基于JAK1/STAT3通路的壽胎丸對復發性流產小鼠細胞自噬的影響

牟珍妮 ，申思楠 ，唐麗 ，劉瑩蝶 ，周紫薇 ，雷磊

1.湖南中醫藥大學中西醫結合學院，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007

復發性流產（recurrent spontaneous abortion，RSA）是指與同一性伴侶在妊娠28周之前發生3次或以上的妊娠丟失[1]，是妊娠常見的并發癥之一，給妊娠婦女造成極大身心痛苦。RSA的防治已成為國內外生殖領域研究的重點。因此，探索更加準確、安全、有效的RSA診療方法是臨床亟需解決的難題。

RSA病因復雜，除染色體異常、解剖結構異常、內分泌紊亂、免疫因素等已知原因外，目前仍有40%～60%患者病因不明[2]。細胞自噬是一種高度保守的細胞行為，可以為細胞修復損傷的細胞器提供能量，參與生物體發育、免疫反應、代謝調節、細胞凋亡和衰老等多種過程[3]。越來越多研究表明，細胞自噬與RSA密切相關[4-8]，但細胞自噬與RSA的具體作用關系尚存在爭議，且其參與RSA 的具體機制尚不清晰。JAK/STAT信號通路是RSA重要的信號轉導通路，該通路中轉錄因子信號轉導和轉錄激活因子3（STAT3）與細胞自噬密切相關。

壽胎丸出自《醫學衷中參西錄》，具有補腎安胎功效，壽胎丸聯合西藥治療不明原因RSA臨床療效顯著優于單純西藥治療[9-10]。基礎研究表明，壽胎丸具有改善黃體功能[11]，增強滋養層細胞增殖、侵襲、遷移能力[12]，減少細胞凋亡等作用[13-17]。本研究通過建立RSA小鼠模型，觀察壽胎丸對RSA小鼠的妊娠保護作用，并從JAK1/STAT3信號通路和自噬角度探討其可能作用機制，為臨床治療RSA提供實驗依據。

1 實驗材料

1.1 動物

40 只SPF 級雌性CBA/J 小鼠及15 只SPF 級雄性DBA/2小鼠，體質量（20±2）g，均購于北京華阜康生物科技股份有限公司，動物許可證號SCXK（京）2019-0008；5只雄性BALB/c小鼠，體質量（20±2）g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物許可證號SCXK（湘）2019-0004。動物飼養于湖南中醫藥大學SPF 級實驗動物中心，溫度（22±2）℃，濕度（50±5）%，自由攝食飲水，光照/黑暗周期12 h。本實驗經湖南中醫藥大學動物倫理委員會審批（LL2021032501）。

1.2 藥物及制備

壽胎丸（菟絲子12 g，桑寄生6 g，續斷6 g，阿膠6 g），飲片購自湖南中醫藥大學第一附屬醫院藥劑科。取菟絲子、續斷、桑寄生飲片，加6～8倍量蒸餾水煎煮2 次，每次1.5 h，合并濾液，濃縮至相對密度為1.1～1.2（50～60 ℃）。加入乙醇使含醇量達65%，冷藏24 h，過濾，回收乙醇至無醇味。阿膠烊化，與濃縮后藥液合并，過濾，加蒸餾水稀釋至原藥材濃度為1.5 g/mL。地屈孕酮片，荷蘭Abbott Biologicals B.V.，批號364221，10 mg/片。取10 mg 地屈孕酮片溶于20 mL蒸餾水中，配制成0.5 mg/mL溶液。

1.3 主要試劑與儀器

小鼠孕酮、β-人絨毛膜促性腺激素（β-HCG）ELISA試劑盒（上海撫生實業有限公司，批號分別為A119292-96T、A105057-96T），HE 染色液（白鯊生物，批號BL700B），BCA蛋白濃度測定試劑盒（武漢伊萊瑞特，批號E-BC-K318-M），Janus 激酶1（JAK1）、p-JAK1、STAT3、p-STAT3 抗體（Affinity Biosciences，批號分別為AF5012、AF2012、AF6294、AF3293），ATG5抗體（成都正能生物技術有限公司，批號381320），Beclin1、LC3抗體（Proteintech，批號分別為11306-1-AP、14600-1-AP），超純總RNA提取試劑盒（杭州新景生物，批號5003050），反轉錄試劑盒、SYBR染料（蘇州近岸蛋白，批號分別為E047、E096）。

Gel Doc XR+凝膠成像系統（美國Bio-Rad公司），Heraeus Fresco 17 型超速冷凍離心機（美國Thermo Fisher Scientific公司），Cytation3型多功能酶標儀（美國BioTek 公司），HM355S 型石蠟切片機（美國Thermo Fisher Scientific公司），T100TMThermal Cycler型RT-PCR 擴增儀（美國Bio-Rad 公司），Mini-PROTEAN Tetra型電泳槽、Mini Trans-Blot型轉印槽（美國Bio-Rad公司），SW-CJ-1FD型超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）。

2 實驗方法

2.1 造模

40只雌性CBA/J小鼠分別與15只雄性DBA/2小鼠和5只雄性BALB/c小鼠按2∶1合籠交配，前者建立RSA小鼠模型（30只），后者建立正常妊娠小鼠模型（10只）。于合籠次日早晨對雌鼠進行陰道涂片，涂片出現大量精子或見陰道栓，記為妊娠第0日。

2.2 分組及給藥

將30只RSA模型小鼠隨機分為模型組、地屈孕酮組和壽胎丸組，每組10只；10只正常妊娠模型小鼠為空白組。妊娠第0日開始給藥，壽胎丸組予壽胎丸藥液12 g/kg灌胃，地屈孕酮組予地屈孕酮溶液4.55 mg/kg灌胃（相當于60 kg成人等效劑量），模型組和空白組予等量生理鹽水灌胃，每日1次，連續12 d。

2.3 取材

給藥結束后麻醉小鼠，摘眼球取血，靜置1 h，3 500 r/min離心15 min，取血清，于-20 ℃冰箱保存備用。采血后將小鼠固定于鼠板，腹部做“U”形切口，打開腹腔，鈍性分離子宮，用眼科剪自宮角處打開子宮壁，小號彎鑷剝離胚胎及胎盤，分離著床部位蛻膜組織，每只小鼠取3個胚胎蛻膜組織和胎盤組織固定于多聚甲醛，余下蛻膜組織分裝于凍存管和離心管中，置于-80 ℃冰箱保存。

2.4 指標檢測

2.4.1 胚胎丟失率

觀察胚胎形態，以胚胎體積明顯縮小，胎盤單位有明顯出血或壞死為胚胎丟失標準[18]，計算胚胎丟失率。胚胎丟失率（%）=丟失胚胎數÷總胚胎數×100%。

2.4.2 子宮臟器系數

稱量小鼠體質量，分離子宮后稱量子宮質量，計算子宮臟器系數。子宮臟器系數（%）=子宮質量÷體質量×100%。

2.4.3 HE染色

將蛻膜組織和胎盤組織從多聚甲醛中取出，梯度乙醇脫水后石蠟包埋，切片（厚度3 μm），烤片，脫蠟，蘇木素染色5 min，伊紅染色3 min，流水返藍，梯度乙醇復水，二甲苯透明后中性樹脂封片。采用顯微成像系統采集圖像。

2.4.4 ELISA檢測

按試劑盒說明書配制標準品及樣品，依次加入樣品、酶標試劑、洗滌液、顯色劑A、顯色劑B、終止液等試劑，酶標儀波長450 nm檢測各孔OD值。根據標準曲線回歸方程計算血清孕酮和β-HCG含量。

2.4.5 Western blot檢測

將蛻膜組織制成勻漿，用含蛋白酶抑制劑及磷酸酶抑制劑的RIPPA裂解液裂解，4 ℃、12 500 r/min離心15 min，取上清液，BCA法測定蛋白濃度，配制濃度為20 μg/μL的蛋白上樣液，依次進行電泳、轉膜、封閉、洗膜，加入JAK1一抗（1∶2 000）、p-JAK1一抗（1∶2 000）、STAT3一抗（1∶2 000）、p-STAT3一抗（1∶2 000）、ATG5一抗（1∶2 000）、Beclin1一抗（1∶5 000）、LC3一抗（1∶3 000），4 ℃震蕩孵育過夜。洗膜，二抗37 ℃震蕩孵育60 min。加ECL熒光底物顯色，曝光并采集圖片，分析蛋白表達量。

2.4.6 實時熒光定量PCR檢測

將蛻膜組織加入Trizol 研磨后用氯仿萃取RNA，反轉錄成cDNA。RT-PCR 反應條件：95 ℃、3 min；95 ℃、10 s，58 ℃、5 s，共40個循環。生成擴增曲線及熔解曲線，得出Ct 值，各目的基因的表達量以GAPDH為內參基因進行標準化，采用2-ΔΔCt法計算各基因相對表達量。引物序列見表1。

表1 各基因PCR引物序列

3 統計學方法

4 結果

4.1 壽胎丸對模型小鼠胚胎丟失率的影響

正常組小鼠子宮體顏色淡紅，胚胎大小均勻、如串珠，胚胎無明顯瘀血及出血情況；模型組小鼠子宮顏色黯紅，胚胎發育不均勻，部分胚胎出現瘀血、壞死、吸收情況；地屈孕酮組和壽胎丸組小鼠胚胎發育情況較模型組明顯改善，僅個別胚胎出現瘀血。見圖1。

圖1 各組小鼠胚胎形態

除地屈孕酮組1只小鼠見陰栓而未妊娠外，其余小鼠均成功妊娠。與正常組比較，模型組小鼠胚胎丟失率顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，地屈孕酮組和壽胎丸組小鼠胚胎丟失率顯著降低（P＜0.01）。見表2。

表2 各組小鼠胚胎丟失率比較

4.2 壽胎丸對模型小鼠子宮臟器系數的影響

與空白組比較，模型組小鼠子宮臟器系數降低，差異有統計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，地屈孕酮組和壽胎丸組小鼠子宮臟器系數升高，差異有統計學意義（P＜0.01）。見表3。

表3 各組小鼠子宮臟器系數比較（±s）

表3 各組小鼠子宮臟器系數比較（±s）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，▲▲P＜0.01

組別空白組模型組地屈孕酮組壽胎丸組子宮臟器系數/%10.66±2.85 6.01±2.48**9.15±2.25▲▲9.38±2.17▲▲只數10 10 9 10體質量/g 25.30±2.04 23.18±0.87 25.25±2.39 25.98±1.44子宮質量/g 2.67±0.59 1.39±0.57 2.33±0.73 2.43±0.52

4.3 壽胎丸對模型小鼠蛻膜組織和胎盤組織病理形態的影響

正常組小鼠蛻膜組織細胞呈卵圓形，排列緊密，胞質豐富，核仁明顯，血管分布均勻，管壁完整；模型組小鼠蛻膜組織細胞排列雜亂，胞核固縮、部分消失，胞質水腫，部分呈空泡樣變，血管分布較少；地屈孕酮組和壽胎丸組小鼠胎盤組織細胞排列相對有序，細胞形態較規則，僅有少量細胞水腫壞死，血管分布較均勻，管壁完整。見圖2。

圖2 各組小鼠蛻膜組織形態（HE染色，×200）

正常組小鼠胎盤組織致密，細胞排列整齊，形態規則，細胞核呈橢圓形，胞質充盈，血管豐富，分布均勻，管壁完整；模型組小鼠胎盤組織疏松，細胞排列雜亂，部分細胞增生肥大，胞核固縮，胞漿廣泛空泡樣變，大量炎性細胞浸潤，血管分布較少；地屈孕酮組和壽胎丸組小鼠胎盤組織細胞排列較整齊，細胞形態較規則，僅少量細胞出現水腫、核固縮，血管分布較均勻。見圖3。

圖3 各組小鼠胎盤組織形態（HE染色，×200）

4.4 壽胎丸對模型小鼠血清孕酮、β-人絨毛膜促性腺激素含量的影響

與空白組比較，模型組小鼠血清孕酮、β-HCG含量顯著減少（P＜0.01）；與模型組比較，地屈孕酮組和壽胎丸組小鼠血清孕酮、β-HCG 含量顯著增加（P＜0.01，P＜0.05）。見表4。

表4 各組小鼠血清孕酮、β-HCG含量比較（±s）

表4 各組小鼠血清孕酮、β-HCG含量比較（±s）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

β-HCG/（pg/mL）1 996.89± 85.24 1 766.33± 58.41**1 903.74±139.35▲1 894.48± 95.19▲組別空白組模型組地屈孕酮組壽胎丸組只數6666孕酮/（ng/mL）2.78±0.04 2.54±0.08**2.67±0.06▲▲2.71±0.09▲▲

4.5 壽胎丸對模型小鼠蛻膜組織JAK1/STAT3 通路蛋白及自噬相關蛋白表達的影響

與空白組比較，模型組小鼠蛻膜組織p-JAK1、p-STAT3、ATG5、Beclin1蛋白表達及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.01，P＜0.05）；與模型組比較，地屈孕酮組和壽胎丸組小鼠蛻膜組織p-JAK1、p-STAT3、ATG5、Beclin1 蛋白表達及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.01，P＜0.05）。見圖4、表5。

圖4 各組小鼠蛻膜組織JAK1、p-JAK1、STAT3、p-STAT3、ATG5、Beclin1、LC3蛋白免疫印跡

表5 各組小鼠蛻膜組織JAK1、p-JAK1、STAT3、p-STAT3、ATG5、Beclin1、LC3蛋白表達比較（±s）

表5 各組小鼠蛻膜組織JAK1、p-JAK1、STAT3、p-STAT3、ATG5、Beclin1、LC3蛋白表達比較（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ1.98±0.54 0.91±0.25*2.05±0.72▲2.01±0.60▲組別空白組模型組地屈孕酮組壽胎丸組只數3333 p-JAK1/JAK1 0.94±0.07 0.52±0.07**0.92±0.15▲▲0.87±0.11▲▲p-STAT3/STAT3 0.72±0.16 0.26±0.10**0.64±0.06▲▲0.65±0.17▲▲ATG5/GAPDH 1.43±0.26 0.57±0.27*1.36±0.48▲1.42±0.34▲Beclin1/GAPDH 1.46±0.20 0.91±0.27*1.52±0.31▲1.45±0.27▲

4.6 壽胎丸對模型小鼠蛻膜組織JAK1、STAT3、ATG5、Beclin1 mRNA表達的影響

與空白組比較，模型組小鼠蛻膜組織JAK1、STAT3、ATG5、Beclin1 mRNA表達降低，差異有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，地屈孕酮組和壽胎丸組小鼠蛻膜組織JAK1、STAT3、ATG5、Beclin1 mRNA 表達升高，差異有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。見表6。

表6 各組小鼠蛻膜組織JAK1、STAT3、ATG5、Beclin1 mRNA表達比較（±s）

表6 各組小鼠蛻膜組織JAK1、STAT3、ATG5、Beclin1 mRNA表達比較（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

組別空白組模型組地屈孕酮組壽胎丸組Beclin1 1.00±0.09 0.13±0.02**0.81±0.05▲▲0.77±0.22▲▲只數3333 JAK1 1.02±0.23 0.26±0.12*0.70±0.05▲0.74±0.06▲STAT3 1.00±0.10 0.23±0.01*0.75±0.01▲▲0.76±0.04▲▲ATG5 1.02±0.25 0.23±0.03**0.77±0.10▲▲0.78±0.04▲▲

5 討論

RSA是女性妊娠常見的并發癥之一，發病率約為1%～5%[1]。RSA 屬中醫學“滑胎”“數墮胎”范疇，具有屢孕屢墮及應期而下的特點。腎主生殖，胞絡系于腎，中醫學認為滑胎本于腎虛所致沖任虛衰，胎失所養，胎結不實。《醫學衷中參西錄》壽胎丸是治療RSA的經典方劑，由菟絲子、桑寄生、續斷、阿膠四藥組成。菟絲子滋補肝腎，益陰而固陽；桑寄生補肝腎，養血而固沖任，安胎；續斷甘溫助陽，補益肝腎、調理沖任、固本安胎；阿膠滋陰養血，止血。四藥合用，共奏補腎安胎功效。臨床和實驗研究均表明，壽胎丸能改善RSA的妊娠結局[19-20]。本研究結果顯示，壽胎丸干預能明顯提高RSA小鼠的胚胎丟失率、子宮臟器系數，并能改善RSA小鼠蛻膜及胎盤組織病理狀態，提示壽胎丸對RSA 小鼠具有明顯的妊娠保護作用。

自噬通過泛素蛋白酶系統維持細胞內穩定，由雙層膜性結構對細胞內成分進行包裹，之后通過與溶酶體結合從而將包裹的內容物進行分解、再利用[21-22]。研究發現，自噬反應活性失調對妊娠期并發癥的發生存在不可忽視的影響[23]。卵母細胞受精、胚胎植入前后的發育，以及妊娠期并發癥均涉及自噬的誘導，當滋養細胞早期處于炎癥、缺氧和營養有限的環境下，自噬對其有重要的保護作用，利于其適應早期發育的微環境[24-25]。有研究顯示，與正常妊娠孕婦胎盤絨毛組織相比，流產、子癇前期、胎兒生長受限、妊娠期糖尿病等病理妊娠的孕婦胎盤絨毛組織均出現自噬過程受損[4，26-28]。ATG5、Beclin1、LC3是自噬過程中3種標志性分子，其中ATG5和Beclin1是自噬體形成必需的蛋白，ATG5通過組成泛素化系統ATG5-ATG12-ATG16L介導自噬體的形成[29]，Beclin1通過參與組成PI3K復合體誘導細胞自噬[30]。當自噬發生時，胞漿型LC3-Ⅰ會酶解掉一小段多肽轉變為膜型LC3-Ⅱ，其轉化率增加與自噬小體數量增加有關，因此，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值大小可反映自噬水平高低[31]。本研究結果表明，RSA模型小鼠自噬相關分子ATG5、Beclin1蛋白及mRNA表達顯著降低，且LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明顯下調，而壽胎丸組及地屈孕酮組均升高，說明RSA與自噬過程受到抑制相關，而壽胎丸可能通過激活自噬起到妊娠保護作用。

自噬受多種信號通路調控，JAK/STAT通路是參與自噬的重要通路[32-33]。STAT3 是STAT 家族的重要成員，有研究顯示，在小鼠妊娠的胚胎著床期，p-STAT3在胚泡植入部位的子宮內膜腺上皮和間質組織高表達，并且隨著胚胎著床過程的進行，STAT3的表達及活化過程主要在蛻膜細胞內，推測STAT3可能在子宮內膜蛻膜化及胚胎著床過程中起關鍵作用。而敲除STAT3基因的小鼠在妊娠第7日胚胎即死亡[34]。本研究發現，RSA小鼠蛻膜組織p-JAK1、p-STAT3蛋白及mRNA表達降低，說明JAK1/STAT3通路激活被抑制，而壽胎丸組和地屈孕酮組p-JAK1、p-STAT3蛋白及mRNA表達較模型組均顯著升高，表明壽胎丸可激活JAK1/STAT3通路，從而改善RSA小鼠的妊娠結局。

綜上所述，壽胎丸可能通過調控JAK1/STAT3信號通路激活自噬，改善RSA蛻膜組織及胎盤組織病理狀態、提高血清激素水平、降低胚胎丟失率，從而起到與地屈孕酮相似的保胎效果。但目前細胞自噬在RSA方面的研究仍處于起步階段，對細胞自噬涉及的相關通路及具體機制仍不完全明確，且細胞自噬在RSA方面的研究仍存在一定爭議，今后將進一步通過體外實驗驗證細胞自噬在RSA中的作用機制及壽胎丸的干預作用。