基于ERK/COX-2信號通路研究電針干預原發性痛經機制

李娟，劉余，薛曉，袁菡鈺，汪少華，潘思安，岳增輝

湖南中醫藥大學針灸推拿與康復學院，湖南 長沙 410208

原發性痛經（primaiy dysmenorrhea，PDM）是以下腹部痙攣性疼痛為主要特征且無盆腔器質性病變的月經疼痛，并可放射至下背部或腿部，常伴隨頭痛、惡心、腹瀉及尿頻等癥狀。流行病學研究指出，不同年齡和國籍人群PDM發病率在45%～97%，嚴重影響患者日常生活[1]。關于PDM的主要發病機制，普遍認為與子宮前列腺素（PG）水平異常升高有關[2]。目前治療以布洛芬為代表的非甾體抗炎藥為主，但容易引起惡心、嘔吐、胃灼熱等不良反應[3]。大量研究表明，電針可以有效緩解PDM疼痛且治愈率高[4-6]，無明顯不良反應，但其干預機制尚不明確。

絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）在細胞信號傳遞中具有十分重要的作用，經過受體、轉錄因子等因素的影響激活，將表面信號傳導到核內部，控制細胞生長發育、分化、癌變、轉移、凋亡、炎癥等多種生命活動過程，成為許多疾病研究的重點[7-8]。MAPK可分為ERK、p38、JNK和ERK5共4個亞族。研究表明，MAPK/ERK信號通路是影響PDM發生發展的重要通路和調控因子[9-10]。環氧化酶-2（COX-2）是影響PGs釋放的關鍵酶[11]，COX-2表達升高誘導PGs合成及釋放，誘發炎癥，導致疼痛[12]，下調MAPK/ERK信號通路相關蛋白COX-2表達能減少PGs釋放，緩解痛經[13]。本研究通過建立PDM大鼠模型，基于ERK/COX-2信號通路研究電針治療PDM的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級健康未孕雌性SD大鼠40只，8～10周齡，體質量180～200 g，動物許可證號SCXK（京）2019-0008。飼養于室溫20～25 ℃、濕度50%～70%環境，自由飲水進食，適應性飼養1周后開始實驗。本研究經湖南中醫藥大學動物倫理委員會審批（LL2021040703），并遵循關于善待動物的指導意見。

1.2 主要試劑與儀器

布洛芬（批號13062，中美天津史克制藥有限公司），苯甲酸雌二醇（批號2011052，4 mg/2 mL，寧波第二激素廠），縮宮素（貨號P1029，純度98.52%，美國Selleck），亞甲基藍（貨號C12086108，上海麥克林生化科技有限公司），HE染色試劑盒（貨號C0105，中國生物技術），PGE2、PGF2α ELISA 試劑盒（貨號20211111-J2944、20211111-J3106，湖南艾方生物科技有限公司），GAPDH 抗體（貨號GB15002，武漢Servicebio），ERK1/2抗體（貨號AF02700，湖南艾方生物），p-ERK1/2抗體（貨號AF01038，湖南艾方生物），COX-2 抗體（貨號GB11077-2，武漢Servicebio），HRP-山羊抗鼠二抗（貨號GB25301，武漢Servicebio），HRP-山羊抗兔二抗（貨號GB25303，武漢Servicebio）。

光學顯微鏡（型號BA410E，廈門Motic），切片機（型號UC7，德國Leica），酶標儀（型號RT-6100，美國Rayto），渦旋混勻儀（型號MV-100，武漢Servicebio），化學發光儀（型號6300，上海CLINX），電針儀（型號SDZ-V，蘇州醫療用品有限公司）。

1.3 分組及造模

采用隨機數字表法將40只大鼠分為空白組、模型組、電針組和布洛芬組，每組10 只。參照前期研究[14-15]優化造模方法：通過陰道涂片篩選處于動情間期大鼠造模，模型組、電針組和布洛芬組連續10 d于股部皮下注射苯甲酸雌二醇，第1、10日注射0.5 mL/只，第2～9 日注射0.2 mL/只，第11 日腹腔注射縮宮素2 U/只誘發扭體反應，空白組注射0.9%氯化鈉溶液。以大鼠子宮收縮出現扭體反應為造模成功標準[16]。

1.4 干預

造模第1 日開始干預，電針組參考《實驗針灸學》[17]選穴。將大鼠固定于鼠板，常規消毒后“三陰交”直刺約5 mm，兩側“三陰交”隔日交替電針，“關元”直刺約2 mm，得氣后連接電針儀，連續波，頻率50 Hz，強度以大鼠局部肌肉輕微抽動，不出現掙扎嘶叫為度。每日1次，每次20 min，連續10 d。布洛芬組予布洛芬生理鹽水溶液（1.25 mg/mL）灌胃，0.8 mL/只，每日1次。空白組和模型組只捆綁，不做其他處理。

1.5 指標檢測

1.5.1 扭體潛伏期、扭體次數及扭體評分測定

第11日注射縮宮素后，記錄大鼠30 min內出現扭體反應的時間，即扭體潛伏期，記錄出現扭體反應的次數。參照行為學評分標準進行扭體評分[18]：正常探查行為，0分；身體軀干斜向一側，腹部因收縮向內凹陷，1分；后肢伸展，后爪背屈，軀干伸展伴盆骨方向旋轉，2分；腹部肌肉收縮，后肢后伸，3分。

1.5.2 HE染色

觀察大鼠扭體反應后，腹腔注射2%戊巴比妥鈉（3 mL/100 g）麻醉大鼠，摘除子宮組織，用無菌手術剪將大鼠左右兩側子宮剪成6等份，每組隨機選取5只大鼠相同位置子宮組織，放入4%多聚甲醛溶液中固定，其余子宮組織標號凍存。子宮組織經固定24 h后進行脫水、二甲苯透明、包埋、切片（5 μm），脫蠟后HE染色，鼠李膠封片固定。光學顯微鏡下觀察子宮組織病理變化，并對其進行評分。評分標準[19]：無明顯病理變化，0分；內膜出現壞死，1分；固有層水腫，2分；固有層腺體增多，3分；固有層炎癥細胞浸潤，4分；子宮肌層炎癥，5分。

1.5.3 ELISA檢測

取大鼠子宮組織，加入緩沖液，勻漿，3 000 r/min離心20 min（離心半徑15 cm），取上清液，根據ELISA試劑盒說明書檢測PGF2α和PGE2含量。

1.5.4 Western blot檢測

每組隨機選取6 只大鼠相同位置子宮組織（約50 mg）剪成小塊，研磨機低溫研磨，加入預冷裂解液和蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min離心10 min（離心半徑63 mm），取上清液，BCA法蛋白定量，加入樣品緩沖液，沸水浴10 min。上樣后電泳，PVDF 膜轉膜、封閉后，加一抗孵育：GAPDH一抗（1∶2 000）、ERK1/2一抗（1∶1 000）、p-ERK1/2一抗（1∶1 000）、COX-2一抗（1∶1 000），4 ℃孵育過夜。TBST洗膜，加二抗（1∶5 000），室溫孵育60 min，ECL法顯色曝光。以GAPDH為內參，計算目的蛋白相對表達量。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 電針對模型大鼠扭體潛伏期、扭體次數及扭體評分的影響

空白組無扭體反應。與空白組比較，模型組大鼠扭體次數、扭體評分增加（P＜0.01）；與模型組比較，電針組和布洛芬組大鼠扭體潛伏期延長（P＜0.01），扭體次數、扭體評分減少（P＜0.05，P＜0.01）。見表1。

表1 各組大鼠扭體反應比較（±s）

表1 各組大鼠扭體反應比較（±s）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別空白組模型組電針組布洛芬組扭體評分0 2.90±0.32**1.70±0.83#1.30±0.68##只數10 10 10 10扭體潛伏期/s 0 150.80± 21.18**457.80± 93.02##430.50±116.81##扭體次數0 42.80±10.70**11.60± 6.11#6.80± 4.94##

2.2 電針對模型大鼠子宮組織病理形態的影響

空白組大鼠子宮內膜上皮細胞排列完整，無明顯空泡水腫等病理變化；模型組大鼠子宮內膜上皮細胞大量空泡樣變性、壞死，且有中性粒細胞浸潤、子宮內膜剝脫水腫及炎癥，伴小動脈充血；電針組和布洛芬組大鼠子宮內膜上皮細胞較少空泡樣變性、壞死，內膜剝脫范圍較小，水腫、炎癥程度減輕。見圖1。與空白組比較，模型組大鼠子宮組織病理評分顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，電針組和布洛芬組大鼠子宮組織病理評分顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。見表2。

圖1 各組大鼠子宮組織形態（HE染色，×100）

表2 各組大鼠子宮組織病理評分比較（±s，分）

表2 各組大鼠子宮組織病理評分比較（±s，分）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

病理評分0.80±0.45 3.80±0.84**1.60±0.55#1.40±0.55##組別空白組模型組電針組布洛芬組只數5555

2.3 電針對模型大鼠子宮組織前列腺素F2α 和前列腺素E2含量的影響

與空白組比較，模型組大鼠子宮組織PGF2α含量顯著增加，PGE2含量顯著減少（P＜0.01）；與模型組比較，電針組和布洛芬組大鼠子宮組織PGF2α含量顯著減少，PGE2含量顯著增加（P＜0.01）。見表3。

表3 各組大鼠子宮組織PGF2α、PGE2含量比較（±s，pg/mg）

表3 各組大鼠子宮組織PGF2α、PGE2含量比較（±s，pg/mg）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01

PGE2 368.263±25.123 251.399±12.972**353.092±51.616##348.866±24.911##組別空白組模型組電針組布洛芬組只數5555 PGF2α 100.699± 5.761 221.095± 7.053**124.843± 6.761##121.555±12.408##

2.4 電針對模型大鼠子宮組織ERK、p-ERK、環氧化酶-2蛋白表達的影響

與空白組比較，模型組大鼠子宮組織ERK1/2、p-ERK1/2、COX-2 蛋白表達顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，電針組和布洛芬組大鼠子宮組織ERK1/2、p-ERK1/2、COX-2蛋白表達顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。見圖2、表4。

圖2 各組大鼠子宮組織ERK1/2、p-ERK1/2、COX-2蛋白免疫印跡

表4 各組大鼠子宮組織ERK1/2、p-ERK1/2、COX-2蛋白表達比較（±s）

表4 各組大鼠子宮組織ERK1/2、p-ERK1/2、COX-2蛋白表達比較（±s）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

COX-2 0.233±0.013 0.819±0.068**0.571±0.028##0.414±0.078##組別空白組模型組電針組布洛芬組只數6666 ERK1/2 0.277±0.036 0.715±0.061**0.429±0.072#0.465±0.080#p-ERK1/2 0.248±0.046 0.594±0.109**0.367±0.051#0.362±0.058#

3 討論

中醫學認為，PDM主要病機為氣血虧虛，失于濡養經絡臟器而引起疼痛。三陰交為足三陰脾、肝、腎經經氣交匯之處，針刺此穴既可補益脾、腎、肝三經氣血，又可通暢三經氣血，使氣血充養胞宮。關元位于臍下小腹部，為調理沖任二脈氣血之要穴，具有溫通濡養胞脈作用。兩穴配伍為遠近配穴，近端取關元可調節子宮局部經氣，體現腧穴的近治作用，遠端取三陰交起整體調節作用，體現腧穴的遠治作用，可溝通機體上下經氣，改善整體氣血。因而兩穴相伍可起到調沖任、理氣血、通經止痛的效果[20]。課題組前期分析針刺治療PDM的腧穴配伍規律，結果表明關元、三陰交出現頻次最高[21]。因此，本研究觀察結果顯示，模型組大鼠扭體次數、扭體評分顯著增加，出現扭體潛伏期，說明PDM造模成功；電針組和布洛芬組大鼠扭體次數、扭體評分顯著降低，扭體潛伏期顯著延長，表明疼痛癥狀明顯減輕。

有學者認為，PGs分泌異常可導致子宮收縮、缺血、炎癥及疼痛[2]。研究表明，PGF2α的異常釋放作用于相應受體，導致平滑肌痙攣收縮、組織缺氧缺血、子宮內膜脫落，引起出血及疼痛，而PGE2能抑制子宮平滑肌收縮[22-23]。本實驗結果顯示，模型組大鼠子宮組織PGF2α含量顯著增加、PGE2含量顯著減少，電針組和布洛芬組PGF2α含量顯著減少、PGE2含量顯著增加，表明電針可能通過增加子宮組織PGE2含量、降低PGE2 含量緩解子宮強烈痙攣收縮，從而達到止痛效果。

COX-2 是參與PGs 合成的重要限速酶，月經前COX-2表達升高，可催化花生四烯酸轉化為活性PGs，導致痙攣性疼痛。目前治療PDM的臨床藥物如布洛芬，通過特異性抑制COX-2，降低PGs合成，減輕疼痛[24]。ERK 是細胞外調節蛋白激酶，包括ERK1 和ERK2，控制和調節細胞增殖、分化、凋亡等重要生理活動。研究表明，MAPK/ERK通路參與COX-2表達的調節，可通過抑制MEK1/2 和ERK1/2 磷酸化，降低COX-2表達[8]。本研究結果顯示，模型組大鼠子宮組織ERK1/2、p-ERK1/2 及COX-2 蛋白表達明顯升高，表明PDM的機制之一可能是激活MAPK蛋白啟動信號傳導通路，激活ERK1/2磷酸化，上調COX-2蛋白表達，增加PGs釋放，從而引發痛經。進一步說明ERK/COX-2信號通路參與PDM的病理生理過程。經電針和布洛芬干預后，ERK/COX-2信號通路相關蛋白表達降低，且電針組與布洛芬組差異無統計學意義，表明電針與布洛芬療效相當，提示電針可能通過抑制ERK/COX-2信號通路相關因子，減少PGs釋放，從而治療PDM。

綜上所述，電針“三陰交”“關元”可緩解PDM大鼠疼痛癥狀，改善子宮病理損傷，其機制可能與抑制ERK/COX-2信號通路，降低PGs水平有關。今后將進一步從ERK信號通路上游進行研究，明確電針治療PDM的作用機制。