降解聚乙烯真菌哈茨木霉（Trichodermaharzianum）的篩選和鑒定

曹萌萌 朱利霞 桑成琛 栗婷軒 張艷君

摘 ?要：從長期覆膜農田土壤中篩選出一種能夠降解聚乙烯的菌株——哈茨木霉（Trichoderma harzianum）.將篩選出的哈茨木霉接種到以聚乙烯為唯一碳源的培養基中培育30天，聚乙烯失重率約為10%，聚乙烯薄膜表面出現明顯的孔洞和裂痕.

關鍵詞：聚乙烯；地膜；哈茨木霉；降解

[ ? 中圖分類號 ? ?]X172[ ? ?文獻標志碼 ? ] ?A

Screening and Identification of Polyethylene-degrading Fungus Trichoderma harzianum

CAO Mengmeng，ZHU Lixia*，SANG Chengchen，LI Tingxuan，ZHANG Yanjun

（College of Life Science and Agronomy，Zhoukou Normal University，Zhoukou 466001，China）

Abstract：A Trichoderma harzianum strain capable of degrading polyethylene was isolated from soil collected from a field with long-term plastic film mulching.After the fungus was isolated，Trichoderma harzianum was incubated for 30 days in a liquid medium with polyethylene film as the sole carbon source.The results showed that the weight loss of polyethylene film was about 10% after the incubation，obvious erosion holes and cracks appeared on the surface of degraded polyethylene film.

Key words：polyethylene；plastic film；Trichoderma harzianum；degradation

聚乙烯地膜殘留在土壤中嚴重影響土壤生態環境和農業的可持續發展，為了實現環保高效降解聚乙烯殘膜，亟需篩選可降解聚乙烯的微生物.地膜是我國農業生產中常用的生產資料之一，自地膜覆蓋技術被引入到我國后，農業生產中地膜的用量逐年增長，我國成為全球地膜覆蓋面積最大的國家.聚乙烯是一種穩定性好、抗腐蝕性強的高分子聚合物，是農業地膜最常用的塑料.[1]聚乙烯地膜可以改善土壤水熱狀況，提高作物產量，然而當季作物收獲后，聚乙烯地膜常常由于風化破敗而無法繼續使用，導致大量聚乙烯地膜殘留在土壤中，造成白色污染[2] ，導致土壤生產力的降低和生態環境的破壞，影響農業的可持續發展.目前解決聚乙烯殘膜污染的方法主要是焚燒、填埋、回收利用等.聚乙烯農用地膜厚度過薄，回收成本較高，焚燒和填埋成為處理聚乙烯殘膜的主要方法，而焚燒和填埋聚乙烯殘膜又會造成嚴重的二次污染.[3]探尋清潔高效的聚乙烯殘膜降解途徑，解決由聚乙烯殘膜引起的環境問題至關重要.微生物生長繁殖速度快，代謝旺盛，代謝類型多，是一種有效降解聚乙烯的途徑.[4]對單一菌種的降解效果研究表明，真菌的菌絲可以更好地附著在聚乙烯殘膜的表面并能穿透殘膜，其降解效果遠遠優于細菌.[5]因此，真菌在緩解聚乙烯殘膜造成的環境問題方面具有更大的潛力.[6]本研究從長期覆蓋地膜的農田土壤中分離出一株能有效降解聚乙烯塑料的真菌.

1 材料和方法

1.1 供試材料

2021年11月，采集周口市川匯區農田的土壤，該農田從2009年以來長期種植蔬菜并覆蓋聚乙烯地膜，土壤中殘留大量聚乙烯薄膜.

試驗所用聚乙烯為農貿市場購置的農用地膜，在實驗開始前將其剪成4 cm×4 cm的方塊形，依次用1%十二烷基硫酸鈉溶液、95%乙醇和75%乙醇浸泡并滅菌，在超凈工作臺中風干，備用.

培養基為液體無機鹽培養基和固體無機鹽培養基.固體無機鹽培養基由液體無機鹽培養基添加1.8%的瓊脂制得.馬鈴薯葡萄糖培養基（PDA）由馬鈴薯、葡萄糖、瓊脂制成，pH值自然.

1.2 聚乙烯降解菌的分離純化

將采集的土壤樣品5 g加入45 mL無菌生理鹽水中，150 r/min振蕩30 min，制得土壤稀釋液.移取20 μL土壤稀釋液于100 mL以1%聚乙烯為唯一碳源的無機鹽培養基中，用于分離以聚乙烯為唯一碳源的菌株.移取20 μL土壤稀釋液于100 mL不添加聚乙烯的無機鹽培養基中作為對照.將接種過的培養基置于28 ℃恒溫培養箱中，振蕩（150 r/min）培養10天.棄去聚乙烯膜，將所得培養液用無菌生理鹽水梯度稀釋后取稀釋液0.2 mL，涂布法接種于馬鈴薯葡萄糖培養基上培養，采用平板劃線法進行多次轉接，獲得菌株的純培養.

將得到的菌株以涂布法接種到鋪有4 cm×4 cm聚乙烯的固體無機鹽培養基上，置于28 ℃恒溫培養箱中，觀察聚乙烯膜片周圍菌落的形成情況，篩選出具有潛在降解聚乙烯能力的菌株.

1.3 聚乙烯降解菌的鑒定

形態學鑒定 參考楊合同[7]等的分類方法，對PDA培養皿上的菌落形態進行觀察對比，初步判定其分類地位.

分子生物學鑒定[8-9] ?將篩選到的菌株采用生工生物工程（上海）有限公司柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒提取總DNA，測定ITS序列.采用ITS通用引物ITS1 （5′-TCCGTACCTGAACCTGCGG-3′）和ITS4 （5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）進行擴增，用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，將檢測合格的PCR產物送至北京諾禾致源科技股份有限公司測序.測序結果用Bioedit軟件分析，截取可信度較高的序列，使用NCBI-BLAST（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）將截取序列與數據庫中的序列進行比對分析，根據ITS序列的相似度鑒定菌株. 采用鄰接法用MEGA 7.0構建系統發育樹，分析菌株之間的親緣關系.

1.4 聚乙烯降解菌降解效能分析

聚乙烯失重率測定 在無菌條件下將純化的菌株以5%的接種量接種到含聚乙烯片的液體無機鹽培養基中，28 ℃，150 r/min培養30天，分別在第5，10，15，20，25和30天測定聚乙烯片的失重率.用去離子水反復清洗聚乙烯片，去除其表面附著的菌體，并將聚乙烯片置于50 ℃烘箱中干燥過夜，冷卻稱重.根據培養前后聚乙烯膜片的質量變化計算失重率.

培養基中降解菌生長情況 將菌株PT1的菌懸液按照體積比10%的比例接種到以聚乙烯為唯一碳源的無機鹽液體培養基中，聚乙烯薄膜加入量按照1%的質量比加入聚乙烯薄膜，在28 ℃條件下振蕩（150 r/min）培養30天，分別記錄第5，10，15，20，25和30天液體培養基的光密度值（OD600）.

掃描電鏡觀察聚乙烯微觀形態 將降解30天的聚乙烯薄膜清洗去除其表面附著的菌膜及其他雜質后，自然風干，用掃描電子顯微鏡觀察接種與未接種菌株PT1培養基中聚乙烯薄膜的特征，比較聚乙烯薄膜表面微觀形態變化情況.

2 結果和分析

2.1 聚乙烯降解菌的篩選

將接種土壤懸液的無機鹽培養基置于28 ℃，150 r/min培養10天后，含有聚乙烯片的培養基明顯渾濁，未加聚乙烯片的培養基清澈.采用平板劃線法分離純化獲得菌株，將其命名為PT1.

2.2 菌株PT1的鑒定

在28 ℃條件下，聚乙烯降解菌PT1菌株在馬鈴薯葡萄糖培養基上的菌落氣生菌絲呈白色絨毛狀，中心部位有產孢簇，初始顏色綠色，之后逐漸加深（圖1），這與楊合同[7]等描述的木霉屬菌落特征基本一致.初步判定該菌株為木霉屬微生物.

將提取的DNA序列擴增后回收測序，序列片段長度為618 bp.將序列提交至NCBI數據庫進行核酸序列比對，發現該菌株與哈茨木霉的ITS序列同源性高于99%，從親緣關系上判定菌株PT1為木霉屬哈茨木霉.構建PT1菌株系統發育樹（圖2），發現菌株PT1與哈茨木霉（Trichoderma harzianum，Genebank ID： AF345950.1）位于同一分支.因此，結合形態學特征和分子生物學特征，判定該聚乙烯降解菌株PT1為哈茨木霉（Trichoderma harzianum）.

2.3 哈茨木霉對聚乙烯的降解效能

在培養過程中，培養基光密度值OD600呈現出先增加后降低的趨勢（圖3A）.在培養前10天，OD600較小（OD600<0.05），培養液中菌株濃度較低，這可能是菌株適應培養液環境的過程，根據微生物生長發育規律，此時菌株處于延滯期；在10～20天，OD600增加較快，此時哈茨木霉已經適應該環境，菌株大量增長并以聚乙烯為碳源進行生長繁殖，菌株處于快速生長期；在第20～30天，OD600增加緩慢，培養液中菌體數量下降，可能是由于此時培養液中無機鹽含量逐漸減少，成為菌株生長的限制因子，且菌株代謝產物的積累抑制其自身的生長繁殖，導致此時菌株生長處于衰亡期.此外，菌株在生長過程中為了利用碳源而大量附著在聚乙烯片表面也可能導致培養液中菌株濃度下降.

比較聚乙烯薄膜在接種哈茨木霉前后的質量損失，評價聚乙烯薄膜的表觀降解狀況.經過30天的培養后，聚乙烯薄膜失重率約為10%，表明哈茨木霉能夠降解聚乙烯（圖3B）.

哈茨木霉接種于聚乙烯薄膜為唯一碳源的無機鹽培養中30天后，用掃描電鏡檢測聚乙烯表面微觀形態的變化（圖4）.聚乙烯片表面結構發生明顯的變化，出現孔洞和裂痕，未接種哈茨木霉的聚乙烯片表明光滑，無變化，說明哈茨木霉能夠附著在聚乙烯片表面并以聚乙烯為碳源進行生長繁殖，哈茨木霉能夠有效降解聚乙烯.

3 討論

聚乙烯由乙烯單體經過聚合反應形成，是一種高分子聚合物，具有耐用、抗腐蝕的特點，被廣泛用于工業和農業領域.農膜的使用使得大量聚乙烯殘留在土壤中，影響土壤生態環境和農業可持續發展.本研究從長期覆蓋聚乙烯薄膜的土壤中篩選出一株聚乙烯降解真菌——哈茨木霉，該菌株能夠降解低密度聚乙烯.哈茨木霉是一種腐生真菌，隸屬于盤菌亞門、肉座菌目、肉座菌科、木霉屬.哈茨木霉具有降解纖維素的能力，能夠分泌促生因子，降解多環芳烴等.[10]已有的降解聚乙烯的真菌主要為曲霉屬真菌，也有關于青霉屬真菌降解聚乙烯的報道，關于木霉屬真菌的報道較少.李夏[11]等分離出一種能夠降解聚乙烯農膜的枯青霉，培養100天后，聚乙烯薄膜結構發生明顯改變，在該條件下枯青霉對聚乙烯的降解速度較慢.

聚乙烯微生物降解過程是微生物附著、菌絲生長、產酶降解最終被分解為CO2和水的過程.[12]在聚乙烯降解的整個過程中，哈茨木霉菌株處于寡營養條件下，30天后聚乙烯失重率10%左右.微生物在寡營養條件下會啟動適應機制以維持自身生長[13]，菌株在聚乙烯無機鹽培養基中的生長濃度較高，可能是由于菌株在生長過程中啟動了適應機制，缺乏有效碳源的條件下微生物會改變其對碳源的利用偏好[14]，由此，哈茨木霉以聚乙烯為碳源進行生長代謝活動.由于哈茨木霉能夠以聚乙烯作為碳源，經過30天的培養后，大量菌絲侵入并穿透聚乙烯薄膜，使得聚乙烯出現明顯的破損和孔洞，這直接證明了哈茨木霉能夠有效降解聚乙烯.

目前已發現的菌株對聚乙烯等塑料的降解效率較低，具有高效生物降解性能的菌株還很稀少，尋找高效的聚乙烯降解微生物和酶系統，豐富降解菌種資源庫的研究亟待加強.Khan[15]等發現在基礎無機鹽培養基中額外添加2%葡萄糖，可大大提高賓曲霉對塑料地膜的降解能力.此外，在利用微生物降解塑料制品試驗中，可以通過調節pH值、控制培養溫度、添加金屬離子及其他化學物質等改善菌株對聚乙烯等塑料的降解效果，挖掘其降解潛能.由于微生物在降解聚乙烯過程中會分泌相應的降解酶（如水解酶、氧化還原酶），這就使得了解降解酶及其產生過程顯得更為重要.因此，在今后的研究中，我們將從哈茨木霉在降解聚乙烯過程中產生降解酶及調控降解酶產生的基因入手，深入了解哈茨木霉降解聚乙烯的機制，挖掘其在降解聚乙烯方面的潛能，為農業可持續發展提供科學依據.

4 結論

從長期覆膜的農田土壤中分離篩選出1株能夠有效降解聚乙烯塑料的菌株，通過形態學特征和ITS序列同源性比對，初步鑒定該菌株為木霉屬哈茨木霉.通過失重法、培養液光密度值和表面微觀形態等方法驗證了該菌株能夠有效降解聚乙烯.本研究中篩選出的菌株尚未進行降解條件的優化及其降解機制的研究，后期我們將探究如何提高該菌株對聚乙烯的降解效能，以期為農田聚乙烯殘膜的高效環保降解提供參考.

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編輯：琳莉