基于網絡藥理學探討升白方防治化療后白細胞減少作用機制*

楊 洋 艾 群 胡旭陽 石露露 胡 欣△

人類醫療水平及疾病防控認知盡管已有了極大提升,但惡性腫瘤依舊是世界范圍內高發病率和高病死率的重要因素。長期以來,化療在惡性腫瘤西醫的治療中發揮著核心作用[1]。但化療在提高癌癥患者生存期的同時,帶來的不良反應對患者的生理、心理都存在著短暫或長久的影響。其中,由于骨髓對化療高度敏感,骨髓抑制也就成了化療中一個不可忽視的問題。化療后骨髓抑制以白細胞減少最為明顯和常見,可導致化療藥物減量、化療延遲甚至終止,最終影響化療效果和預后;也可能增加患者感染的風險,而并發感染會導致額外醫療,甚至造成患者死亡。

rhG-CSF類藥物的治療效果較好,但因其使用受限于醫保政策,并且藥價較昂貴,很大程度上限制了臨床應用[2]。該藥物維持時間短,并且在化療過程中,可能導致患者發生發熱或骨骼疼痛等不良反應,甚至使骨髓抑制程度加重[3]。面對這些問題,中醫藥作為中國的特色治療手段,在防治化療后白細胞減少方面被證實確臨床療效顯著且穩定[4]。胡欣主任倡導零毒抗腫瘤,個體化治療的理念,在減少腫瘤治療的不良反應,充分發揮中醫藥抗腫瘤優勢。從而以健脾益腎,補氣養血為理論基礎,自擬升白經驗方:黃芪30 g,黨參15 g,茯苓15 g,知母15 g,骨碎補30 g,補骨脂30 g。具有旺生血之源、直補氣血的作用,能較好地升高人體白細胞。但該方的藥效機制尚不明確,因此借助網絡藥理學[5], 通過多分子藥物協同作用于人體的機制,系統綜合地觀察升白方防治化療后白細胞減少這一疾病網絡的作用靶點及通路,為臨床應用及日后的基礎研究奠定了一定的理論來源。

1 資料與方法

1.1 篩選活性成分和預測靶點選用TCMSP平臺[6],分別以黃芪、茯苓、黨參、知母、骨碎補、補骨脂為關鍵詞進行檢索以獲取相關化合物信息,篩選條件為OB≥30%、DL≥0.18[7]。并依據已報道的文獻,整理出各味中藥未檢索到的有效成分進行補充。通過Uniprot數據庫并利用VLOOKUP函數,將篩選出的靶點轉換為對應的基因名。

1.2 構建活性成分-靶點網絡依據六味中藥及篩選出的相關活性成分和靶點,制作相應的“Network”及“Type”Excel文件,并依次錄入Cytoscape 3.7.0軟件[8]進行網絡的構建,以便于研究活性成分與靶點及其之間的關系。

1.3 白細胞減少癥靶點檢索Genecards疾病基因數據庫[9]中以“Neutropenia”“Leukopenia”“Leucopenia”“Leukocytopenia”為檢索關鍵詞進行篩選,將各結果匯總后刪去重復靶點,并通過Uniprot對獲取的靶點進行標準化轉換。

1.4 蛋白質-蛋白質互作網絡(PPI)構建及核心靶點獲取在Cytoscape 3.7.0的插件BisoGenet內,先后導入升白方活性成分靶點和白細胞減少癥靶點,共生成2個PPI網絡,通過提取生成1個交集網絡,對該網絡進行CytoNCA[10]分析,篩選計算所得到的結果后得到核心靶點。

1.5 通路富集分析將篩選得到的核心靶點輸入Metascape平臺[11],分別采取GO及KEGG分析,在保存對應結果后,通過Bioinformatics在線網站對結果進行可視化分析。

1.6 分子對接操作選擇升白方中活性成分排名的前3個與核心靶點進行分子對接實驗,驗證2者間的結合潛力。在RCSB[12]數據庫中保存靶點蛋白的三維晶體并在TCMSP中下載活性成分化學結構,運用Autodock[13]進行分子對接實驗操作。其中的對接分數<-4.25 kcal/mol被認為化合物與目標靶點間有結合活性;<-5.0 kcal/mol表明2者相互作用良好;<-7.0 kcal/mol表示結合活性強烈[14]。

2 結果

2.1 獲取升白方活性成分及靶點在TCMSP數據庫中,獲取升白方89個主要活性成分、207個相應靶點;根據查詢到的文獻對補骨脂進行補充,獲得18個有效成分,174個靶點。將方中六味中藥合并后,刪除重復以及未找到對應靶點的成分,共篩選得到有效成分70個。匯總靶點并剔除重復項,共獲得278個。

2.2 構建活性成分-靶點網絡進行升白方活性成分及其對應靶點的關系網絡繪制,并對所得的網絡圖形加以說明,存在節點356個和關系1314條,Degree排名前3位有效成分分別是山奈酚、槲皮素和木犀草素。見圖1。

圖1 活性成分-靶點網絡圖

2.3 疾病靶點檢索檢索Genecards疾病數據庫,經篩選、去除重復值后得到疾病相關靶點589個。分別將藥物與疾病靶點上傳至Excel表格,利用“開始”菜單中的“格式條件”選項獲取2列靶點的重復值,從而獲知藥物與疾病交集靶點為49個。

2.4 PPI構建及核心靶點獲取采用Cytoscape軟件分別構建藥物與疾病的PPI網絡,對其構建的結果加以說明:7363個靶點可與升白方中潛在靶點產生間接或直接作用,可達175250種相互關系;有7830個靶點可與白細胞減少癥產生間接或者直接的作用,可達185467種相互聯系。隨后構建二者PPI網絡的交集,并計算交集PPI網絡拓撲學屬性值,分別以“連接度中心性>66”“連接度中心性>136、介度中心性>555.328、緊密度中心性>0.501”為條件,進行2次篩選,共獲得209個核心靶點。

2.5 通路富集分析可視化將上述209個核心靶點錄入Metascape平臺,進行基因富集分析,選擇前20條結果進行可視化處理。使用Bioinformatics在線網站將生物過程(BP)、細胞組成(CC)、分子功能(MF)的結果以及KEGG通路的結果繪制成圖。見圖2、圖3。

2.6 分子對接將排名前3的潛在有效成分分別與5個核心靶點MCM2、TP53、CUL3、FN1、ESR1進行對接,得到15組配體與受體互作結果(見圖4)。研究顯示對接分數均小于4.25 kcal·mol,這表明升白方的化合物與目標靶點間均具有結合活性。其中FN1-木犀草素、TP53-木犀草素、TP53-山奈酚對接分值小于7.0 kcal·mol,提示其具有強烈結合能力。分子對接結果為升白方活性成分通過調節核心靶點以防治化療后白細胞減少提供了證據,也為今后臨床用藥指導及進一步實驗驗證的設計提供了數據支持。

圖2 GO富集分析通路

圖3 KEGG富集分析通路

3 討論

化療藥物屬于大毒之品,其剛猛的藥性不僅會耗傷體內氣血,還會擾亂陰陽平衡[15]造成五臟功能失調。依據化療后所表現的癥狀,屬中醫學“血虛、虛勞”等病證范疇。“脾為百骸之母,腎為性命之根”,在虛勞的治療中脾、腎尤為重要,因此防治化療后白細胞減少也當以調理脾、腎為先。升白方可補氣養血、健脾益腎,使受化療藥物所抑制的骨髓精血復生。借助網絡藥理學的方法,探討其發揮升白作用的潛在機制,并運用分子對接驗證核心靶點與活性成分的作用關系,發現具有良好的活性結合能力,也側面驗證了預測結果有一定可靠性。

排名第一的有效成分是山奈酚,存在于骨碎補、知母和黃芪中。該成分具有多種藥理活性,包括抗腫瘤、抗癌活性、抗炎、抗氧化等,目前正被應用于癌癥化療中[16]。該成分既可以誘導細胞凋亡,使細胞周期停滯在G2/M期,從而阻止細胞遷移和侵襲,又可以激活宿主的免疫功能,抑制腫瘤血管生長,增加其他抗癌藥物的敏感性[16,17]。槲皮素可以通過調節PI3K/AKT途徑來調控依賴EPO的紅細胞發育早期階段。故推測槲皮素在造血過程中發揮了作用,如白細胞的形成[18]。木犀草素在雌激素受體拮抗劑ICI182,780和ER陰性的人乳腺癌細胞株MDA-MB-453存在的情況下,可以減輕阿霉素誘導的細胞毒性[19]。間接對白細胞減少起到了防治的作用。

經篩選獲得209個潛在核心靶點,其中較為重要的有MCM2、TP53、CUL3、FN1、ESR1。MCM2具有促凋亡作用。MDS骨髓中MCM2比例較高,且與白細胞減少程度相關[20]。TP53是細胞應激反應和造血干細胞穩態的中樞調節因子[21]。而50%的癌癥病例攜帶P53突變,另一半通常存在P53途徑缺陷[22],因此通過激活P53阻斷IL-1途徑,可成功地緩解化療導致的中性粒細胞減少癥[23]。FN是細胞外基質中重要的黏附分子,參與造血細胞的分化和增殖[24]。ESR1是雌激素的受體之一,參與了造血、骨骼以及免疫系統的表達[25]。研究表示,ESR1可調節先天免疫信號通路和免疫細胞的發育[26]。綜上所述,升白方通過多靶點對化療后白細胞減少起到防治作用。

升白方防治化療后白細胞減少涉及調節細胞對應激的反應、細胞周期過程的調節、調節蛋白質分解代謝過程等多個生物進程。例如 mTORC1整合了細胞內和細胞外主要的信號通路,其中包括細胞應激反應。這種信號整合可以很好地調控合成代謝、分解代謝過程,調節細胞生長和體內平衡[27]。但在癌癥中mTORC1介導的信號傳導常常發生失調[28]。由此可推測,升白方通過對細胞應激反應的調節有可能通過糾正信號傳導,從而促進化療后白細胞的修復和生成。

從KEGG的結果得知,升白方可能通過干預病毒致癌、癌癥中的微核糖核酸、細胞周期、剪接體、HIF-1信號通路等。升白方可能通過干預病毒致癌通路受益于癌細胞的衰老,輔助抗癌,對化療起到減毒增效的作用。剪接體對前體mRNA成熟和基因表達至關重要[29]。在造血干細胞形成過程中,精心控制的RNA剪接決定了細胞的命運[30]。剪接體的成分耗盡與DNA損傷和細胞周期缺陷的增加有關,而核心剪接體成分的部分消耗導致細胞周期后期階段的缺陷(G2和有絲分裂),完全耗盡則會導致G1的早期細胞周期停滯[31]。因此,細胞周期停滯可由于剪接體和細胞周期通路的破壞所致。細胞周期涉及許多生命過程,與真核細胞的生長和增殖以及疾病的發生密切相關[32]。故推斷可能通過干預上述2條通路,升白方對白細胞中的前體mRNA起到了調控作用。成骨細胞是骨骼造血微環境的重要組成部分,HIF信號通路對造血干細胞(HSC)的維持至關重要,有研究證明了成骨細胞中HIF信號通路傳導的分子作用可以靶向地升高局部造血微環境中的HSC[33]。因此,升白方能通過干預HIF信號通路恢復HSC的功能增加白細胞數量。

綜上所述,升白方主要通過70個活性成分作用于209個核心靶點,涉及147條關鍵通路來發揮作用,印證了升白方根據多靶點、多通路防治化療后白細胞減少的特征。后續將著力設計完善的實驗,進一步驗證其具體作用機制及靶點。