藥品檢驗研究院提供的甲硝唑雜質A（2-甲基-5-硝基咪唑）對照品進行定位，確定檢出的4個雜質中有一個已知雜質，其他3個均為未知雜質。雜質I為起始物料，雜質A為起始物料位置異構體，參照通過一致性評價的企業提供的研究資料和國抽標準內有關物質檢驗情況，雜質A和雜質I出峰位置基本一致，兩者合并控制。

采用通過一致性評價的企業有關物質的測定方法，對未通過一致性評價企業樣品進行有關物質考察。已知雜質2-甲基-5-硝基咪唑按外標法計算，檢出范圍在0.004%～0.02%，其中企業A有一批樣品已知雜質檢出量為0.02%，企業E和F均有一批樣品已知雜質檢出量為0.01%，但均小于企業G和H的已知雜質標準限度（0.1%）；雜質總量檢出范圍為0.01%～0.06%，均在限度0.4%范圍內。與通過一致性企業G和企業H比較，6家企業雜質檢出情況與企業G和H無較大差異。對所有企業樣品的雜質A（雜質I）、和雜質總量數據繪制頻數分布圖和箱式圖，見圖2～3。

從頻數圖可以看出，各企業樣品基本呈正態分布，已知雜質、其他單個最大雜質和雜質總量分布較為均勻。從箱式圖可以看出，與通過一致性評價的企業G和企業H的樣品檢驗情況比較，其他6家企業樣品中檢出的其他未知雜質個數更多，各雜質水平稍偏大，企業A個別批次的樣品已知雜質檢出情況和雜質總量出現了離散情況，但各企業整體雜質檢出情況比較穩定，雜質檢出含量普遍較小。

通過對企業A和E提供的近效期樣品和各企業提供的原料進行檢測發現，企業A、E近效期樣品的雜質檢出情況和效期樣品檢出情況一致，且各雜質含量無較大差異，也反應了甲硝唑片在正常的保存情況下，藥品質量較穩定；不同企業甲硝唑片檢出雜質種類、個數和甲硝唑原料檢出雜質基本一致，說明甲硝唑片劑生產過程中基本不引入其他工藝雜質。

綜上可知，甲硝唑片中的雜質水平基本由其原料藥的雜質水平決定，提示甲硝唑片中的雜質主要來源于原料藥，控制好原料藥生產工藝是保證制劑質量的關鍵。從甲硝唑片有關物質檢出情況推測，各企業由原料引入的工藝雜質均較低。

3.2.2 亞硝酸鹽測定結果

參考文獻[8-9]及通過一致性評價的企業H企業標準，采用離子色譜法對部分企業的亞硝酸鹽含量進行了考察，并進行比較分析，測定結果頻數分布圖見圖4，箱式圖見圖5。

甲硝唑片最大日服劑量2400 mg，治療期不超過1個月，參照ICH M7指導原則，日攝入量按120 μg/d計算，亞硝酸鹽限度應為0.005%。按通過一致性評價的企業H亞硝酸鹽檢查標準，對抽樣批數≥2的其他未控制亞硝酸鹽的企業進行亞硝酸鹽計算，通過分析甲硝唑片亞硝酸鹽測定結果，亞硝酸鹽檢出范圍在0.00017%～0.0019%，各企業亞硝酸鹽均在限度0.0045%范圍內。與通過一致性評價的企業G和H的樣品檢驗情況比較，13家企業樣品亞硝酸鹽檢出情況基本一致。

由頻數分布圖和箱式圖可知，各企業樣品基本呈正態分布，亞硝酸鹽含量分布較為均勻，企業B和N亞硝酸鹽含量批間差異較大，但各企業整體亞硝酸鹽檢出情況比較穩定，檢出含量普遍較小。

亞硝酸鹽為甲硝唑結構中硝基的降解產物，大量攝入亞硝酸鹽可誘導高鐵血紅蛋白血癥，臨床表現為口唇，指甲發紺，皮膚出現紫斑等缺氧癥狀，可致死亡；此外，亞硝酸鹽存在一定的致癌性，為了更好地控制甲硝唑片的質量，建議各企業在內部標準中對亞硝酸鹽含量進行控制。

3.2.3 溶出行為一致性及溶出度方法比較

按《普通口服固體制劑溶出度試驗技術指導原則》要求，對35家企業15 min溶出度進行了考察，同時對溶出度兩種計算方法進行了比較，如圖6～7所示。

由頻數分布圖和箱式圖可知，各企業溶出度均值并未出現明顯的離散，35家企業樣品15 min溶出度均大于85%，70批樣品的溶出度均值數據呈正態分布，分布均勻。

通過對70批樣品分別按吸收系數法和對照品比較法考察，實驗表明兩種方法的溶出度結果基本一致。考慮兩種計算方式各有優勢，且計算結果無較大差異，故各企業可繼續沿用各自執行標準的計算方式。

3.2.4 微生物限度測定

對35家企業的130批甲硝唑片采用平皿傾注法分別進行需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數檢測，所有供試品需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數均符合規定。采用中和培養基稀釋法進行控制菌（大腸埃希菌）檢查方法，所有供試品均沒有檢出大腸埃希菌。

4 結論

按法定標準檢驗，甲硝唑片合格率為100%，結合探索性研究情況認為，甲硝唑片總體質量情況較好。探索性研究結果顯示，甲硝唑片整體雜質檢出情況比較穩定，雜質檢出量普遍較小，與原料藥雜質含量相近；近效期樣品雜質檢出情況和效期樣品檢出情況一致，且各雜質含量無較大差異，反應了甲硝唑片在正常保存情況下，藥品質量穩定。為更好地反映藥品質量的標準，建議對質量標準中的方法進行統一。

參 考 文 獻

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