基于UPLC特征圖譜和一測多評法的穿心蓮藥材質(zhì)量研究

李振雨，趙書運，劉曉霞，何民友，馮涌微，位翠杰，張芳平，鄧淙友，陳向東，孫冬梅

廣東一方制藥有限公司，廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點實驗室，廣東 佛山 528244

穿心蓮為爵床科植物穿心蓮Andrographis paniculata（Burm.f.）Nees.的干燥地上部位[1]，是常用的清熱解毒中藥。其代表性有效成分為二萜內(nèi)酯，除可抗病原微生物、治療感染性疾病外，還具有保肝、利膽、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫、治療心腦血管系統(tǒng)疾病的作用[2-5]。此外，穿心蓮含有較多的黃酮和酚酸類成分[6-8]，均在其藥效中發(fā)揮重要作用[9]。目前，對穿心蓮指紋圖譜的研究報道多集中于對二萜內(nèi)酯類成分的表征方面[10-12]，而對穿心蓮中黃酮和酚酸類成分的指認和表征報道較少。指紋/特征圖譜結(jié)合一測多評模式將定性、定量相結(jié)合，能夠發(fā)揮中藥多指標(biāo)質(zhì)量控制的優(yōu)勢[13]，尤其是超高效液相色譜法（UPLC）的使用，可提高化學(xué)成分的分析效能，縮短分析周期[14]。本研究采用UPLC建立穿心蓮藥材特征圖譜，利用高分辨質(zhì)譜對圖譜中的主要色譜峰進行質(zhì)譜分析，結(jié)合一測多評法（QAMS）定量模式，為穿心蓮藥材的整體質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試藥

Themo Vanquish 超高效液相色譜儀、Thermo Vanquish Flex超高效液相-Thermo Fisher QE高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀，賽默飛世爾科技有限公司；JJ600型百分之一天平，常熟市雙杰測試儀器廠；ME204E型萬分之一天平、XP26型百萬分之一天平，梅特勒-托利多公司；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

對照品綠原酸（批號110753-201706，含量99.3%）、穿心蓮內(nèi)酯（批號110797-201609，含量99.7%）、脫水穿心蓮內(nèi)酯（批號110854-201710，含量99.4%），中國食品藥品檢定研究院；對照品14-去氧穿心蓮內(nèi)酯（批號wkq19012203，含量98%）、新穿心蓮內(nèi)酯（批號wkq18120308，含量98%）、木犀草素-7-Oβ-D-葡萄糖醛酸（批號wkq20211875，含量≥98%）、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷（批號wkq20021905，含量≥98%），四川省維克奇生物科技有限公司。乙腈（色譜純），默克股份有限公司；甲醇（分析純），西隴科學(xué)股份有限公司；磷酸（色譜純），天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。12批穿心蓮藥材由廣東一方制藥有限公司采購管理部采收，經(jīng)廣東一方制藥有限公司魏梅主任中藥師鑒定為爵床科植物穿心蓮Andrographis paniculata（Burm.f.）Nees.的干燥地上部分，來源信息見表1。

表1 穿心蓮藥材樣品來源信息

2 方法與結(jié)果

2.1 特征圖譜建立

2.1.1 液相色譜和質(zhì)譜條件

色譜條件：采用ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動相A為乙腈、B為0.075%磷酸水溶液，高分辨質(zhì)譜分析時流動相B 為0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫（0～7 min，8%→19%A；7～16 min，19%→28%A；16～28 min，28%→50%A）；流速0.3 mL/min；柱溫25 ℃；檢測波長205 nm；進樣量1 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源，噴霧電壓3.80 kV，正、負離子掃描模式，掃描范圍100～1 500 m/z；鞘氣流速35 Arb；輔助氣流速10 Arb；毛細管溫度350 ℃；輔助器加熱溫度350 ℃；碰撞能量在負離子模式下為40 EV，正離子模式下為60 EV；S-lens電壓50 V。

2.1.2 對照品溶液制備

精密稱取對照品穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯、新穿心蓮內(nèi)酯和14-去氧穿心蓮內(nèi)酯適量，加甲醇制成每1 mL 含穿心蓮內(nèi)酯169.370 μg、脫水穿心蓮內(nèi)酯120.274 μg、新穿心蓮內(nèi)酯106.428 μg、14-去氧穿心蓮內(nèi)酯88.514 μg的混合溶液，搖勻，即得。

2.1.3 供試品溶液制備

取穿心蓮藥材粉末（過4號篩）約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入40%甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用40%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 特征圖譜方法學(xué)考察

2.1.4.1 精密度試驗

取穿心蓮藥材（編號S3）供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件重復(fù)進樣6次，記錄特征圖譜，以穿心蓮內(nèi)酯峰為參照峰S，計算各共有特征峰與S峰的相對保留時間RSD 為0.01%～0.25%，相對峰面積RSD 為0.06%～0.87%，表明該方法精密度良好。

2.1.4.2 重復(fù)性試驗

取穿心蓮藥材粉末（編號S3，過4號篩）約0.5 g，平行6份，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液6份，按“2.1.1”項下色譜條件進樣分析，記錄6份樣品特征圖譜，以穿心蓮內(nèi)酯峰為參照峰S，計算各共有特征峰與S峰的相對保留時間RSD為0.03%～0.12%，相對峰面積RSD為0.24%～2.72%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.4.3 穩(wěn)定性試驗

取“2.1.4.2”項下供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件，分別于0、2、4、8、10、12、24 h進樣分析，記錄不同時間點樣品特征圖譜，以穿心蓮內(nèi)酯峰為參照峰S，計算各共有特征峰與S峰的相對保留時間RSD 為0.04%～0.17%，相對峰面積RSD 為0.35%～2.65%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.5 特征圖譜

按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件，對12批穿心蓮藥材進行特征圖譜測定，記錄色譜圖，利用Chromeleon7.3軟件導(dǎo)出特征圖譜CDF格式，并導(dǎo)入國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012.130723版），以S1樣品特征圖譜為參照圖譜，時間窗寬度設(shè)定為0.1 min，進行多點校正和色譜峰匹配，選擇分離度較好、純度較高且成分已知的共有峰作為穿心蓮藥材特征圖譜的特征峰。12批穿心蓮藥材特征圖譜共標(biāo)出12個特征峰，樣品疊加圖見圖1。采用中位數(shù)法自動生成穿心蓮藥材對照特征圖譜，見圖2。

圖1 12批穿心蓮藥材特征圖譜疊加圖

圖2 穿心蓮藥材對照特征圖譜

2.1.6 相似度評價

分別計算12批穿心蓮藥材特征圖譜與對照特征圖譜的相似度，結(jié)果見表2。12批樣品相似度為0.905～0.995，均大于0.9，整體相似度較高，表明特征圖譜能夠用于穿心蓮藥材的鑒別和質(zhì)量表征。

表2 12批穿心蓮藥材特征圖譜相似度評價

2.1.7 共有峰指認與確認

通過質(zhì)譜精確分子量、碎片離子對比分析，對穿心蓮藥材特征圖譜12個特征峰進行指認。按“2.1.1”項下液相色譜和質(zhì)譜條件，采集正、負離子掃描模式下總離子流（TIC）圖，見圖3。結(jié)果顯示，正離子模式下，穿心蓮中的二萜內(nèi)酯類成分信息更完整，考慮到負離子模式下酚酸、黃酮類成分的裂解模式更明確，因此，選擇正、負離子同時掃描分析，保證未知成分得到最大限度的指認。通過目標(biāo)成分精確分子量、二級碎片信息、裂解模式分析，并結(jié)合mzCloud標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫的成分比對，指認出其中7個特征性成分（見表3）。經(jīng)與對照品保留時間及紫外吸收光譜比對，進一步確認峰2為綠原酸，峰4為木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷，峰6為芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷，峰8為穿心蓮內(nèi)酯，峰10為新穿心蓮內(nèi)酯，峰11為14-去氧穿心蓮內(nèi)酯，峰12為脫水穿心蓮內(nèi)酯，結(jié)果見圖4。

圖3 穿心蓮藥材TIC圖

圖4 穿心蓮藥材特征圖譜共有峰確認

表3 穿心蓮藥材特征圖譜共有峰質(zhì)譜指認

2.2 一測多評法建立

2.2.1 精密度試驗

精密吸取“2.1.2”項下混合對照品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件重復(fù)進樣6次，記錄穿心蓮內(nèi)酯、新穿心蓮內(nèi)酯、14-去氧穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的色譜峰面積，并計算峰面積RSD 分別為0.38%、0.40%、0.37%和0.37%，表明儀器精密度良好。

2.2.2 線性關(guān)系考察

精密稱定對照品穿心蓮內(nèi)酯20.169 mg、新穿心蓮內(nèi)酯13.884 mg、14-去氧穿心蓮內(nèi)酯5.446 mg、脫水穿心蓮內(nèi)酯22.635 mg，置25 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，即得混合對照品貯備液。精密量取上述對照品貯備液1.0 mL，分別置2、5、10、25、50 mL 量瓶中，加甲醇制成系列濃度的混合對照品工作液；分別取上述混合對照品貯備液和混合對照品工作液，按“2.1.1”項下色譜條件依次進樣1 μL，記錄色譜峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，對照品濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程和相關(guān)系數(shù)（r），結(jié)果見表4。各成分在相應(yīng)范圍內(nèi)峰面積與對照品濃度線性關(guān)系良好。

表4 4個成分線性關(guān)系考察結(jié)果

2.2.3 重復(fù)性試驗

取穿心蓮藥材粉末（編號S3，過4號篩）約0.5 g，精密稱定，平行稱定6份，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液6份，每份精密吸取1 μL，按“2.1.1”項下色譜條件進樣分析，外標(biāo)法計算穿心蓮內(nèi)酯、新穿心蓮內(nèi)酯、14-去氧穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量分別為11.248、9.415、2.950、8.648 mg/g，RSD分別為0.21%、0.57%、0.72%、0.63%。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗

取穿心蓮藥材粉末（編號S1，過4號篩）約0.5 g，精密稱定，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件，分別于0、2、4、8、10、12、24 h進樣，記錄穿心蓮內(nèi)酯、14-去氧穿心蓮內(nèi)酯、新穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的峰面積，并計算峰面積RSD為0.17%～1.02%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.5 加樣回收率試驗

取對照品穿心蓮內(nèi)酯14.105 mg、新穿心蓮內(nèi)酯12.065 mg、14-去氧穿心蓮內(nèi)酯3.780 mg、脫水穿心蓮內(nèi)酯10.885 mg，置于10 mL 量瓶中，加甲醇制成每1 mL含穿心蓮內(nèi)酯1.406 mg、新穿心蓮內(nèi)酯1.182 mg、14-去氧穿心蓮內(nèi)酯0.370 mg、脫水穿心蓮內(nèi)酯1.082 mg的混合對照品溶液。精密吸取上述混合對照品溶液1.0、2.0、3.0 mL于具塞錐形瓶中，分為3組，每組平行3份，共9份，揮干溶劑，再取已知含量的穿心蓮藥材粉末（編號S3，過4號篩）約0.25 g，精密稱定，置上述9個錐形瓶中，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液9份，按“2.1.1”項下色譜條件測定，計算穿心蓮內(nèi)酯、新穿心蓮內(nèi)酯、14-去氧穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯的平均加樣回收率分別為99.06%、101.17%、100.20%、101.13%，RSD 分別為2.62%、1.35%、1.22%、1.24%，結(jié)果見表5。

表5 穿心蓮中4個成分加樣回收率試驗結(jié)果

2.2.6 相對校正因子計算

以穿心蓮內(nèi)酯為參照，根據(jù)“2.2.2”項下線性關(guān)系考察結(jié)果，以對照品濃度及其對應(yīng)的色譜峰面積，分別計算新穿心蓮內(nèi)酯、14-去氧穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的相對校正因子（f）。f參照/待測=（C待測×A參照）÷（C參照×A待測）。式中，C為對照品濃度，A為對照品峰面積。結(jié)果新穿心蓮內(nèi)酯、14-去氧穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯的平均相對校正因子分別為1.07、0.81、0.61，見表6。

表6 穿心蓮中3個成分相對校正因子計算結(jié)果

2.2.7 系統(tǒng)適用性試驗

2.2.7.1 不同色譜柱考察

以穿心蓮內(nèi)酯為參照，計算新穿心蓮內(nèi)酯、14-去氧穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯在不同品牌色譜柱上的相對保留時間和相對校正因子，結(jié)果見表7。上述3個成分的相對保留時間RSD為1.39%～2.72%，相對校正因子RSD為0.93%～2.49%，表明不同品牌色譜柱對新穿心蓮內(nèi)酯、14-去氧穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的相對保留時間和相對校正因子影響較小。

表7 不同色譜柱的穿心蓮中3個成分相對保留時間和相對校正因子測定結(jié)果

2.2.7.2 不同流速考察

以穿心蓮內(nèi)酯為參照，計算新穿心蓮內(nèi)酯、14-去氧穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯在不同流速下的相對保留時間和相對校正因子，結(jié)果見表8。上述3個成分的相對保留時間為1.04%～1.47%，相對校正因子RSD為0.93%～2.52%，表明不同流速對新穿心蓮內(nèi)酯、14-去氧穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的相對保留時間和相對校正因子影響較小。

表8 不同流速的穿心蓮中3個成分相對保留時間和相對校正因子測定結(jié)果

2.2.7.3 不同柱溫考察

以穿心蓮內(nèi)酯為參照，計算新穿心蓮內(nèi)酯、14-去氧穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯在不同柱溫下的相對保留時間和相對校正因子，結(jié)果見表9。上述3個成分的相對保留時間為0.39%～0.74%，相對校正因子RSD為1.41%～1.92%，表明不同柱溫對新穿心蓮內(nèi)酯、14-去氧穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的相對保留時間和相對校正因子影響較小。

表9 不同柱溫的穿心蓮中3個成分相對保留時間和相對校正因子測定結(jié)果

2.2.7.4 不同儀器考察

以穿心蓮內(nèi)酯為參照，計算新穿心蓮內(nèi)酯、14-去氧穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯在不同品牌儀器上的相對保留時間和相對校正因子，結(jié)果見表10。上述3個成分的相對保留時間為0.48%～0.97%，相對校正因子RSD 為1.31%～2.67%，表明不同儀器對新穿心蓮內(nèi)酯、14-去氧穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的相對保留時間和相對校正因子影響較小。

表10 不同儀器的相對保留時間和相對校正因子測定結(jié)果

2.2.8 色譜峰定位

取“2.2.7”項下不同色譜柱、不同流速、不同柱溫和不同色譜儀的相對保留時間均值，確定新穿心蓮內(nèi)酯、14-去氧穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的相對保留時間為1.37、1.46和1.48。

2.2.9 樣品測定

取12批穿心蓮藥材，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件測定，以穿心蓮內(nèi)酯為參照，分別采用外標(biāo)法（ESM）和QAMS計算其余3個二萜內(nèi)酯成分含量，并比較2種方法的相對偏差，結(jié)果見表11。上述2種方法測得3個二萜內(nèi)酯成分含量的相對偏差均在5.0%范圍內(nèi)，表明QAMS測定結(jié)果與ESM無明顯差異，準(zhǔn)確性良好。采用QAMS含量數(shù)據(jù)計算12批穿心蓮藥材4個二萜內(nèi)酯成分總量，結(jié)果顯示，不同產(chǎn)地穿心蓮藥材4個二萜內(nèi)酯成分含量無明顯差異。

表11 12批穿心蓮藥材4個成分ESM與QAMS結(jié)果（mg/g）

3 討論

指紋圖譜與特征圖譜均是常用的中藥整體質(zhì)量控制模式。指紋圖譜側(cè)重于將化學(xué)成分盡可能多地展現(xiàn)在圖譜上，通過對各色譜峰進行積分，利用相似度軟件計算，從而對不同批次樣品進行一致性評價。指紋圖譜將共有峰和非共有峰均納入計算，主要強調(diào)圖譜的相似性和一致性，評價方式具有一定的模糊性，對單個色譜峰的關(guān)注度不高，圖譜的整體性受儀器、色譜柱及圖譜積分參數(shù)影響較大，因此，在中藥的諸多法定標(biāo)準(zhǔn)中使用受限，僅在中藥注射劑評價中使用較多[15]。而特征圖譜側(cè)重于在前期物質(zhì)基礎(chǔ)研究較明確的情況下，有目的地針對中藥的主要有效成分進行表征，強調(diào)圖譜的整體專屬性與藥效的相關(guān)性，關(guān)注共有峰的特征性、特征峰的分離度，以及方法在不同色譜儀、色譜柱中的重現(xiàn)性，利用共有特征峰的相似度評價，采用相對保留時間定位、相對峰面積半定量分析等手段，從而評價中藥的質(zhì)量。

穿心蓮藥材主要有效成分為二萜內(nèi)酯、黃酮和酚酸類，因此，特征圖譜的建立主要為表征上述成分，并兼顧QAMS對二萜內(nèi)酯色譜峰分離度的要求，為縮短分析時間，采用UPLC。此外，本研究考察了不同色譜儀及不同品牌和粒徑色譜柱對方法重現(xiàn)性的影響，結(jié)果顯示，該方法在一些粒徑為1.6～2.2 μm的不同品牌色譜柱上重現(xiàn)性良好。

根據(jù)產(chǎn)地調(diào)研，目前穿心蓮主要產(chǎn)區(qū)在廣東、廣西和福建，以栽培為主，野生資源較少。本研究對穿心蓮藥材二萜內(nèi)酯成分含量測定結(jié)果顯示，不同產(chǎn)地藥材質(zhì)量差異不大。廣西產(chǎn)區(qū)藥材資源豐富、產(chǎn)量較大，因此，可選擇廣西為穿心蓮藥材的固定產(chǎn)地。

2020年版《中華人民共和國藥典》規(guī)定穿心蓮藥材于秋初莖葉茂盛時采收。研究顯示，不同生長期穿心蓮藥材中穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量在8、9月較高，因此，建議穿心蓮藥材的最佳采收期為8－9月[16]。陳兩綿等[17]研究顯示，穿心蓮生長過程可分為6期，從枝葉茂盛期到花蕾期4個二萜內(nèi)酯成分總量最高且比較穩(wěn)定，為最佳采收期，采收時間也在8月。我們研究穿心蓮不同產(chǎn)地加工方式對藥材質(zhì)量的影響時發(fā)現(xiàn)，其產(chǎn)地加工分為曬干和陰干，陰干樣品中穿心蓮內(nèi)酯含量較低，脫水穿心蓮內(nèi)酯和新穿心蓮內(nèi)酯含量較高，提示陰干過程可能導(dǎo)致穿心蓮內(nèi)酯分解和轉(zhuǎn)化，而曬干樣品4個成分總量較高，因此，在天氣條件允許的情況下，產(chǎn)地加工宜盡量采用曬干法進行干燥。此外，考察不同烘干方式處理藥材對4個二萜內(nèi)酯成分含量的影響，結(jié)果顯示，烘干溫度對穿心蓮二萜內(nèi)酯含量影響較大，當(dāng)烘干溫度達到80 ℃、時間超過3 h，二萜內(nèi)酯含量逐漸降低，采用低溫干燥的方式有助于保存穿心蓮有效成分。以上研究表明不同采收期和產(chǎn)地加工方式對穿心蓮藥材質(zhì)量影響較大，建議嚴格控制藥材的采收時間和產(chǎn)地加工方式，從而保證藥材質(zhì)量。